Gıda Mikrobiyolojisi Eğitimi 04 Kasım 2014, Kuşadası Prof. Dr. Kadir HALKMAN Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü 05; Beklenmedik Sonuçlar

01a. Genel Yaklaşım Mikrobiyolojik analizler, fiziksel ve kimyasal analizlerden farklıdır. Fiziksel ve kimyasal analizlerde aynı örnekte aynı operatör tarafından aynı zamanda yapılan analizlerde farklı sonuçlar alınırsa bu rahatsızlık vericidir. Mikrobiyolojik analizlerde ise aynı örnekte aynı operatör tarafından aynı zamanda yapılan analizlerde yakın sonuçlar alınırsa bu rahatsızlık vericidir. Analizde tekrar edilebilirlik (aynı örnekte aynı operatör tarafından aynı zamanda yapılan analizde), farklı disiplinlerde farklı değerlendirilir. Bunlar, uluslararası kabul görmüş standartlarda, kodekslerde, komitelerde böyle kabul edilmiştir.

01b. Genel Yaklaşım Aynı seyreltiden 2 Petri kutusuna ekim yapıldığında %10 fark mükemmel bir ekim sonucudur. 2 Petri kutusu arasındaki sayım sonucu farkı %20’ye kadar kabul edilebilir. Aynı kuru gıdadan farklı zamanlarda yapılan mikrobiyolojik analizlerde Petri kutusundaki koloni sayım sonuçlarının logaritmaları alınır, ortalamanın standart sapması 0,10-0,15 arasında olmalıdır. Daha yüksek sapmalarda düzeltici uygulama yapılır. Daha düşük sapmalarda ise operatör izlemeye alınır. Fiziksel ve kimyasal analizlerde bu değerler ve yaklaşımlar çok farklıdır.

02a. ISO Gıda ve yem; Mikrobiyolojik analizler için ölçüm belirsizliği Belirsizlik Kaynakları: Örnekleme, Gıda, Kalıcı hata, Analizi yapan, Sapanlar, Ekipmanlar Her bir matris için ayrı ayrı belirsizliğin hesaplanması gerekir. Matris Grupları: Sıvı ve toz halindeki gıdalar, İyi karıştırılmış katı gıdalar, Doğranmış katı gıdalar, Diğer katı gıdalar Analizi Yapan Bireylerden Gelen Belirsizlik Bileşenleri: Alt örnekleme, Dilüsyon, Muamele süresi, Petri kutularına ekim, Petri kutularının değerlendirilmesi, Biyokimyasal doğrulama, Sonuçların yorumlanması, Sonuçların hesaplanması.

02b. ISO Gıda ve yem; Mikrobiyolojik analizler için ölçüm belirsizliği Ekipmandan Gelen Belirsizlik Bileşenleri: Teraziler, Termometreler, Seyrelticiler, Karıştırıcılar, Termostatlar, Hacim ölçen ekipmanlar, Otoklavlar Diğer Belirsizlik Bileşenleri: Besiyeri kalitesi, Cam aparatların temizliği, Su kalitesi, Kullanımdan evvel ve kullanım esnasında besiyerinin saklanması.

02c. ISO Gıda ve yem; Mikrobiyolojik analizler için ölçüm belirsizliği Tekrarlanabilirlik: Aynı koşullar altında yapılan analizler arasındaki farklılığın ölçümü; Aynı metot, Aynı örnek, Aynı kişi, Aynı ekipman, Aynı koşullar, Aynı zaman İzleme: Ekipman, Metodoloji, Personel Belirsizliği Azaltmak İçin Yapılması Gerekenler: Operatörlerin eğitimi, Performanslarının test edilmesi, Ekipmanın test edilmesi, Uygun yöntemlerin seçimi.

03a. Toplam Bakteri Toplam bakteri; bir kalite kavramıdır, bir simgedir. Analiz edilen gıdadaki bütün canlı bakteriler değildir. Gıdada mevcut tüm canlı bakterileri sayabilecek bir yöntem bugün için yoktur. Basit olarak, PCA besiyerinde 28 o C’da 48 saat aerobik inkübasyon sonunda oluşan koloniler sayılır. Bazı maya hücreleri de bu koşullarda koloni oluşturabilir ama bunlar da “toplam bakteri” içinde değerlendirilir. Küfler bu süre içinde gelişerek koloni oluşturamazlar. Toplam bakteri yerine “Aerobik Mezofil Koloni Sayısı” daha anlamlı bir ifadedir.

03b. Toplam Bakteri Bir gıda analizinde “Toplam Laktobasil” sayısı > “Toplam bakteri” sayısı olabilir mi? Evet, peynir analizinde sıklıkla bu sonuç alınır. Peynir üretiminde kullanılan laktobasiller PCA’da gelişemez ama MRS Agar’da gelişir. Ama turşu analizinde bu sonuç alınırsa sorgulamakta yarar var. Turşu üretiminde etken laktobasiller PCA’da kolaylıkla gelişir ama gelişmeyenleri de olabilir. Sadece sorgulamakta yarar var. Bir gıda analizinde “Toplam koliform bakteri” sayısı > “Toplam bakteri” sayısı olabilir mi? Kesinlikle hayır. Koliform grup bakteriler PCA’da kolaylıkla koloni oluştururlar.

04a. Koliformlar Bir gıda analizinde “E. coli” sayısı > “Toplam koliform bakteri” sayısı olabilir mi? Evet, operatör mikrobiyolojik analizlerde temel bazı ilkeleri bilmiyorsa, laboratuvarda bu sonuç alınabilir. Basit olarak, koliform bakteri ve E. coli, 2 farklı yöntemle sayıldı ise bu sonuç doğru şekilde alınabilir. Oysa asıl olarak tek yöntem kullanılıp, önce koliform bakteriler sayılmalı, devamında bunlardan hangilerinin E. coli olduğu belirlenmelidir.

04b. Koliformlar Tipik bir örnek/ sorgulama CCA (Merck); Çok abartılı bir örnek.Tipik bir örnek/ sorgulama CCA (Merck); Çok abartılı bir örnek. Gıdada 10 4 kob/mL E. coli ve 10 7 kob/mL E. coli olmayan toplam koliform (Citrobacter freundii vd.) olduğunu varsayalım. CCA besiyeri kullanılıyor. Size kolay gelsin, iyi şanslar. Hiçbir koşulda E. coli belirleyemezsiniz/ sayamazsınız. Sadece 10 –4 seyreltide toplam koliform sayısını belirleyebilirsiniz. E. coli sayım sonucunu <10 5 kob/mL olarak vermenizin kabul edilebilir bir geçerli ifadesi yoktur.

04c. Koliformlar Detaylandıralım:Detaylandıralım: Gıdada 10 4 kob/mL E. coli ve 10 7 kob/mL E. coli dışı toplam koliform olduğuna göre koliformların sayımı için 10 –4 seyreltiden CCA besiyerine ekim yapıldığında basit olarak 100 adet pembe-kırmızı (E. coli dışı koliformlar) kolonisi olacaktır. Basit matematiksel yaklaşım ile bu Petri kutusunda 1 adet koyu mavi-menekşe renkli E. coli kolonisi bulunma olasılığı sadece %10’dur. Kuşkusuz, biyolojik bilimlerde bu kadar basit bir matematik yoktur ama ana hatları ile budur. Analiz edilen gıdada 10 4 kob/mL E. coli vardır ama aynı besiyerinde gelişebilen E. coli dışındaki koliformlar, hedef bakteriyi maskeleyecektir.

04d. Koliformlar

04e. Koliformlar Sonuçta, gıdada E. coli olmakla birlikte, analiz sonucu %90 olasılıkla <10 5 kob/mL (doğru ama anlamsız sonuç bildirimi), %10 olasılıkla ise 10 6 kob/mL (yanlış sonuç bildirimi) olarak verilecektir. Ne yapmamız gerekli idi? Örneğin inkübasyonu 44 o C’da yapabilirdik. Ama E. coli olmayan koliformların tamamı fekal Enterobacter aerogenes ise ne olacak? Fekal koliformlar bu sıcaklıkta gelişir. Zaten E. coli analizini fekal kontaminasyon kontrolü için yapıyoruz, sorun yok.

05. Benzer Örnekler Yukarıda verilen çok abartılı bir örnek gibi gelebilir. Hele gıdada 10 4 E. coli, 10 7 E. coli olmayan fekal koliform iyisinden abartıdır. Olmayacağına garanti verebilir misiniz? Sakın ola ki bu garantiyi vermeyin. Avrupa’da ve özellikle Almanya’daki son E. coli O104:H4 salgınını hiç unutmayın. 3800’den fazla sebebi kanıtlanmış hastalanma, 823 HUS ve 44 ölüm. Akademisyenler, gıda sanayisi çalışanları, araştırma kuruluşları çalışanları bu gibi örneklerde çok ciddi şekilde atlıyor, çok ciddi sorunlar ile karşılaşıyor. Örnek abartılı olsa bile benzeri örnekler çok fazla.

06a. EMS; Genel Tablo okuma önemlidir. OKUMAMALISINIZDaha da önemli olan analiz yöntemi / tablo okumaktır. 3 tüplü ekim yöntemi sonucunu 5 tüplü ekim tablosundan OKUMAMALISINIZ. EMS, sadece gerektiğinde kullanılacak analiz yöntemidir. EMS Protokolü ciddi anlamda kavranılması gereken bir konudur. En azından kategori kavramı tam olarak kavranılmalıdır.

06b. EMS; Kategori 1 ml 0,1 ml 0,01 mlEMSKAlt %95 Üst %95 Alt %99 Üst %99 000<0,3- 0,000,940,001, ,361 0,021,700,012, ,103 0,403,500,204, ,002 0,504,000,205, ,001 3,0038,002,0052,00

07. “Yok” Ne demek? Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı açısından aranan patojen gerçekten yoktur. Patojen gerçekte vardır ama sayısı, belirlenebilecek standart olasılık altındadır, belirlenememe olasılığı yüksektir (1 adet Salmonella/ 1 kg-L gıda; belirleme şansı basit matematiksel yaklaşım ile sadece %4). Patojen gerçekte, belirlenebilecek sayıdadır, laboratuvar hata yapar. En tipik örnek Salmonella analizidir. Hataya çok açıktır. Laktoz Broth (FDA) kullanılmamalıdır.

08. Pseudomonas aeruginosa Açık bir özür: Cetrimide Agar hiç de öyle çok özel bir örnek değilmiş. Selektif besiyeri konusunda hep Cetrimide Agar’ı sadece Pseudomonas aeruginosa için tam selektif besiyeri olarak örnek verirdik. P. fluorescens ve diğer Pseudomonas türleri ile yakın akraba türler, bu besiyerinde çok kolay gelişebiliyor. P. fluorescens bu besiyerinde ve diğer selektif Pseudomonas besiyerlerinde P. aeruginosa‘ya çok yakın morfolojik karakterli koloni oluşturur. Bu 2 bakterinin ayrılması için 42 o C’da inkübasyon gereklidir. P. aeruginosa bu sıcaklıkta gelişebilir, P. fluorescens gelişemez. İnkübasyon sıcaklığı kritiktir. P. fluorescens 25 adlı bakteri her koşulda gelişiyor, moleküler yöntemlerle ayılabilir.

09. Bacillus cereus Bu analizde pastörizasyon gerçekten gerekli mi? Pastörizasyon uygulanırsa o anda spor oluşumunu tümüyle tamamlamış olanlar sayılabilir. Vejetatif formdaki tüm B. cereus hücreleri ölür. Basiller, sadece hayati bir tehlike olduğunda spor oluştururlar. Normal koşullarda vejetatif formda kalıp, çoğalma eğilimi gösterirler.

10a. Selektif Besiyerleri Selektivite arttıkça, hedef bakterinin gelişmesi zorlanır. Sahte negatif sonuç alınma şansı artar. Selektivite azaldıkça, refakatçi floranın gelişmesi artar. Hedef bakterinin gelişmesi kolaydır ama refakatçi flora maskelemesi ile sonuç alınamayabilir. Numunede hasar görmüş olduğundan endişe edilen mikroorganizma varsa, olabildiğince zayıf selektivitede olan besiyerleri tercih edilmelidir. MRS, selektif besiyeri değildir. Sadece, laktobasillerin gelişmesini destekleyen bileşenler içerir.

10b. Selektif Besiyerleri Problem çözüm örneği 01: Numunede E. coli aranacak. Hasar görmüş olmasından şüphe ediliyor. Refakatçi flora olarak yoğun koliform grup bakteri bekleniyor. E. coli zarar gördü ise, diğer koliformların da zarar görmüş olması beklenir, zayıf selektivitede bir besiyeri seçilir. Genel bir besiyerine (CASO Agar) yayma yöntemi ile ekim yapılır. 37 o C’da 4 saat inkübe edilir (canlandırma). Sonra üzerine dikkatlice ~40 o C’da tutulan selektif bir besiyeri dökülür, 44 o C’da 20 saat inkübe edilir.

10c. Selektif Besiyerleri Problem çözüm örneği 02: Su numunesinde Membran Filtrasyon yöntemi ile Salmonella aranacak. Hasar görmüş olmasından şüphe ediliyor. Refakatçi flora olarak yoğun E. coli olması bekleniyor. E. coli, çevresel etkenlere karşı daha dayanıklıdır. Yukarıdaki örneğe uygun olarak filtrenin CASO Agarda 37 o C’da 4 saat inkübasyonu ve ardından üzerine selektif bir Salmonella katı besiyeri dökülüp inkübasyona 42 o C’da devam edilmesi olur mu? Salmonella izole ederseniz sorun yok. Salmonella izole edemezseniz raporunuzda [yok] mu yazacaksınız? Yok ne demek?