AFLATOKSİJENİK ÖZELLİĞİNİN MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE DEĞERLENDİRİLMESİ ORGANİK HAYVAN YEMLERİNDEN İZOLE EDİLEN Aspergillus flavus İZOLATLARININ POTANSİYEL AFLATOKSİJENİK ÖZELLİĞİNİN MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE DEĞERLENDİRİLMESİ Canan ÜNAL1, Alev HALİKİ UZTAN1, Onur Akpınar1, Ülfet ERDAL 2 1 Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir 2 Uluslararası Tarımsal Araştırma ve Eğitim Merkezi, Menemen, İzmir Giriş Bulgular ve Tartışma Organik hayvan yeminde kaliteyi etkileyen en önemli faktör mikotoksin ve küf sorunudur. Organik yemlerin kontaminasyonunu engellemek için tek yol mikotoksin varlığını önlemektir. Organik ürünlerin herhangi bir kimyasal muameleye tabi tutulmaması gerektiği için, bu ürünlerde küf oluşu problemi ve mikotoksin varlığı daha hassastır. Avrupa’da yapılan araştırmalar, besin zinciri boyunca mikotoksinlerin oluşumunu zemin hazırlayan koşulların daha fazla anlaşılmasına ve gerekirse, tespit edilip engellenmelerini sağlamaya ve ürünlerdeki mikotoksin varlığının seçilir kılınmasına yönelik olarak yapılmaktadır. organik hayvan yetiştiriciliğinde kaliteli, zengin içerikli, küf ve mikotoksin içermeyen, maliyeti düşük yem üretimi temin edilerek entegrasyonu sağlanacaktır. Uygun münavebe sistemi ile organik kurallar çerçevesinde optimum yem verimini sağlamak hedeflenmiştir. Hayvanlardan yüksek miktar ve nitelikte ürün alımında kullanılan yemin mikrobiyolojik ve mikotoksikolojik yapısı büyük önem taşımaktadır. Yemin hijyenik kalitesinin önemi sadece hayvanlar için değil, hayvanlardan elde edilen ürünleri tüketen insanlar için de geçerlidir. Son yıllarda sağlıklı ve kaliteli ürünlerin tüketilmesine yönelik tüketicinin bilinçlenmesi, gıda güvenliğini önemli hale getirmiştir. Ayrıca bu konunun uluslararası ticari boyutu da bulunmaktadır (Basmacıoğlu ve Ergül, 2003). Mikotoksinler içinde en toksik oldugu bilinen aflatoksindir ve A.flavus ve A.parasiticus türü küfler tarafından üretilmektedir. Ancak son yıllarda yapılan araştırmalarda A.flavus’a benzer özellik gösteren Aspergillus nomius’un da aflatoksin ürettiği belirtilmektedir (Anonymous, 2010b). Aflatoksinler genellikle akut, subakut veya kronik aflatoksikozise neden olurlar. .Aflatoksin biyosentezinde görevli genlerden (Yu, Pern-Kuang ve ark., 2004) araştırmamızda aFIR, norsolonic asit (nor) , o-metiltransferaz (omt) genlerinin varlığına bakılmıştır. Bu genler üzerinde çalışmamızın nedeni; aFIR geni, aflatoksin biyosentezinde transkripsiyonu aktif eden, pozitif regülatör gen olarak bilinmektedir. Bu fonksiyonel regülatör proteinin varlığı, Aspergillus flavus un aflatoksin üretme potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. Çalıştığımız diğer iki gen Varga ve ark., (2011) ve diğer çalışmalarda en çok kullanılan aflatoksin biyosentez genleri olduğu için tercih edilmiştir. Aflatoksin biyosentez genleri tarama çalışmaları ise Erami ve ark., (2007) çalışmalarındaki polimeraz zincir reaksiyonu koşulları uygulanmıştır. 17 Aspergillus flavus türü içinde aFIR bölgesinin, omt bölgesinin ve nor bölgesinin sekans analizleri sonucunda A.flavus TEM 3, A.flavus TEM 6 ve A.flavus TEM 8 izolatlarının aFIR, nor, omt genlerine sahip olduğu bulunmuştur.   Şekil 1: DTO261 E4 numaralı tip tür ve 17 A. flavus izolatının b-tubulin PCR ve calmodulin PCR jel görüntüsü Materyal ve Metod Şekil 2: DTO261 E4 numaralı izolatın ITS1-5,8S-ITS2 PCR, b-tubulin PCR ve calmodulin PCR jel görüntüsü Şekil 3: 3, 6 ve 8 Aspergillus flavus izolatlarının norsolanik asit PCR jel görüntüsü UTAEM ‘in Menemen Ovasında yer alan Orta köy deneme arazisinde, 3 parselde, 4 tekerrürlü olmak üzere 2 sistem şeklinde kurulan denememizin, 14m2 (2,8m X 5m) olan her bir parselinden, ekim öncesi toplamda 24 toprak örneği ve 8 adet fiğ/yulaf, 8 adet fiğ/tritikale, 8 adet üçgül, 4 adet pamuk ve 4 adet soya olmak üzere yem hammaddelerinden her hasatta yem örnekleri alınmıştır. 0-20 cm derinliklerden alınan toprak örneklerinden ve hasat edilen yem hammaddelerinden kültürde büyüyebilen toplam küf sayımı ve potansiyel mikotoksijenik küflerin izolasyonu için seyreltme plaka yöntemi uygulanmıştır. Hasat öncesi toprak örneklerinde ve hasat sonrası ürünlerde, mikobiyota toplam sayımı ve potansiyel aflatoksijenik Aspergillus türlerinin CYA, MEA, CZ, CY20S besiyerlerinde morfolojik ve mikroskobik yöntemlerle fenotipik olarak tanılanması tamamlanmıştır. İzole edilen ve öncelikle fenotipik olarak tanılanan 182 Aspergillus izolatının 17 tanesi potansiyel aflatoksijen üreticisi Aspergillus flavus türü olarak saptanmıştır. Fenotipik tanılamaları yapılan Aspergillus flavus izolatlarından ITS1–5,8S–ITS2, calmodulin, β-tubulin, o-metil transferaz, norsolonic asit, aFIR PCR tiplendirilmesinde kullanılmak üzere genomik DNA izolasyonu Liu et al. (2000) tarafından tanımlanan metot temel alınıp modifiye edilerek gerçekleştirilmiştir. Elde edilen genomik DNA -20 oC’ de muhafaza edilmiştir. Genomik DNA bütünlüğü ve saflığı açısından agaroz jel elektroforezi kullanılarak değerlendirilmiştir. İzolatlardan elde edilen genomik DNA’ların, saflık kontrolleri ve miktar tayinleri Thermo NanoDrop cihazı ile yapılmıştır. Toprak ve yem örneklerinden tanılanan tüm Aspergillus türlerinden potansiyel aflatoksinojenik olan 17 adet Aspergillus flavus türü için; tür tanılaması için ITS1–5,8S–ITS2, β-tubulin, calmodulin, aflatoksin üreticisi olma potansiyellerinin saptanması için ise de aFIR, norsolonic asit, o metil transferaz genlerinin varlığına bakılmıştır. Şekil 4: 3, 6 ve 8 Aspergillus flavus izolatlarının o metil transferaz PCR jel görüntüsü Şekil 5: 3, 6 ve 8 Aspergillus flavus izolatlarının aFIR PCR jel görüntüsü Şekil 6. ITS1–5,8S–ITS2 bölgesinin sekans analizi sonucunda elde edilen tanılama sonuçlarına göre Tamura-Nei neighbor joining metodu kullanılarak oluşturulmuş 17 A. flavus straini, arasındaki filogenetik uzaklığı gösteren filogenetik ağaç. Şekil 7. Calmodulin bölgesinin sekans analizi sonucunda elde edilen tanılama sonuçlarına göre Tamura-Nei neighbor joining metodu kullanılarak oluşturulmuş 17 A. flavus straini, arasındaki filogenetik uzaklığı gösteren filogenetik ağaç. Şekil 8. β-tubulin bölgesinin sekans analizi sonucunda elde edilen tanılama sonuçlarına göre Tamura-Nei neighbor joining metodu kullanılarak oluşturulmuş 17 A. flavus straini, arasındaki filogenetik uzaklığı gösteren filogenetik ağaç. Sonuç Ege bölgesi koşullarında farklı münavebe sistemlerinde yetiştirilen ve depolanan organik hayvan yemlerindeki aflatoksin oluşum potansiyeli ile toksijenik küf gelişimi açısından yem örneklerinin yüzde nem içeriklerinin, yıllık yağış ortalamasının, sıcaklık ve nisbi nem ortalamalarının olumsuz bir sonuç oluşturmadığı görülmüştür. Farklı münavebe sistemleri uygulandığı halde organizmalarda fungal izolat farklılıkları gözlenmemiştir. Bu durumun sebebi; parsellerin birbirine yakın olması dolayısıyla fungal sporların taşınmasıdır. Yığın içerisindeki yemlerde ise, aflatoksin üretim potansiyeline sahip Aspergillus flavus türlerinin varlığı, depolama esnasında tarla yüzeyinde ve ot balyalarında toksijenik küflerin gelişimi olabilmektedir. Aflatoksijenik olmayan diğer küfler yönünden değerlendirildiğinde; depolama süresince bunların gelişmelerine devam ettiği görülmektedir. Bunlar toksijenik karakterde olmasa bile yemin çürümesine, kalitesinin düşmesine ve çeşitli besleme hastalıkları gibi olumsuzluklara neden olabilmektedir. Bu nedenle yemlerin hasat edilme aşamasında yemlerin iyice kurutulması, mikroorganizma kontaminasyona maruz kalabilecek şartların giderilmesi ve yemlerin içerisine yağış sularının sızmayacağı uygun depo ortamlarında depolanması küflenmeyi büyük ölçüde güvence altına alacaktır. Bu çalışma; Uluslararası Tarımsal Araştırma ve Eğitim Merkezi (UTAEM) tarafından, P-05 Yem Bitkilerinde Organik Tarım adlı programda olup, Ege Bölgesi Koşullarında Organik Hayvan Yemi Üretimine Yönelik Münavebe Sistemlerinin Karşılaştırılması adlı proje kapsamında olup, TAGEM VE BÜGEM tarafından desteklenmiştir.