Immunohistokimya Arş.Gör. Özlem Özdemir

İmmunohistokimya nedir? Immunohistochemistry (IHC) Antijen/antibody reaksiyonu ile spesifik hücre ya da doku bileşenlerinin tanımlanması prosedürüdür. IHC bir hücre veya dokudaki spesifik hücresel bileşenlerin lokalizasyonunu ve dağılımını görmeyi mümkün kılmaktadır. Immunohistokimyada spesifik hücre ve doku antijenlerinin lokalizasyonunu belirlemek amacıyla işaretlenmiş antibodyler kullanılır.

İmmunohistokimya nedir? Histokimyasal teknikler içinde en duyarlı ve spesifik tekniktir. immunoprecipitation, western- blot gibi diğer biyo-tekniklerle kıyaslandığında in situ bilgi sağlar, bu da deneysel sonuçların daha doğru olmasını sağlar. İHC oldukça geniş kullanım alanına sahip biyolojik bir tekniktir. Anatomi, fizyoloji, immunoloji ve biyokimya bilgisi gerektirir. Antijen-antibody bağlanma reaksiyonundan geliştirilerek oluşturulmuştur. Dokulardaki hücresel komponentlerin ya da spesifik antijenlerin lokalizasyonunu ve dağılımını görünür hale getirir.

Hedef hücresel antijenler Sitoplazmik Nuclear Hücre membranı Lipidler Proteinler

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Antijen retrieval Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri 1. Dokunun fikse edilmesi (Formalin) 2. Deparafinize ve rehidrasyon 3. Doku kesitlerinin hazırlanması Antijen retrieval Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme http://www.youtube.com/watch?v=5afOen2AVwg&hd=1

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Antijen retrieval Antijen retrieval reagent ile muamele edilen örneklerde antijenlerin görünürlüğü artırılır. Antijen retrieval reagent, formalin fiksasyonu sırasında oluşan protein çapraz bağlarını kırarak antijenik site ları görünür duruma getirir. Bu amaçla iki yöntem kullanılır.: 1. Isıtma "Heat Induced Epitope Retrieval (HIER)". 2. Enzimatik parçalama "Proteolytic Induced Epitope Retrieval (PIER)".   Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Antijen dönüşü Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Endojen peroksidaz deaktivasyonu Eğer immunoperoksidaz işaretleme (peroxidase anti-peroxidase veya avidin/biotin peroxidase) kullanılırsa dokudaki endojen peroksidaz aktivitesinin inhibe edilmesi gerekmektedir. Bunun için en sık kullanılan bloklama ajanı Hydrogen peroxide (H2O2) dir. , Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Antijen retrieval Immunohistokimyasal boyamada en önemli basamaklardan biri antibodylerin hedef proteinleri tanımasıdır. Antibodyler oldukça spesifik bağlanma gösterdiklerinden yalnızda dokudaki hedef proteinleri tanırlar. Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Antijen retrieval Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibodyler duyarlılığın artmasını sağlarlar. Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Antibodiler mikroskop altında görünür değildirler bu yüzden işaretlenmeleri gerekir. Ancak işaretleme yaparken antibodynin bağlanma spesifikliğini etkilememek oldukça önemlidir. Antibody- antijen bağlanmasını görünür duruma getirmek için çeşitli belirleme yöntemleri kullanılır. Kromojenik belirleme : Antibodye bağlı olan enzim substratı ile reaksiyona girerek proteinin bulunduğu yerde renkli bir ışıma verir. Florosan belirleme : Antibodye bağlı olan florofor, florasan mikroskobu yardımıyla görünür. Kullanılan işaretler: fluorochromes ( fluorescein, rhodamine), enzimler ( peroxidase, alkaline phosphatase) Elektron saçan bileşenler (Elektron mikroskobu ile görüntüleme için) ( ferritin, colloidal gold) Doku kesitleri Antijen retrieval Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Hedef antijenin immunohistokimyasal boyanmasının ardından boyamanın daha belirgin olması için ikinci bir boyama işlemi yapılır. Bu boyaların çoğu belirli hücresel komponentlere ve antijenlere spesifiklik gösterirken bir kısmı bütün hücreyi boyayabilir. Antijen retrieval Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Type Dye Target Color Chromogenic Hematoxylin Nuclei Blue to violet Nuclear fast red (Kernechtrot) Nucleic acids Red Methyl green Green Fluorescent >Hoechst stain Blue target="_blank">4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Propidium iodide >Fluorophore-tagged phalloidin Filamentous actin Fluorophore-specific Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Antijen retrieval Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Chromogen substrat Tüm immunohistokimyasal boyama işlemleri bittikten sonra örneklerin uzun süreli kullanımı ve saklanması için korunması gerekmektedir. Bu amaçla boyanmış doku kesitini lam üzerine sabitlemek/mühürlemek için çeşitli stabilizatörler kullanılır. Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları Doku kesitleri Antijen retrieval Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik inceleme http://www.youtube.com/watch?v=2XauafdfeV0&hd=1

PROSEDÜR 1. Deparaffinize and rehydrate sections as follows: 2 x 10 min in xylene, 2 min in 100% ethanol, 2 min in 95% ethanol, 2 min in 80% ethanol, 2 min in 70% ethanol, 5 min in tap water and 5 min in distilled water. 2. Block endogenous peroxidases by soaking slides in a solution mixtured with methanol and 30% H2O2 for 10 min at room temperature. Then wash the slides 5 min in distilled water, 5 min in PBS. 3. Heat Induced Epitope Retrieval: Antigen retrieval by microwavl irradiation 2x5min. Then remove the staining dish to room temperature and allow the slides to cool for 20 minutes. Note:The AR solution (pH 6.0)is mixture of Sodium Citrate Buffer and Citrate Buffer. Wash the slides 3x5min with PBS. 4. Block in 10% normal goat serum in PBS for 1 hour at 37℃. 5. Incubate sections with primary antibody at appropriate dilution in PBS overnight at 4 °C. 6. Wash the slides 3x5min with PBS. 7. Incubate sections with HRP-conjugated secondary antibody at appropriate dilution in PBS for 30 min at 37℃. 8. Wash the slides 3x3min with PBS. 9. Develop with DAB till the color is appropriate, then rinse the slides under tap water gently for about 1- 2 min. 10. Counterstain in hematoxylin. 11. 2 x2min in 100% ethanol, 2 x5min in xylene, mount sections with neutral balsam.

Antibody (Immunoglobulins) Plazma hücreleri tarafından üretilen glikoproteinlerdir. Yabancı maddeleri( bakteri, virüs vb. ) tanımlamak ve nötralize etmek amacıyla immun sistem tarafından kullanılır. Spesifik bir antijeni tanırlar.

Antijen

İmmunohistokimyasal metotlar Direkt method Indirekt method PAP method Avidin-Biotin Complex (ABC) Method: Labeled StreptAvidin Biotin (LSAB) Method

Direkt metot Direkt method tek bir adımda boyama metodur. İşaretlenmiş antibody doku üzerindeki antijen ile direk olarak reaksiyona girer. Bu metotda tek bir antibody kullanılır. Prosedür kısa ve hızlıdır. Duyarlılığı düşüktür. Nadir kullanılır. İndirekt metotudun giriş kısmında kullanılır. İşaretlenmiş antibody Doku antijeni

İndirekt metot(iki katmanlı) İşaretlenmemiş primer antibody doku antijeni ile reaksiyona girer. İşaretlenmiş sekonder antibody primer antibody ile reaksiyona girer. Duyarlılığı yüksektir. Sekonder antibody FITC, rhodamine or Texas red gibi florasan boyalarla işaretlenebilir. ( indirect immunofluorescence method ) Sekonder antibody peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase gibi enzimlerle işaretlenebilir.( indirect immunoenzyme method.) Sekonder antibody Primer antibody Doku antijeni

PAP Method (peroxidase anti-peroxidase method) PAP method indirekt metoda üçüncü bir adım eklenerek geliştirilmiştir. (üç katmanlı) Üçüncü adımda peroksidaz antibodysi peroksidaz ile reaksiyona girerek peroksidaz-antiperoksidaz kompleksini oluşturur. Peroksidaz molekülünden dolayı duyarlılık 100 ile 1000 kat arasında artmaktadır. Çünkü peroksidaz molekülü anti IgG ‘ye sadece immunolojik olarak bağlanır ve düşük primer antibody konsantrasyonlarında bile aktivitesini korur bu sayede istenmeyen antibodyler uzaklaştırılır ve non-spesifik bağlanma engellenmiş olur.

Avidin-Biotin Complex (ABC) Method: ABC method immunohistokimyada en sık kullanılan boyama metotlarından biridir. Avidin( büyük glikoprotein) peroksidaz veya fluorescein ile işaretlenebilir ve biyotin molekülüne yüksek affinite gösterir. Bu teknik üç katmanlı olarak gerçekleştirilir. İlk katman işaretlenmemiş primer antibody. İkinci katman biyotinlenmiş sekonder antibody.. Üçüncü katman avitim-biyotin peroksidaz kompleksi. Peroksidaz daha sonra DAB veya diğer substratlar ile reaksiyona girerek renkli bileşenler oluşturur.