KROMOTOGRAFİ, ELEKTROFOREZ, SPEKTRAL YÖNTEMLER, RADYOİZOTOPLAR, İMMÜNOLOJİK YÖNTEMLER, NÜKLEİK ASİT HİBRİDİZASYONU, ELEKTRON MİKROSKOBİSİ

Kromatografi Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda, tercihen kullanılan bir ayırma yöntemidir. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi yönteminin kullanımı ile başarılı sonuçlar elde edilmektedir. Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir karışımdaki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir faz üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı hızlarla hareket edebilmeleridir.

Hareketli faz Durağan faz moleküller

Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. • Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur. • Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. • Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" olguları temel etkileşim türlerini oluştururlar. Şayet basit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)" etkileşimi gerçekleşir.

Bu durumda farklı polaritelere (kutuplaşmalara) sahip maddelerin, farklı derecelerde yüzey tutunması göstermeleri doğaldır. Buna bağlı olarak, hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "adsorpsiyon kromatografisi" genel adı ile anılırlar.

Şayet sabit faz bir "sıvı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "çözünme" etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı maddelerin, sabit ve hareketli fazlarda farklı çözünürlüklere sahip olmaları söz konusudur. Yani farklı maddelerin iki faz arasındaki dağılımları ön plana geçmektedir.

Buna bağlı olarak hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "dağılım kromatografisi" genel adı ile anılırlar.

Çeşitli kromatografik yöntemler vardır Çeşitli kromatografik yöntemler vardır. Bunlardan bazıları; Kolon kromatografisi, İnce tabaka kromatografisi (ITK), Kağıt kromatografisi, Gaz kromatografisi, İyon değişimi kromatografisi, Jel geçirgenlik kromatografisi, Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, İlgi kromatografisidir.

Bunlardan en çok kullanılanları sıralayacak olursak; • Kolon kromatografisi • İnce tabaka kromatografisi (ITK) • Kâğıt kromatografisi • Gaz kromatografisi

•Kolon kromatografisi:biyomoleküllerin depo (tampon) sabit faz (katı porlu matriks) mobil faz elüent Protein karışımı •Kolon kromatografisi:biyomoleküllerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır •Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur  SABİT FAZ •biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir •Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan kolon tarafından, adsorbe edilmeyenler  önce adsorbe edilenler  daha geç kolondan çıkarlar

Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır: • Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur. • Alumina: Genellikle nötür ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur. • Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur. Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil eter, Karbon tetraklorür(kansorojen), n-Butanol İzopropanol olabilir.

•Jel filtrasyonu  büyüklük Kolon Kromatografi Tipleri Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır: •Jel filtrasyonu  büyüklük •İyon exchange  yük •Affinite  (bağlanma)

Jel Filtrasyon Kromatografi Biyomoleküllerin, molekül büyüklüğüne göre ayrılırlar •Kolon, jel boncuklar [polisakkarid veya poliakrilamid polimer] ile doldurulur katı matriks •Biyomolekül karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir Küçük moleküller,jel boncuklar arasındaki boşluklara girer, kolondan geç çıkarlar Büyük moleküller, jel boncuklar arasındaki boşluklara takılmaz, kolondan önce çıkarlar jel boncuklar cam kolon akış

Jel Filtrasyon Kromatografi Proteinlerin elüsyonu: en büyük en küçük

Jel Filtrasyon Kromatografi jel boncuk en büyük protein Biyomeleküllerin, matriksteki porlara takılma yüzdesi, büyüklüğü ile ters orantılıdır Porlara takılan moleküller daha yavaş sürüklenirler Avantaj: Büyük miktarda biyomolekül karışımı saflaştırılabilir Dezavantaj: Yavaş ayırım

İyon exchange (değiş-tokuş) Kromatografi Proteinleri, üzerlerinde taşıdıkları net yüke göre ayırır. • Biyomolekül karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki aynı yüklü iyonlarla[ (+)(+) veya (-) (-) ile] yer değiştirerek, kolona bağlanırlar •Bağlanmayan proteinler, kolondan en önce çıkarlar • Daha sonra, iyonik gücü/pH’sı farklı bir tampon kolondan geçirilir bağlı moleküllerin yükü değiştirilerek elüsyonu sağlanır

İyon-Exchange Kromatografi

Affinite Kromatografisi Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine, (dekstran, poliakrilamid, selüloz vb) spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır: Tampon akışı ligand-protein kompleksi Ligand bağlı boncuk spesifik protein Serbest proteinler diğer proteinler

Affinite Kromatografisi katı destek ligand spesifik protein selüloz sepharoz dekstran DNA IgG histon protein A + antibody antijen antijen antibody substrat enzim kosubstrat enzim Konkavalin A glikoprotein reseptor hormon

Affinite Kromatografisi Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir Örnek: glukoz-protein kompleksi boncuk serbest protein İlave glukoz(G)

2. İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ (İTK) İnce tabaka kromatografisi, bir "katı -sıvı adsorpsiyon kromatografisidir." Bu yöntemde sabit faz, çeşitli boyutlardaki "cam plakalar üstüne, ince bir tabaka halinde sıvanmış katı adsorban maddedir. "Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm katılar (alumina, siliko jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyişi, aşağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür.

Bu işlem sırasında, plakanın alt kesimlerine bir damlalıkla önceden damlatılmış olan karışımı da farklı hızlarla yukarıya sürükler. Ayırım bu şekilde sağlanmış olur. Yürüme hızı maddenin, katı fazın ve çözücünün polaritesine bağlıdır.

3.KâğıtKromatografisi Bu yöntemde kalın bir süzgeç kağıdı destek; ve gözeneklerine yerleşen su ise, sabit "sıvı fazı" oluşturur. Hareketli faz bir yürütücü tank içine yerleştirilmiş uygun bir sıvıdır. Bu durumda, kâğıt kromatografisinin bir "sıvı-sıvı dağılım kromatografisi" olduğunu belirtmeliyiz.

4. Gaz Kromatografisi Bu teknik laboratuarda basit aletlerle yürütülemez. Yöntemin uygulanmasında çok gelişmiş otomatik cihazlar gereklidir.

Bu yöntemde sabit faz, cihaz içine yerleştirilen ve içinde katı destek maddesi üzerinde emdirilmiş sıvı bulunan bir kolondur. Taşıyıcı faz ise, He veya N2 gibi bir gazdır. Buna göre gaz kromatografinin bir "gaz-sıvı dağılım kromatografisi" olduğunu belirtebiliriz.

ELEKTROFOREZ Sulu bir çözelti içinde, suspansiye ya da çözünmüş küçük elektrik yüklü parçacıkların, uygulanan bir elektrik alanın etkisi ile göç etmesi sürecine, elektroforez denir. Bu küçük parçacıklar bakteri hücreleri, virüsler, protein molekülleri veya sentetik parçacıklar olabilir. Doğal olarak bu parçacıkların çoğu elektrik yükü taşırlar

Elektroforez, genellikle poliakrilamid jel üzerinde yapılır. Ortam pH’sına göre, (+) ya da (-) olarak yüklenen taneciklerin, bir elektrik alanında, kendi net yüklerine zıt yük taşıyan anot veya katoda doğru farklı hızlarda sürüklenmeleridir. Elektroforez, genellikle poliakrilamid jel üzerinde yapılır.

POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (PAGE) En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir. Jel sentetik bir madde olan akrilamid ile akrilamid türevi olan N-N'-metilen bisakrilamidin polimerleşmesiyle oluşturulur ve örnekler bu jel içinde yürütülür. Proteinler için çok uygun olduğu gibi DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir.

Poliakrilamid Jel Elektroforezi(PAGE) plastik kasa anot katot tampon jel protein karışımı

Gel electrophoresis is a technique for separating charged molecules with different sizes.  Two kinds of gels are commonly used: agarose and polyacrylamide.  Agarose gels can be applied to a wider range of sizes than polyacrylamide gels.  By using standard agarose electrophoresis, nuclei acids up to 50 kb may be separated.  If Pulsed Field Gel Electrophoresis is used, the upper limit can be extended to 10 Mb.  Polyacrylamide gels may separate nucleic acids that differ in length by only 1 nucleotide if their length is less than 500 bp

SDS PAGE ( denatüre edici page) SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri biribirinden ayırır. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda '(-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.

SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü, molekül ağırlıklarının saptanması amacıyla kullanılmaktadır.

SDS - PAGE SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre, birbirinden ayrılırlar SDS’in bağlanmasıyla , doğal yapısını kaybeden proteinler, aynı şekil ve yük/kütle oranına sahip olurlar  elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi sadece molekül ağırlıklarına bağlıdır Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir ve proteinlerin alt üniteleri birbirinden ayrılır

SDS-PAGE ÖRNEKLERİ

Molekül Ağırlığı Tayini Standart nümune Sürüklenme hızı Molekül ağ.(log) nümune protein

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ Agaroz, deniz yosunlarından elde edilen, dallanmamış zincirli bir polimerdir. Moleküllerin büyüklüklerine göre ayrılabilme özellikleri, jel elektroforezinin pek çok amaç için kullanımına olanak sağlamıştır. Nükleik asit fragmentlerinin tanımlanması, saflaştırılması ve ayrılması için kullanılan en yaygın yöntem agaroz jel elektroforezidir.

Bu nedenle çeşitli amaçlar için izole edilen DNA ve RNA'ların tanımlanabilmesi, temizliğinin kontrolü, hangi formda olduğunun belirlenebilmesi, büyüklüğünün saptanabilmesi ve özellikle genetik mühendisliği teknikleri ile DNA yapısında oluşturulan değişikliklerden sonra elde edilen yeni formların incelenmesi yönünden, agaroz jel elektroforez tekniği, moleküler genetik alanında önemli bir deneysel sistem oluşturmaktadır.

SPEKTROFOTOMETRE Optik tekniğe dayalı olarak çalışan aletlerden moleküler biyolojide en fazla kullanılanı spektrofotometredir. Bu alet seçilmiş dalga boylarında ışık oluşturur, ışığı (bir küvet içine konulmuş ve genellikle bir çözücü içersinde bulunan) örneğin içersinden geçirir ve örnekten geçen ışığın şiddetini ölçer.

Her bir ışın dalgalar halinde yayılan ve belli enerjiye sahip fotondur Her bir ışın dalgalar halinde yayılan ve belli enerjiye sahip fotondur. İki dalganın en yüksek noktaları arasındaki mesafe dalga boyu olarak adlandırılır. Dalga boyu uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir. Genel olarak Angstrom tabiri kullanılmakla birlikte spektrofotometrik ölçümlerde daha çok nanometre, mikrometre, veya milimikron tabirleri kullanılır. 10AO=1 nM=1 milimikron.

UV ışık bölgesindeki ölçümler için 200-340 nm dalgaboyları arasında radyasyon oluşturan yüksek basınçlı hidrojen veya dötaryum lambası, görünür ışık bölgesi için 340-800 nm dalgaboyları arasında ışık veren tungsten halojen lamba kullanılır. Bu lambaların standart bir ışık çıktısı vermesi gerekir.

Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre adlandırılır. 200-340 nm : Ultraviyole 340-800 nm : Görünür 800-2000 nm: İnfrared

Örnekten geçen ışığın miktarı moleküller tarafından emilen ışığın miktarına bağlıdır. Bu yoğunluk ışığa duyarlı bir algılayıcı (detektör) tarafından ölçülür.

Ölçüm yaparken maksimum hassasiyet sağlamak için aranan madde tarafından maksimum absorbe edilen dalga boyundaki ışık kullanılır. Bunun için o maddenin 1 molar çözeltisinin çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. En yüksek dalga boyunun elde edildiği dalga boyu o maddenin en iyi ölçüm yapılan dalga boyu olarak kullanılır.

Radyoizotopların Kullanımı Moleküler biyolojide radyoaktif izotopların çeşitli kullanım alanları vardır. Nükleik asit ve proteinlerle ilgili araştırmalarda yararlanılan birçok modern yöntem radyoizotopların uygulanmasına dayanır.

Radyoizotoplarla işaretlenmiş makromolekül öncülerinin kullanılması kompleks bir karışım içindeki özel ve çok az miktarda bulunan bir molekülün, hücre içinde birçok kimyasal olayın basit ve duyarlı şekilde izlenmesine olanak verir.

The Meselson Stahl Experiment:  What is the mode of DNA replication?

Key to Meselson-Stahl experiment DNA containing "heavy nitrogen" (15N) can be distinguished form DNA containing "light nitrogen" (14N) by CsCl density-gradient centrifugation.

İmmünolojik Yöntemler İmmunolojik yöntemler proteinlerin saflaştırılmasında olduğu kadar, nükleik asitlerin ve proteinlerin tanımlanmasında da önem taşırlar. Antikorlar, antijen özgüllükleri nedeniyle, makromoleküllerin belirlenmesi ve yerlerinin tayininde duyarlıdırlar.

Antikorlar fluoresan boyalarla işaretlenerek, spesifik moleküllerin hücredeki yerleşiminin fluoresans mikroskopla saptanmasında kullanılabilirler. Bu moleküller, aynı zamanda hücre özütlerindeki molekülleri tanımlamakta, miktar tayinlerini yapmakta ve poliakrilamid jel elektroforeziyle fraksiyonlara ayrılan özel proteinleri belirlemekte kullanılırlar.

ELEKTRO- İMMUN DİFÜZYON Elektrikli ortamda  Antijenler elektriksel alanda ayrılırlar (elektroforez)  Elektroforez için değişik matriksler;  Kağıt  Sellüloz asetat  Agar  Poliakrilamid kullanılır  İmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğine İMMUNELEKTROFOREZ denir

ELISA Yöntemi “ELISA plate” antikor ile kaplanır. Antijen miktarı belirlenecek olan örnek kuyulara yüklenir. Antijen ile antikorun bağlanması beklenir. Bağlanmamış veya özgün olmayan proteinler yıkama ile uzaklaştırılır. Enzim bağlı ikincil antikorlar eklenir ve bunlarda antijen-antikor yapısına bağlanır (sandviç yapısı). Enzimle etkileşecek substrat eklenerek oluşan ışıma ile protein miktarı spektrofotometrik olarak ölçülür.

IV-WESTERN- BLOT antijenler Sodyum dodesilsulfat yardımıyla (SDS) POLİACRYLAMİD JEL zemininde, molekül ağırlıklarına göre elektroforetik olarak ayrılır. Polipeptit antijenler, ikinci bir elektroforez ile NİTROSELÜLOZ MEMRAN ŞERİTLER ÜZERİNE transfer edilir. Hasta serumu ile şerit üzerindeki antijenler özel bir testte temas ettirilir (elektroforetik yöntem) Hasta serumunda aranılan antikorlar varsa, şerit üzerindeki antijen bulunan BANDLARDA RENK KOYULUĞU (KOYU-ZAYIF-RENKSİZ) oluşur. Kitin internal Pozitif ve Negatif kontrollerindeki band renkleri değerlendirmede önemlidir. Ve band için, HANGİ ANTİJEN VARSA REAKTİF kabul edilir. Şeritlerin üzerindeki bandların pozitifliğine göre o hasta için, etkenin sonuç virulansı patternlerine göre POZİTİF-NEGATİF VEYA SAPTANMAYAN sonuç verilir.

Elektron Mikroskopisi Saf olarak elde edilmiş makromoleküllerin elektron mikroskobunda çekilen fotoğrafından molekülün yapısı hakkında bilgi edinmek mümkündür.

X-Işını Kristalografisi (proteinlerin üç boyutlu yapısını araştırmada kullanılır) X-ışınlarının dalga boyları küçük olduğundan moleküllerdeki atomlar arası boşlukları araştırmada kullanılabilir. Bir solüsyon içinde hazırlanan kristaller aynı maddenin düzenli tekrarıyla oluşurlar. Kristallere gönderilen X-ışını kırınımlarının filme yansımasıyla pek çok molekülün yapısı tayin edilebilir. Filme yansıyan noktaların şekli kristal içindeki molekül yapısını gösterir.