MBEK değerleri aralığı (µg/ml) MIK değerleri aralığı (µg/ml) ATIK SULARDAN İZOLE EDİLEN MİKROORGANİZMALARA KARŞI ÇEŞİTLİ ANTİBİYOTİKLERİN İN VİTRO ANTİMİKROBİYAL VE ANTİBİYOFİLM AKTİVİTELERİNİN BELİRLENMESİ. Merve BİLGİN1, Sibel DÖŞLER2, Gülten ÖTÜK2 1.Yeni Yüzyıl Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,İstanbul 2. İstanbul Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul GİRİŞ GİRİŞ Tablo 4: Antibiyotik kombinasyonlarının Gram pozitif bakteri suşlarına karşı etkilerinin suşlara göre dağılımı Atık sular, evsel, ticari ve endüstriyel işletmelerden kaynaklanan atıkları içeren sular olarak tanımlanmaktadır. Şehir atık suları, kanalizasyon, grisu (lavabo ve duşlardan gelen sular) ve bazen de endüstriyel atık suları içerebilmektedir. Atık sular çevre ve insan sağlığı için risk oluşturabilecek çeşitli kimyasal maddeler ve patojen mikroorganizmalar içerdikleri için atık su arıtma tesislerinde fiziksel, kimyasal ve biyolojik süreçlere tabii tutulmaktadırlar. Arıtılan atık sular, tarımda sulama suyu olarak ve diğer alanlarda kullanılabilmekte veya nehirlere ve denizlere boşaltılmaktadırlar. Bu şekilde Enterobacteriacae familyasına, Pseudomonas cinsine veya Enterokoklara ait çeşitli su kaynaklı patojen bakteriler bitkilere, hayvanlara ve dolayısıyla insanlara bulaşabilmektedirler. Bu patojen mikroorganizmalar yaygın olarak insan gastrointestinal sistemininde olmak üzere, sinir sisteminde, deri ve yumuşak dokularda veya kulakta tehlikeli enfeksiyonlara neden olabilmektedirler (1,2,3) Günümüzde en tehlikeli bakteri türleri atık sularda da sıklıkla bulunan antibiyotiklere dirençli bakterilerdir. Antibiyotik direnci çoğunlukla günümüzde bir çok hasta tarafından bilinçsizce kullanılan eski antibiyotiklere karşı gözlenmektedir. Antibiyotiklere dirençli bakteriler hastane kaynaklı enfeksiyonlar kadar toplum kaynaklı enfeksiyonlarla da çevreye yayılmakta, halk sağlığı açısından risk oluşturmakta ayrıca iyi arıtılmamış atık sularla doğal çevreyi kontamine etmekte ve insanlarda enfeksiyonlara neden olmaktadır (2). Atık sularda bulunan mikroorganizmalarının yayılma ve enfeksiyon oluşturmasındaki diğer bir faktör de biyofilm oluşturmalarıdır. Biyofilm bazı mikroorganizmalar tarafından üretilen ve bakterilerin yüzeye yapışmasını sağlayan ekstraselüler polimerik matrikstir. Biyofilm, mikroorganizmaların ortama yapışıp daha uzun süre kalmasına, daha dayanıklı olmasına, kolayca temizlenmemesine ve daha fazla bulaşıcı olabilmesine neden olmaktadır (3). Bu sebeple çalışmada atık sulardan izole edilen mikroorganizmaların antibiyotik direnci ve çeşitli antibiyotiklerin biyofilm oluşumuna karşı etkileri araştırılmıştır. Antibiyotik kombinasyonları Suş sayısı Sinerjist Aditif Antagonist Ampisilin-Linezolid 2 1 Ampisilin-Doksisiklin Vankomisin-Linezolid Vankomisin-Doksisiklin Tablo 5: Çeşitli antibiyotiklerin minimal biyofilm eradike edici konsantrasyonları MBEK değerleri aralığı (µg/ml) Antibiyotikler A. baumanii E.coli K.pneumoniae Amikasin >2560 1280 Piperasilin 2560 Sefotaksim Siprofloksasin 1280-2560 160 640 Grafik 1: 1,2,4 saatlik biyofilm oluşumunun yapışma aşamasında çeşitli antibiyotiklerce inhibisyonu GEREÇ VE YÖNTEM Atık su örnekleri, Temmuz 2009- Nisan 2010 tarihleri arasında İstanbul Büyükşehir Belediyesi‟ne ait İstanbul Su ve Kanalizasyon İdaresi‟ne bağlı Paşaköy İleri Biyolojik Atık su Arıtma Tesisi’ndeki beş farklı noktadan alınmış, örnekleme mevsimsel olarak yapılmıştır. İzole edilen bakterilerin tanımı yapılmıştır. Çalışmada Kullanılan Antibiyotikler Gram negatif bakterilerle yapılan deneylerde amikasin, ampisilin, piperasilin, sefotaksim, siprofloksasin; Gram pozitif bakterilerle yapılan deneylerde ise ampisilin, linezolid, vankomisin ve doksisiklin antibiyotikleri kullanılmıştır. Yöntemler: Antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonları (MIK) değerleri CLSI tarafından bildirilen mikrodilüsyon yöntemiyle, kombinasyon halindeki etkileri ise mikrodilüsyon checkerboard yöntemiyle belirlenmiştir. Bakterilerin biyofilm oluşturma özellikleri kristal viyole ile boyama yöntemiyle belirlenmiş, antibiyotiklerin minimum biyofilm eradike edici konsantrasyon (MBEC) değerleri ile hücrelerin yüzeye yapışmasının ve biyofilm oluşumunun antibiyotiklerce inhibisyonu araştırılmıştır. BULGULAR Grafik 2: 24 saatlik biyofilm oluşumunun çeşitli antibiyotiklerce inhibisyonu Çeşitli antibiyotiklerin atık sulardan izole edilen Gram negatif ve Gram pozitif bakterilere karşı MIK değerleri sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2’de, Checkerboard deney sonuçları Tablo 3 ve 4’de, MBEK deney sonuçları Tablo 5’de, biyofilm inhibisyonuna ait deney sonuçları ise Grafik 1 ve 2’de verilmiştir. Tablo1: Antibiyotiklerin Gram negatif bakterilere karşı MIK değerleri Antibiyotikler MIK değerleri aralığı (µg/ml) A.baumanii E.coli K.pneumoniae Kluyvera sp. P.aeruginosa P.mirabilis Salmonella sp. S.maltophilia Amikasin 1 2-32 16 0.5-128 8 4 Ampisilin - 2-256 4-256 128 2 256 Piperasilin 4-8 16-64 32 4-128 0.5 Sefotaksim 4-16 <0.12 8-64 0.12 Siprofloksasin 0.125-0.5 <0.12-0.5 Suş sayısı 3 5 Tablo 2: Antibiyotiklerin Gram pozitif bakterilere karşı MIK değerleri SONUÇLAR Antibiyotikler MIK değerleri aralığı (µg/ml) MBEC değerleri aralığı (µg/ml) Enterococcus sp. Ampisilin 0,5 640- >2560 Doksisiklin 4-16 80-640 Vankomisin 1 >2560 Linezolid 2-16 1280 Suş sayısı 3 2 Ampisilin, doksisiklin, vankomisin ve linezolidin izole edilen Gram pozitif bakteri suşlarına karşı MIK değerleri 0,5-16 µg/ml arasında, sefotaksim, piperasilin, amikasin, siprofloksasin ve ampisilinin Gram negatif enterik ve non enterik suşlara karşı MIK değerlerinin sırasıyla <0,12-256 µg/ml ve <0,12-128 µg/ml arasında olduğu belirlenmiştir. İzole edilen suşlara karşı antibiyotiklerin çeşitli kombinasyonlarının %50 oranında sinerjist %50 oranında aditif etkili oldukları belirlenmiştir. Biyofilm oluşturmalarına bakılan 15 suşun 3’ünün kuvvetli, 3’ünün orta kuvvetli, 6’sının ise zayıf biyofilm oluşturdukları gözlenmiştir. Antibiyotiklerin biyofilm oluşturan suşlara karşı MBEC değerlerinin 80 - >2560 µg/ml arasında olduğu Antibiyotiklerin bakteri hücrelerinin yüzeye yapışmasını %1-64 oranında, 24 saatlik biyofilm oluşumunu ise %1-95,6 oranında inhibe ettikleri belirlenmiştir. Sonuç olarak atık sulardan izole edilen bakterilerin gerek antibiyotiklere olan dirençleri gerekse biyofilm oluşturma özellikleri ile halk sağlığı açısından tehlikeli olabilecekleri ve doğru şekilde temizlenmeleri gerektiği kanısındayız. Tablo 3 : Antibiyotik kombinasyonlarının Gram negatif bakteri suşlarına karşı etkilerinin suşlara göre dağılımı Antibiyotik kombinasyonları Suş sayısı Sinerjist Aditif Antagonist Piperasilin-Amikasin 10 7 3 Piperasilin-Siprofloksasin 8 4 Sefotaksim-Amikasin 6 2 Sefotaksim-Siprofloksasin 5 Ampisilin-Siprofloksasin 1 Ampisilin-Amikasin KAYNAKLAR Korzeniewska E,Harnisz M: Antibiotic resistant Eschericia coli in hospital and municipal sewage and their emission to the environment. Ecotoxicoloy and Environmental Safety 2013,91:96-102. Kim S, Aga DS: Potential ecological and human health impacts of antibiotics and antibiotic resistant bacteria from wastewater treatment plants. J Toxicol Environ Health B:Crit Rev 2007, 10:559-573. Schwartz T, Kohnen W: Detection of antibiotic resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. FEMS Microbiology Ecology 2003 43:325-335.