Sinaptik Vezikül Endositozu Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/ Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi

Aksiyon potansiyeli, akson ucuna her ulaştığında «readily releasable vesicle pool» da Akson membranına tutunma Membran füzyonu Ekzositoz ile NT salınması

Aksonal butonlardaki plazma membranı genişler Her uyarımda membran füzyonu nedeniyle Aksonal butonlardaki plazma membranı genişler Sinaptik vezikül kaynakları tükenir Akson uçları, bu membran yapılarının yakalanması ve yeniden kullanılabilmesi için bir takım endositik mekanizmalar geliştirmiştir.

Yapısal olarak sinaps şeklinin korunması amacıyla membran dengesinin sağlanması gereklidir Sinaptik vezikül dengesinin sağlanabilmesi için ekzositozla eş zamanlı olarak endositoz süreci de aktive edilir Aksiyon potansiyeli akson ucuna ulaştığında sadece ekzositozu tetiklemekle kalmaz Aynı anda endositozu da tetikler

Endositozla hücre içerisine alınan plazma membranı ve diğer proteinler yeniden sinaptik vezikül oluşturulmasında kaynak olarak kullanılır.

ENDOSİTOZ YOLAKLARI

Aksonal uçlarda istirahat halinde bile ekzo- ve endositoz olayları gerçekleşir. Aksonal uçlarda büyük yapısal değişiklikler gözlenmez Ancak sinaptik uyarım söz konusu olduğunda bu uyarımın şiddetine bağlı olarak geri döndürülebilen büyük morfolojik ve yapısal değişiklikler meydana gelir

Bu koşullar altında meydana gelen endositik ara ürünler EM’da gözlenebilir Ancak gözlenen yapılara dayanarak endositoz sürecinde meydana gelen olayları basit bir modele oturtmak hiç kolay değildir.

Elektrofizyolojik: Membran kapasitansı Görüntüleme: Dinamik floresan görüntüleme Endosiztozun çok sayıda mekanizma ile meydana gelebileceğini düşündürmektedir Ancak bu tekniklerle elde edilen veriler ile EM verileri arasında ilişki kurmak oldukça zordur.

Endozitoz ile ilgili olarak yapılan çalışmaların çoğu non-nöronal hücrelerde gerçekleştirilmiş çalışmalardır. Nöronda bunu yapmak zor: Akson uçları son derece küçük

Nöronlarda endositoz yolakları Klatrin-aracılı endositoz Sinaptik vezikül proteinlerinin hücre içerisine alınmasında son derece önemlidir Sinaptik veziküller, doğrudan içeri alınan klatrin kaplı bu veziküllerin klatrin kılıfından arındırılması ile oluşturulur

Akson uçlarında endositoz mutlaka klatrin-aracılı olmak zorunda değil Caenorhabditis elegans Çok kuvvetli bir uyarıya cevaben meydana gelen ekzositik patlamayı takiben «bulk endozitoz» meydana gelmektedir.

KLATRİN-ARACILI ENDOSİTOZ

Sinaptik veziküllerin geridönüşümünde Klatrin-aracılı endositozun önemini destekleyen kanıtlar Ekzositozun indüklenmesinden hemen sonra geçici olarak klatrin kılıflı endozitik yapıların gözlenmesi Katrin-aracılı endozitozun deneysel olarak inhibisyonu sonucu sinaptik vezikül geridönüşümünün bloke olması Sinaptik vezikül geridönüşümünün belli aşamalarda engellenmesi ile büyük klatrin kılıflı yapıların oluşması Klatrin kılıflı veziküller içerisinde esas kargo molekülleri olarak sinaptik vezikül proteinlerinin bulunması Klatrin kılıflı veziküllerin en fazla beyin dokusundan elde edilebilmesi

KLATRİN KILIFLAR ve SİNAPTİK VEZİKÜLLERİN OLUŞTURULMASI Presinaptik klatrin kılıflı veziküllerin kaderi: Kılıftan arındırılma ve erken endozomlarla füzyon

Alternatif model: Klatrin kılıflı veziküller doğrudan sinaptik veziküllere dönüştürülebilir

Destek 1 Kılıf aracılı tomurcuklanma, en doğru moleküler komposizyona sahip vezikül oluşturulması için genel bir mekanizmadır Çünkü kılıf oluşumu, sadece vezikülün etrafını sarmakla kalmayıp aynı zamanda bir moleküler tasnifleyici olarak iş görmektedir

Destek 2 Endositik klatrin kılıfın yapısal bileşenleri, yardımcı diğer moleküller ile birlikte akson uçlarında en yoğun olarak bulunan kılıf proteinleridir Bu nedenle sinaptik vezikül oluşumunda son derece önemli oldukları aşikardır

Destek 3 Bu model sinaptik vezikül geridönüşüm sırasında iki ayrı tomurcuklanma basamağına ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır Plazma membranından klatrin-aracılı tomurcuklanma Enzomdan tomurcuklanma Sürecin hızlı işlemesi açısından son derece önemlidir

Destek 4 Klatrin kaplı çukurcuklar belirgin bir biçimde küçük ve homojen büyüklüğe sahiptir Büyüklükleri sinaptik veziküllere benzer

Klatrin Kılıflı Çukurcuk ve Veziküllerin Oluşumu Klatrin kılıflı çukurcukların nükleasyonu klatrin- adaptör proteinleri ve/veya bir grup yardımcı (accessory) faktörün fosfolipid bilayer’la etkileşmesi ile başlar Adaptörlerin birbirleriyle, diğer yardımcı faktörlerle, kargo proteinleriyle ve klatrinle etkileşmesi klatrin kılıflı çukurcuğun hızla büyümesine neden olur. Böylece ince bir boyun bölgesi ile plazma membranından sitoplazmaya doğru uzanan büyük bir tomurcuk oluşmuş olur Tomurcuğun vezikülden ayrılması ile serbest bir klatrin kılıflı bir vezikül meydana gelir Bu vezikül hemen klatrin kılıfından arındırılır

Tüm bu süreç endositozun gözlendiği hücrelerde temel olarak aynı olmakla birlikte, nöronların akson uçlarında bu sürecin özgün özellikleri bulunmaktadır. Kargonun spesifikliği İşlemin hızı

Sinaptik veziküllerin son derece kritik ve hata götürmeyen fonksiyonları nedeni ile yeni oluşan vezikülün gerekli olan tüm membran proteinlerini uygun stokiyometride içermesine olanak sağlayacak mekanizmaların varlığına ihtiyaç duyulmaktadır Örneğin bazı membran proteinleri yaklaşık 10 kopya bulunurken bazıları ise sadece 1 kopya olarak bulunmaktadır. Tüm bu süreçlerin doğru işlediğinden emin olacak kontrol noktalarının bulunduğu düşünülmektedir.

Klatrin Kılıfın Merkez Bileşenleri Klatrin kılıf, hücredeki diğer kılıflara benzer biçimde iki tabakalı bir yapılanma göstermektedir. Adaptör proteinlerden oluşan iç tabaka Bunu dıştan çevreleyen klatrin tabaka

Klatrin Adaptörleri Tipik olarak membrana bağlanan bir merkezi modül ve buna bağlı esnek kollardan oluşur. Bu esnek kollar da ilave küçük katlanmış modüller ile sonlanır.

Plazma membranının hangi bölgesinin endositozla geri alınacağını membran üzerinde bulunan bazı hedef proteinler belirler Örn: Sinaptobrevin 2

Hedef proteinler Bu proteinler endositoz için hedefi belirten kısa özel aminoasit dizilerine sahiptirler. Bu dizilere «endositik motif» adı verilir. Endositik motif

Endositik Motifler Proteinin sitoplazmik domaininde bulunan ve adaptör proteinler tarafından tanınabilen özel dizilerdir. -NXXY- -YXXφ- Endositik motif

Adaptör Protein: AP2 4 altbirimden oluşur Herbir alt birim «adaptin» proteinleridir α-adaptin β-adaptin µ-adaptin σ-adaptin

Endositik motif AP-2’nin, endositozla alınacak hedef proteinlerin bulunduğu plazma membranına yönlendirilmesi Sinaptotagmin 1/2’nin C2B domaini aracılığı ile olur AP2’nin gövde domainin bir tarafı C2B ile diğer tarafı ise hedef proteinin endositik motifi ile etkileşime girer C2A C2B

AP2’nin plazma membranına bağlanması için aynı zamanda membran lipidleri ile etkileşim de gereklidir. PIP2 (Fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat)

PIP2 bağlanmayı kuvvetlendirir. PIP2 olmasa da AP2 bağlanabilir, ancak zayıftır

KLATRİN YAPISI Distal domain Bir ağır, bir hafif olmak üzere 2 polipeptid zincirinden oluşur Hafif zincir ağır zincirin proksimal domaini ile etkileşir Ağır zincir Hafif zincir Proksimal domain

TRİSKELE Sitoplazmada klatrin tek başına bulunmaz Triskele yapısında bulunur Triskele: Bir merkezden çıkan 3 bacak/çizgi şeklindeki sembol

AP-2’nin uzantıları ile etkileşerek membranla ilişkiye geçer

Klatrin kılıflı çukurcukların oluşması için hücre içerisinde herhangi bir sinyale ihtiyaç yok İlk aşamalar aksiyon potansiyeli olsa da olmasa da başlar Çukurcuğun iki yanında kalan membranların birleştirilmesi ve serbest bir vezikül oluşturulması için aksiyon potansiyeline ihtiyaç vardır.

Klatrin tek başına bu finali gerçekleştiremez Membranın iki tarafını birbirine yaklaştıracak gücü yoktur

İki ucun sıkıştırılması nasıl olur ve düzenlenir? α1 Ɣ α-2δ Readily releasable vesicle pool

Hücre içerisine giren Ca2+ diğer taraftan membranın iki kenarının birleştirilmesini tetikler. Bunu nasıl gerçekleştirir?

Ca2+ hücre içerisine girdiğinde bir taraftan Syt 1/2’ye bağlanırken, diğer taraftan da Kalmodulin (CaM) adı verilen başka bir proteine bağlanır

Kalmodulin(CaM) Bağlayıcı lob N-lobu C-lobu

Herbir lobda ikişer adet EF-hand motifi

Her bir lob 2 adet Ca2+ bağlar

Ca2+-CaM akson terminalinde farklı proteinlerle interaksyona girerek onları aktive eder Kalsinörin Enzim Serin/Treonin fosfataz

Kalsinörin Proteinlerin Serin/Treonin rezidülerine bağlı fosfat gruplarını kopartır

Dinamin Endositoz işlemini sonlandıran asıl proteindir. Enzim GTPaz GTP  GDP + Pi Enerji açığa çıkarır

Fosforile iken sitoplazmada serbest halde bulunur Kalsinörin tarafından defosforile edildiğinde, oluşan vezikülün boyun kısmında spiral şeklinde polimerize olmaya başlarlar

Oligomerizasyonla birlikte GTPaz aktivitesi daha da artar Açığa çıkan enerji ile oluşturduğu spiralde dönüşe ve sıkışmaya neden olur

Endofilin Bu arada «endofilin» adı verilen bir protein de sürece dahil olur Boyun kısmında bir halka oluşturarak, dinamin oligomerizasyona aracılık eder

Oluşan Endositik Veziklün Endozoma Dönüşmesi Oluşan endositik vezikül bu haliyle hiçbir işe yaramaz Klatrin klıfından kurtulması gerekir Endofilin, başka bir enzimi bulunduğu veziküllere yönlendirerek bu işte rol alır

Sinaptojanin Enzim Fosfataz Fosfalipid bilayerdaki PIP2’leri defosforile eder Fosfatidilinozitol-4-fosfat’a çevirir Bu olayla birlikte klatrin kılıf ortadan kalkar Bu süreçte HSP70 ve Auxilin’de önemli rol oynar

Oluşan Endositik Vezikülün Kaderi?

Sinapslarda ve Aksonal Büyüme Konilerinde Lokal Endozomal Sistemler Hücre membranı reseptörleri ve adezyon moleküllerinin Sayı Erişilebilirlik

Nöronlar büyük ve yapısal-fonksiyonel olarak özelleşmiş hücreler Uzak mesafelerde ve lokal olarak etki gösteren, büyüme faktörleri, nörotrofik faktörler ve elektriksel aktivite gibi hücre dışı uyaranlara duyarlı olan özelleşmiş endozomal sistemlere ihtiyaç duymaktadır

“Housekeeping” fonksiyon Çok sayıda reseptör sisteminin integrasyonu, nöral gelişme sırasında hücre davranışına yön verme açısından son derece kritik öneme sahip Hangi reseptör? Nerede? Ne zaman? Ne kadar? Sinyal iletimi üzerinde ne süre ile etkili?

Akson ve dendritlerin gelişip yönlerini belirlemeleri Endozomal Sistem Akson ve dendritlerin gelişip yönlerini belirlemeleri Nöronal sağ kalım için nörotrofik sinyalizasyon Sinaptik plastisite ve sinaptik iletim Uzun mesafeli, polarize protein trafiği

https://www.youtube.com/watch?v=-yMvYaj8t0I