in vitro Sitotoksik ve Genotoksik Etkilerinin Araştırılması Metil Paratiyonun Zebra Balığı (Danio rerio) Primer Hepatosit Kültüründe in vitro Sitotoksik ve Genotoksik Etkilerinin Araştırılması Burak GÖKÇE, Sema İŞİSAĞ ÜÇÜNCÜ Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Zooloji Anabilim Dalı burak_gokce@yahoo.com GİRİŞ Organofosforlu bir bileşik olan metil paratiyon (MP; o,o-dimetil o-4-nitrofenil fosforotiyoat); asetilkolin esteraz enzimini engelleme niteliği ile özellikle pamuk -çeltik tarımında ve meyve-sebze yetiştirilmesinde çok yaygın kullanılan bir pestisittir. Asetilkolin esteraz inhibitörü olan MP endojen asetilkolin birikimine yol açarak embriyotoksik ve teratojenik , bazı fetal proteinlerin ifadesini tetikleyerek de mutajenik etkiler gösterir [1-5]. Elbette ki hedef olmayan canlılar üzerinde de izlenen bu etkiler özellikle sucul ekosistem dengelerini bozabilir. Teleostlar sucul ekosistemdeki yerleri ve ekonomik önemleriyle ekotoksikolojik modellemelerde çok sık kullanılan materyallerdir [6- 9]. Ancak bu grupta metafaz evresinde kromozom analizleri yapılması zordur, çünkü kromozomları küçük ve sayıları da fazladır [10]. Bu nedenle kimyasalların teleostlar üzerindeki genotoksik etkilerinin incelenmesinde genellikle mikronukleus testlerine ya da tek hücre agaroz jel elektroforezi olarak da bilinen ve DNA kırıklarının belirlenmesinde kullanılan «comet assay» (CA) yöntemine başvurulur [7, 11-13]. CA yöntemi kolay uygulanan, düşük maliyetli bir yöntem olarak kimyasalların çevresel risk değerlendirmesinde ve birçok balık türünde kullanılmıştır [14-17]. Bilindiği üzere son yıllarda hayvan hakları konusunda yükselen bilinçle yapılan yeni düzenlemeler, ekotoksikolojik araştırmalarda da in vitro yöntemlerin kullanılmasını yaygınlaştırmaktadır. Bu noktadan hareketle planlanan araştırmada, metil paratiyonun Danio rerio (zebra balığı) karaciğerlerinden izole edilen hepatositler üzerindeki sitotoksik ve genotoksik etkilerinin CA tekniği ile ortaya konması hedeflendi. MATERYAL VE METOT Sitotoksisite ve Genotoksisite Belirleme İşlemleri Deney Hayvanları, Hepatosit İzolasyonu ve MP Uygulanması Sitotoksisite için MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) stok solüsyonu, PBS içerisinde 5 mg/ml konsantrasyonda olacak şekilde çözüldü ve 0,20 µm filtre ile sterilize edildi. 24 kuyucuklu plakalara, kuyucuk içerisindeki her 100 µl besiyere 10 µl stok solüsyon eklendi. 27°C sıcaklıkta 4 saat inkube edilen plakalarda oluşan formazan kristalleri 0,04 N asit-izopropanol kullanılıp pipetaj yapılarak çözüldü. Plakaların 570 nm dalga boyundaki absorbansları spektrofotometre ya da plaka okuyucu yardımıyla ölçüldü. Genotoksisite için düşük erime sıcaklığına sahip %7 agaroz (LMPA) çözeltisi mikrodalgada eritildikten sonra hazırlanan 100 µl LMPA/10 µl hücre süspansiyonu normal erime sıcaklığına sahip agarozla (NMPA) karıştırılmış lamların üzerine konarak donması sağlandı. Preparatlar lizis çözeltisi içerisinde bir gece ve +4°C sıcaklıkta inkube edilip elektroforez tamponunda 20 dakika bekletildi, 40 dakika alkali elektroforez uygulanıp (24 V, 300 mA) ve 0,4 M tris tamponuyla nötralize edildi ve 100 µl (10µl/ml) etidyum bromid ile boyandı. Toplam 20 adet D. rerio örneği çeşitli biyolojik ve kimyasal filtrelerden geçirilerek dinlendirilmiş Bornova şehir şebeke suyuyla dolu 50 litrelik tanklar içerisinde 25±2 °C su sıcaklığında ve doğal fotoperiyotta laboratuvar ortamına adapte edildi. Örnekler ikisi canlı yem (Daphnia sp.) olmak üzere günde üç kez yemlendi. Rastgele seçilen 10 örnek +4°C sıcaklığında suya alınarak bayıltıldı ve disekte edilen karaciğer dokuları önce PBS tamponu içerisinde mekanik olarak, sonra %0,25 tripsin eklenip enzimatik olarak parçalandı. 27°C sıcaklıkta gerçekleşen enzimatik inkubasyon sonrasında kullanılan PBS miktarının en az üç katı besiyeri ile nötralize edilen tripsinli hücre süspansiyonu santrifüjlenip hücre pelleti elde edildi. %10 fetal bovine serum (FBS) içeren Leibovitz 15 besiyeri kullanılarak 24 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucuğa 4x105 hücre/ml olacak şekilde ekim yapıldı. MP; 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 µM konsantrasyonlarında olmak üzere 24 saat süreyle uygulandı. İstatistiksel Değerlendirmeler Verilerin tek yönlü varyans analizlerinde SPSS istatistik programı, canlılık sonuçları ve EC50 değerinin hesaplanması için regresyon analizinde de R istatistik programı kullanıldı. BULGULAR Sitotoksisite Genotoksisite Kontrol grubunda hücre canlılığı %98 oranındaydı. MTT testi sonuçları metil paratiyonun uygulama konsantrasyonu artışına paralel olarak yüksek düzeyde sitotoksik olduğunu gösterdi, en yüksek uygulama konsantrasyonu olan 500 µM’da hiç canlı hücre izlenmedi. (Şekil 1). EC50 değeri 372,5 µM olarak hesaplandı. DNA hasarlı hücrelerin belirteci olarak alınan o kuyruk uzunlukları ile kuyrukta bulunan DNA miktarı değerlendirildiğinde (Tablo 1), hasarın artan MP konsantrasyonu paralelinde arttığı izlendi (Şekil 3, 4) Şekil 1. Farklı konsantrasyonlarda MP uygulaması sonucunda canlı hepatosit yüzdeleri Şekil 3. Farklı konsantrasyonlarda MP uygulaması sonucunda CA testiyle belirlenen kuyruk uzunlukları (P<0,05) Şekil 4. Farklı konsantrasyonlarda MP uygulaması sonucunda CA testiyle belirlenen DNA miktarı (P<0,05) SONUÇ Neredeyse çekincesiz kullanılan bir pestisit olan MP, göreceli olarak yüksek EC50 değerine sahip olduğu halde in vitro koşullardaki D. rerio hepatositlerinde düşük konsantrasyonlarda bile sitotoksiktir. Konsantrasyon arttıkça sitotoksisite de beklenildiği üzere artmaktadır. CA testi uzantısındaki genotoksik değerlendirmelere göre de, MP’nin hepatosit DNA’larında ciddi ölçüde hasara yol açtığı görülmüştür. Sistem ve vücut bütünlüğünden ayrılmış hücrelerde, yani in vitro koşullarla yapılan deneylerin doğal süreçleri bire bir yansıtmadığına yönelik eleştiriler bulunsa da, sonuçlar MP’nin teratojenik ve büyük olasılıkla mutajenik etkileri olduğuna dair görüşleri [3-5] büyük ölçüde desteklemektedir. Sunulan araştırma, metil paratiyonun çok yaygın kullanımının pestisitlerin doğal çevrede oluşturdukları tahribat çerçevesinde önemle gözden geçirilmesini gerektirmektedir. KAYNAKLAR 1. Rubin, C., Esteban, E., Hill, J.R.R.H., Pearce, K., 2002. The Methyl Parathion Story: A Chronicle Of Misuse And Preventable Human Exposure Environ. Health. Perspect. 110-6, 1037-1040. 2. Gupta, R.C., Thornburg, J.F., Stedman, D.B., Welsch, F., 1984. Effect Of Subchronic Administration Of Methyl Parathion On İn Vivo Protein Synthesis İn Pregnant Rats And Their Conceptuses Toxicol. Appl. Pharmacol. 92, 457–468. 3. Gupta, R.C., Rech, R.H., Lovell, K.L., Welch, F., Thornburg, J.E., 1985. Brain Cholinergic, Behavioral, And Morphological Development İn Rats Exposed İn Utero To Methyl Parathion Toxicol. Appl. Pharmacol. 77, 405–413. 4. Levario-Carrillo, M., Olave, M.E., Corral, D.C., Alderete, J.G., Gagioti, S.M., Bevilacqua , E., 2004. Placental Morphology Of Rats Prenatally Exposed To Methyl Parathion. Exp. Toxicol. Pathol. 55 (6), 489–496. 5. Rashid, R.A., Mumma, R.O., 1984. Genotoxicity Of Methyl Parathion İn Short-Term Bacterial Test Systems. J. Environ. Sci. Health. 19, 565–577. 6. Al-Sabti, K., 1991. Handbook Of Genotoxic Effects And Fish Chromosomes. Ljublijana, Yugoslavia. 221. 7. Al-Sabti, K., Metcalfe , C.D., 1995. Fish Micronuclei For Assessing Genotoxicity İn Water. Mutat. Res. 343, 121–135. 8. Kleinjans, J.C.S., Van Schooten, F.J., 2002. Ecogenotoxicology: The Evolving Field. Environ. Toxicol. Pharmacol. 11 (3/4), 173–179. 9. Van Der Oost, R., Beyerb, J., Vermeulenc, N.P.E., 2003. Fish Bioaccumulation And Biomarkers İn Environmental Risk Assessment: A Review. Environ. Toxicol. Pharmacol. 13 (2), 57–149. 10. Ergene-Gozukara, S., Cavas, T., 2002. Cytogenetic Analysis Of A Mediterranean Gobiid Fish, Gobius Paganellus From Turkey. Folia Biol. 50, 5–7. 11. Arlett, C.F., Ashby, J., Fielder, R.J., Scott, D., 1989. Meeting Report—Micronuclei: Origins, Applications And Methodologies Mutagenesis. 4, 482–485. 12. Celik, A., Mazmanci, B., Camlica, Y., Askin, A., Comelekoglu, U., 2003 a. Cytogenetic Effects Of Lambda-Cyhalothrin On Wistar Rat Bonemarrow. Mutat. Res. 539, 91–97. 13. Celik, A., Cavas, T., Ergene-Gozukara, S., 2003 b. Cytogenetic Biomonitoring İn Petrol Station Attendants: Micronucleus Test İn Exfoliated Buccal Cells Mutagenesis. 18, 417–721. 14. Simoniello, M. F., F. Gigena, G. Poletta, A. Loteste, E. Kleinsorge, M. Campana, J. Scagnetti, and M. J. Parma. 2009. Alkaline Comet Assay for Genotoxic Effect Detection in Neotropical Fish Prochilodus lineatus (Pisces, Curimatidae). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 83:155-158.