Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Mutasyon Analiz Teknikleri I Doç. Dr. Hilâl Özdağ Hafta VII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "Mutasyon Analiz Teknikleri I Doç. Dr. Hilâl Özdağ Hafta VII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları."— Sunum transkripti:

1 Mutasyon Analiz Teknikleri I Doç. Dr. Hilâl Özdağ Hafta VII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları

2 PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ  SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)  HA (Heteroduplex Analysis)  CEHA/CE-SSCP (Capillary Electrophoresis HA)  TGCE (Temperature Gradient Capillary Electrophoresis  DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)

3 ELEKTROFOREZ  Agaroz Jel Elektroforezi  Denatüre edici olmayan (Native)  Denatüre edici (Formaldehitli)  Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)  Denatüre edici olmayan (Native)  Denatüre edici (Üreli)  Kapiller Elektroforez (CE)  Denatüre edici olmayan (Native)  Denatüre edici

4 ELEKTROFOREZ  Elektroforezde nükleik asitler boy ve konformasyonlarına göre yürür.  Denatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve RNA daha ziyade konformasyonlarına bağlı olarak yürür.  Denatüre edici ortamda ise bu moleküller ikincil yapı oluşturamayacakları için moleküler ağırlıklarına göre yürürler.

5 ELEKTROFOREZ  Agaroz Jel Elektroforezi  Denatüre edici olmayan (Native)  Büyük moleküler ağırlıklı DNA yürütülecekse (genomik DNA gibi) %0.8-1 arası jel hazırlanmalıdır.  PCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb arası) %2’lik jele ihtiyaç vardır.  RFLP benzeri uygulamalarda birbirinden bç farklı fragmentleri ayırmak için NuSieve benzeri agaroz türevleri ile rezolüsyon arttırılabilir. Metaphor agaroz ile 3-4 bç farkı ayırmak mümkündür.

6 ELEKTROFOREZ  Agaroz Jel Elektroforezi  Agaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE (Tris Asetik asit EDTA) ile hazırlanır.  DNA düşük voltajda uzun yürütmek gerektiğinde (RE ile kesilmiş genomik DNA’yı Southern öncesi yürütmek gibi) TAE tamponu uygundur.  Kısa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE seçilmelidir.

7 ELEKTROFOREZ  Agaroz Jel Elektroforezi  TBE 5X veya 10X konsantrasyonda hazırlanıp 1X konsantrasyonda kullanılır. Uzun süre beklediğinde çökelti oluşturur.  TAE 50X konsantrasyonda hazırlanabilir.  TAE’nin hazırlama maliyeti TBE’ye göre daha düşüktür.

8 ELEKTROFOREZ  Agaroz Jel Elektroforezi  Denatüre edici (Formaldehitli) RNA analizlerinde kullanılır. Özellikle Northern blot analizi yapılacaksa jeli bu şekilde hazırlamak şarttır. Ancak yalnızca RNA’nın varlığına/yokluğuna ve bütünlüğüne bakılacaksa rutin agaroz hazırlanabilir. Her durumda RNA analizlerinde jelin RNaz’sız ortama uygun şekilde hazırlanması gerekmektedir.

9 ELEKTROFOREZ  Poliakrilamid Jel Elektroforezi  Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında Amonyum Persülfat (APS) aracılığıyla TEMED’in katalizörlüğünde çapraz bağların oluşması ile polimerleşen bir jeldir.  APS her defasında taze hazırlanmalıdır.

10 ELEKTROFOREZ  Poliakrilamid Jel Elektroforezi  Akrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide karıştırılarak çözüldükten sonra filtreden geçirilerek süzülmelidir.  Akrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir.  Akrilamid ve bisakrilamid arasındaki oran çapraz bağlarla oluşan porların çapını dolayısıyla jelin rezolüsyonununu belirler; 19:1/29:1/39:1 gibi  MDE (Mutation Detection Enhancement) Jel

11 ELEKTROFOREZ  Kapiller Elektroforez  Donmayan akrilamid bazlı özel polimerler kullanılır. Bu polimerlerin nativ veya denatüre edici özellikte olanları mevcuttur.

12 ELEKTROFOREZ  PCR temelli mutasyon analiz tekniklerinde amaç olası dizi değişimlerinin analiz edilen DNA fragmentinin konformasyonuna olan etkisinin tespit edilmesidir.

13 PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ

14 SSCP/HA

15 PCR TEMELLİ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ CE-HA CE-SSCP


"Mutasyon Analiz Teknikleri I Doç. Dr. Hilâl Özdağ Hafta VII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları