Mikroorganizmaların Virulens Faktörleri Bakteriyel Toksinler

Bakteriyel toksinler, ekzotoksinler ve endotoksinler olarak 2 ana gruba ayrılırlar.

Ekzotoksinler, canlı mikroorganizmalar tarafından üretilirler ve mikroorganizmalar sıvı besi yerlerinde ürediklerinde ortama yüksek konsantrasyonda salınırlar. Hem gram negatif hem de gram pozitif bakterilerce üretilirler ve ısıya (60oC’nın üzerinde 30 dakikadan fazla uygulanan) duyarlılıklarına göre termostabil (ST) ve termolabil (LT) ekzotoksinler olarak ayrılırlar.

Moleküler ağırlıklarına bağlı olmakla birlikte güçlü antijenite gösterirler ve organizmada yüksek titrelerde antikor sentezine sebep olurlar. Antitoksin adı verilen bu antikorlar, toksinleri nötralize ederek etkirler. Ekzotoksinler çok toksik olup kısa sürede toksi-enfeksiyonlara ve ölüme sebep olurlar. Genellikle, konakçı dokularına spesifik olan reseptörlerinin bağlanmasıyla etkirler ve konakçıda genellikle yüksek ateşe sebebiyet vermeden etkirler. Sentezleri genellikle plazmid’ler tarafından kontrol edilir.

Endotoksinler ise, gram negatif bakterilerin hücre duvarında bulunurlar ve bakterilerin ölümü/lize olması sonucunda ortaya çıkarlar. Hücre duvarının lipopolisakkarit (LPS) kısmının lipid-A kısmı ile ilişkilidirler. Genellikle stabil bir yapıya sahip olduklarından ısı ile aktivitelerini kaybetmezler ve toksoid haline getirilemezler.

Zayıf immünojeniktirler, orta derecede toksik olduklarından ancak çok sayıda bakterinin ölmesi sonucunda organizmayı öldürebilirler. Tutunacakları spesifik reseptörlere ihtiyaçları yoktur. Konakçıda genellikle, interlöykin-1 (İL-1) ve diğer mediatörlerin salınmasıyla ortaya çıkan bir ateş (pirojenik etki)’e sebep olurlar. Endotoksinlerin sentezinden kromozomal genler sorumludur.

Bakteriyel enzimler Bakterilerin çoğu toksik olmayan ancak patojenik etkiye katkıda bulunarak enfeksiyon olayında önemli roller alan bir çok enzim sentezlerler. Bunların bir kısmı bakterilerin üremesinde, ortamdaki besinleri almasında etkili olduğu gibi konakçıda zararlara da sebebiyet verirler.

Bakteriyel enzimler 2 kısma ayrılır 1- Doku yıkımına sebep olanlar: Kollagenaz, koagülaz, hiyalorinidaz, fibrinolizin (streptolizin), hemolizinler ve lökosidinler. 2- IgA1 Proteazlar

Hemolizinler: Bakteriler antijenik özelliklerine göre birbirinden farklı yapıda olan alfa (tam hemoliz), beta (kısmi hemoliz), delta (tam hemoliz) ve epsilon (tam hemoliz) olarak isimlendirilen hemolitik toksinler (hemolizinler) üretirler.

Lökosidinler: Bakteri toksinlerinin bir kısmı (alfa, delta toksinler ve Panton-Valentin lökosidinleri) lökosidal etkiye sahiptirler. Koagülaz: Koagülaz enzimi sentezleyen bakteriler, girdikleri konakçıda kendilerini bir fibrin tabakası ile örterek konakçının savunma sisteminden korundukları gibi normal serumun bakterisidal etkilerini de önlediklerinden patojenitelerini arttırırlar. Stafilokokların yanısıra E.coli, B.subtilis, Ps.aeruginosa ve diğer bazı bakteri türleri koagülaz sentezleyebilir.

Hiyalüronidaz : Bu enzim konnektif dokunun mukoid bir koruma maddesi olan hiyaluronik asidi parçalayarak patojeniteye katkıda bulunur. Nükleazlar: DNAse ve RNAse enzimleri, konakçı dokularının ve aynı zamanda bakteri hücresinin DNA ve RNA'larını parçalama özelliğindedir. Fibrinolizin : Bu enzim, fibrinojenin fibrine dönüşmesine sebep olan plazma sisteminin bir aktivatörüdür. Lipazlar: Lipidleri hidrolize ederler. Lizozim: Bu enzim, bir çok bakterinin hücre duvarında bulunan peptidoglikanı hidrolize eder. Özellikle bakterinin otolitik enzimidir.

IgA1 Proteazlar: Bilindiği gibi IgA; IgA1 ve IgA2 olmak üzere iki formu olan bir Ig’dür. Lokal olarak mukozalarda bulunarak, lokal bağışıklıkta etkin görev alırlar. Bu proteaza sahip bakteriler (Neisseira meningitis, N.gonorrhoeae, Haemophiluslar, Streptokoklar, Bacteroidesler vs) IgA1’deki prolin-treonin veya prolin-serin aminoasit bağlarını kopararak yapının antikor özelliğini bozarlar. Böylece mukozalarda yapacakları enfeksiyonlarda lokal antikorların önemli ve etkili olan bir bölümünü saf dışı ederek patojeniteye önemli katkıda bulunurlar.

Antifagositik faktörler Bilindiği gibi bakteriler, fagositler tarafından fagosite edilerek ve fagozomlar içerisinde litik enzimlerle parçalanarak öldürülürler. Ancak bir çok bakteri fagosit/lökositlerin bu mikrobiosidal etkilerinden, hücre yüzeylerinde taşıdıkları bazı (kapsül vs) yapıları yardımıyla kurtulurlar. Bu durumda fagositoz, bakteriden ziyade fagositik hücrenin ölümü ile sonuçlanır.

Örneğin, stafilokokların hücre duvarında bulunan protein A, IgG’leri Fc reseptörlerinden bağlayarak, antikorların etkisini önlerler. Bazı streptokoklarda ve basillerde bulunan kapsül, bakterileri fagositozdan korur (örn., Bacillus anthracis). Bir kısım bakteriler de (Capnocytophaga ve Bordetella’lar) değişik mekanizmalarla etkiyen toksin benzeri maddeler sentezleyip, lökositlerin kemotaksislerini önleyerek etkirler. Meninjitis, septisemi, artritis vb enfeksiyonlara yol açan invaziv E.coli’lerin hemen hemen tümünde kapsüler antijen bulunmaktadır.

TARAMA ve TEŞHİS METOTLARININ ÖZELLİKLERİ Prevalans Sörveyleri Veteriner epidemiyolojide en yaygın olarak yapılan sörvey tipi hayvan serumunda (etkene karşı oluşan) antikorların varlığının ölçülmesiyle bazı enfeksiyöz etkenlerin sıklığı ve dağılımını belirlemek için yapılan prevalans sörveyidir. Böyle bir testin sonucu pozitif veya negatif olarak sınıflandırılır. Pozitif bir sonuç her zaman hayvanın söz konusu etken ile yeni enfekte olduğu anlamına gelmez.

Pozitif bir sonuç enfekte, inkübasyon döneminde veya iyileşmekte olan hayvan anlamına gelebilir. Pozitif bir sonuç aynı zamanda daha önce yapılan bir aşılama veya antikorların pasif transferini (örn: kolostrum yoluyla) gösterebilir, nadiren hayvan test ile araştırılan mikroorganizma ile antijenik olarak benzer diğer bir mikroorganizma ile daha önce enfekte olmuş olabilir ve bu durum testte bir kros reaksiyona neden olur.

Örnek olarak: Yersina enterocolitica serotip 9 ile Brucella abortus arasında, tüberkülozis için uygulanan deri testinde M. avium ile diğer mikobakteriler arasındaki kros reaksiyonlar gibi durumlar verilebilir. Bazen de non-spesifik aglutininler gibi antikorların etkisini taklit eden maddeler, laboratuvarda uygulama ve örnekleme prosedürü, örneğin muhafazası (kontaminasyonlar gibi) ile ilgili hatalar yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir.

Benzer şekilde, hayvan gerçekte enfekte olduğu halde test negatif olabilir. Hayvan yeni enfekte olmuş ve test yapıldığında antikor oluşması için yeterli süre geçmemiş olabilir (uygun olmayan zamanlama). Hayvanın fizyolojik durumu (doğum veya östrus ile ilişkili olarak antikor üretiminde variyasyonlar görülebilir), sürekli ilaç tedavisi (kortikoidler gibi) yanliş negatif test sonucuna neden olabilir.

Ayrıca test etkene karşı oluşan az miktardaki antikorları ölçebilecek sensitivitede veya tespit ettiği antikor türü bakımından enfeksiyonun teşhisi için uygun olmayabilir. Bazı antikorlar inkomple olur ve antijen/antikor reaksiyonu oluşturamaz, bazı bloke edici antikorlar ise antijen/antikor reaksiyonu oluşmasını önler. Ayrıca non-spesifik inhibitörler (serumdaki antikomplementer maddeler, klinik örneklerde PCR reaksiyonundaki enzim aktivitesini inhibe eden maddeler, doku kültürlerindeki için toksik substanslar vb.), pozitif testte olduğu gibi laboratuvar veya örnek işleme hataları da yanlış negatif sonuçlara neden olabilir.

Tarama (Screening) Testleri Tarama, basit testlerin uygulanmasıyla muhtemelen hasta olmayan hayvanlardan görünüşte sağlıklı fakat enfekte olabilen hayvanların ayırdedilmesiyle bilinmeyen hastalıkların (enfeksiyon veya subklinik hastalığın) tahmini tespitidir. Bu nedenle tarama testleri ister serolojik, ister diğer ( örn: metabolik profiller, fiziksel ölçümler vs.) bir hastalığı ortaya çıkarmak için görünüşte sağlıklı hayvanlara uygulanır.

Hastalığın sıklığını (miktarını) tespit etmek için yapılan prevalans sörveylerin aksine tarama (screening) haslalığın erken tespiti amacıyla yapılır. Evcil hayvanlardaki ekonomik kayıplardan büyük ölçüde gizli veya subklinik hastalıklar sorumludur. Örneğin subklinik mastitis hafif ve belirgin olmayan bir durumdur, ancak yüksek prevalansı nedeniyle süt sığırlarının verimliliği üzerine hastalığın sporadik fakat şiddetli klinik formlarından daha fazla etkiye sahiptir.

Ayrıca, enfeksiyöz ve non-enfeksiyöz hastalık etkenlerinin sıklığı ve dağılımı ile bu etkenlere karşı oluşan immun cevaplar hakkında edinilecek bilgi hastalık prosesini anlamamıza da büyük katkı sağlayabilir. Gerçekte subklinik hastalıkların sıklığı, dağılımı ve önemi klinik vakalarınkinden farklı olabilir.

Epidemiyolojik açıdan, eğer araştırmalar enfeksiyonların hastalığın yokluğunda nasıl görüldüğü veya devam ettiği konusunda yoğunlaşırsa hastalıkların önlenmesinde daha büyük başarı sağlanacaktır. Hastalık klinik olarak belirgin olmadığından, subklinik hastalığı ortaya koymak için özel testler (örn: Kaliforniya Mastitis Test) gereklidir.

Genel bir kural olarak tarama testleri çok sayıda hayvana uygulanır ve çoğunlukla pozitif bulunanlara bir diagnostik test uygulanır. Örn: B. abortus enfeksiyonu için sürü taramalarında süt ring test veya RBPT (rose bengal plate test) yaygın olarak kullanılan testlerdir, CFT ise bu testlerle pozitif bulunan örneklere uygulanan doğrulayıcı bir testtir. Tarama testleri yanlış pozitif sonuçlar verebilir, ancak doğrulayıcı testler vermezler.

Buna karşın her iki tip test de yanlış negatif sonuç verebilir Buna karşın her iki tip test de yanlış negatif sonuç verebilir. Tarama testi ‘yüksek risk grubu’ hayvanlara uygulandığında ‘vaka araştırması’ olarak düşünülür. Yüksek risk, hayvanların şüpheli olduğu veya toplam populasyonla karşılaştırıldığında daha yüksek hastalık prevalansına sahip olduğu bilinen anlamına gelir. Yüksek riskli olmaları hayvanların yaş, yerleşim yeri, kullanım veya hastalık etkenlerine daha fazla maruz kalmalarından kaynaklanabilir.

Diagnostik Testler Serolojik testler aynı zamanda diagnostik test olarak değerlidirler. Diagnostik test olarak kullanılabilmesi için 2 hafta ara ile çift serum örneği alınmalıdır (genellikle biri ilk muayenede, ikincisi iki hafta sonra alınır). Eğer ikinci örnekte antikor titresi önemli ölçüde yüksekse (genellikle dört kat artış olmalıdır) hayvan aktif enfeksiyona sahip olduğu kabul edilir.

Serolojik test etmenin amacı hastalıkların önlemesi, erken tedavi ve kontrolü için erken tespitidir. Laboratuvar teşhis metotları direkt ya da indirekt olabilir. Direkt metotlar hayvanda canlı veya canlı olmayan patojenin varlığını ortaya koyar. Örnek: Kültür yöntemleri, hormon rezidülerinin tespiti için radioimmunosorbent assay (RIA), direkt ELISA parazitik nematotların tespiti için dışkının direkt mikroskopik muayenesi gibi.

İndirekt Testler CFT, indirekt ELISA, RBPT gibi serolojik testler, allerjik deri testleri ve organik fosforlu pestisitlerle zehirlenen bir hayvan serumunda asetilkolinesteraz (ACEase) tespiti gibi biyokimyasal testleri içerir.

Bir testin performansı değişik faktörlerden etkilenir Bir testin performansı değişik faktörlerden etkilenir. Bu faktörler 3 gruba ayrılabilir: a) örnek – serum örneğindeki araştırılan maddenin kompozisyon ve konsantrasyonunu etkileyen konakçı/mikroorganizma etkileşimleri; b) assay sistemi – örnekteki spesifik bir maddenin tespitinde assay kapasitesini etkileyen fiziksel, kimyasal, biyolojik ve teknisyen–ilişkili faktörler; ve c) test sonuçları – söz konusu analiz maddesine göre konakçının durumunu doğru olarak tahmin etmek için assay sisteminden kaynaklanan bir test sonucunun kapasitesi.

a) örnek Serum örneğindeki analiz maddesinin kompozisyon ve konsantrasyonunu etkileyen etkileyen faktörler başlıca konakçıya ait olup bunlar doğuştan (örn: yaş, cinsiyet, ırk, beslenme durumu, gebelik, immünolojik cevap verebilirlik) veya sonradan kazanılmıştır (örn: pasif olarak kazanılan antikorlar, enfeksiyon veya aşılama ile kazanılan aktif immünite). Örneğin bozulması veya kontaminasyonu gibi konakçıya ait olmayan faktörler de örneği etkileyebilir.

b) assay sistemi Assay sisteminin analitik doğruluğunu etkileyen faktörler, cihazlar, teknisyen hataları, reajan seçimleri (kimyasal ve biyolojik) ve kalibrasyon, doğruluk ve kontrollerin kabul limitleri, reaksiyon kapları, su kalitesi, buffer ve diluentlerin pH ve iyon durumu, inkübasyon ısı ve süreleri, kros reaktif mikroorganizmalara karşı oluşan antikorlar, rhomatoid faktör ve heterofil antikorlar gibi yakın ilişkili maddelerin tespitiyle oluşan hataları içerir.

c) test sonuçları Konakçıdaki enfeksiyon veya analiz maddesi durumunun doğru olarak tahmin edilmesinde test sonuçlarının kapasitesini etkileyen faktörler dignostik sensitivite diagnostik spesifite ve assay’in uygulandığı hedef populasyondaki hastalığın prevalansıdır.

Laboratuvar testleri basit, ucuz, tekrarlanabilir ve doğru olmalıdır Laboratuvar testleri basit, ucuz, tekrarlanabilir ve doğru olmalıdır. Tekrarlanabilirlik bir testin aynı işlem veya işlemler arasında ayrıca farklı laboratuvarlarda uygulandığında uyumlu sonuçlar verme kabiliyetidir. Doğruluk testin tespit ettiği analiz maddesini (antikor, enzim, toksin vb.) doğru olarak ölçebilme kabiliyetidir.

Bir testin hastalıklı ve sağlıklı bireyleri ayırma gücü ile ilişkili olan sensitivite ve spesifiteden farklı olarak bu özellikler daha çok laboratuvardaki kalite kontrol ile ilişkilidir. Elbette test doğru ve tekrarlanabilir değilse bu testin sensitivite ve spesifitesini etkileyecektir.

Testlerin Özellikleri Sensitivite Bir testin enfekte hayvanları doğru olarak identifiye etme ihtimalidir. Spesifite Bir testin enfekte olmayan hayvanları doğru olarak identifiye etme ihtimalidir.

Yeni bir test geliştirildiğini düşünelim Yeni bir test geliştirildiğini düşünelim. Bu testin hastalıklı ve hastalıksız hayvanları ayırma kabiliyetinin değerlendirilmesi gereklidir. Bu değerlendirme için ilk adım mevcut testlerden birini kullanarak hayvanların hastalıklı ve hastalıksız olarak gerçek durumlarının doğru olarak tespitidir. Bu şekilde uygun hayvanlar seçildikten sonra hayvanlar yeni testin sonuçlarına göre pozitif ve negatif olarak sınıflandırılır.

Test ile doğru olarak tespit edilen hayvanlar (testin doğruluğu): Gerçek Pozitif (GP): Hastalıklı hayvanlarda test ile pozitif bulunanlardır Gerçek negatif (GN): sağlıklı hayvanlarda test ile negatif bulunanlardır

Test ile yanlış olarak değerlendirilen hayvanlar: Yanlış Pozitif (YP): Sağlıklı hayvanlarda test ile pozitif bulunanlar Yanlış Negatif (YN): Hastalıklı hayvanlarda test ile negatif bulunanlar

Gerçek pozitiflerin sayısı (GP) Sensitivite = ----------------------------------------- Hastalıklı hayvan sayısı (GP+YN) Gerçek negatiflerin sayısı (GN) Spesifite= ----------------------------------------- Sağlam hayvan sayısı (GN+YP)