Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: PROTEİNLERİN İZOLASYONU VE ANALİZİ Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 1.Ders.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: PROTEİNLERİN İZOLASYONU VE ANALİZİ Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 1.Ders."— Sunum transkripti:

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: PROTEİNLERİN İZOLASYONU VE ANALİZİ Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 1.Ders

2 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE ANA KURAL ve TEMEL ÇALIŞMA ALANLARI DNA RNA PROTEİN MOLEKÜLLER ARASI ETKİLEŞİM Nasıl? Neden? Nasıl? Neden? Nasıl? Neden? Gen dizisi  transkriptler   primer protein ürünleri   fonksiyonel proteinler (DNA) (mRNA) Transkripsiyonel kontrol Translasyonel kontrol Translasyon sonrası kontrol (post-translasyonel modifikasyonlar) Nükleotid dizisinin belirlenmesi mRNA analizleriProtein yapı analizleri Nükleik asitlerle ilgili teknikler Proteinlerle ilgili teknikler Moleküler etkileşimler Protein fonksiyon analizleri Ör. Metabolik işleyiş, enzim aktivitesi, etkileşimler (N. Arda)

3 OMİK VERİLER : Bir bilmecenin parçaları !

4 ÖZETLE: transkripsiyon translasyon modifikasyon-organizasyon DNA RNA PROTEİN HÜCRESEL İŞLEVLER ANA HEDEF : Hücrenin moleküler organizasyonunu, dolayısıyla canlılığın moleküler temellerini anlamak !!!

5 DNA P1P1 P2P2 P3P3 P4P4 P5P5 Nükleotid dizisi Amino asit dizisi TEORİK YAKLAŞIM: UYGUN 3 BOYUTLU YAPIDA UYGUN ZAMANDA UYGUN YERDE UYGUN MİKTARDA DOĞRU İŞ GÖREN BİR PROTEİN Genlerle proteinler arasında bire bir bir ilişki yoktur! Çünkü:

6 İNSANDA: GEN – PROTEİN AKTİF BİR PROTEİN OLUŞURKEN 400’DEN FAZLA KİMYASAL MODİFİKASYONUN GERÇEKLEŞEBİLECEĞİ ÖNGÖRÜLMEKTEDİR.

7 SORULAR: Nerede ve/ya hangi proteinler var ? Ne kadar var? Yapısı nedir ? Ne gibi özellikleri var? Nasıl iş görür ? Hangi moleküllerle etkileşir?

8 LABORATUVAR ORTAMI

9 LABORATUVARDA KULLANDIĞIMIZ KİMYASALLAR Dünyada en az 65 milyon çeşit kimyasal bileşik üretiliyor ve değişik saflık derecelerinde piyasaya sürülüyor.... Kalitesine ve miktarına göre farklı fiyatlara satılıyor.

10 Hemen hepsi ithal ve “Molecular biology-grade”, yani kalitesi yüksek. Bunun için de çok pahalı!!!!

11 Kimyasalların bazıları (özellikle ENZİMLER) soğutucularda (+4 o C ve -20 veya -80 o C derin dondurucularda) saklanmalıdır.

12 SIVI AZOT TANKLARI

13 KAR-BUZ MAKİNASI

14 LABORATUVAR ARAÇ-GEREÇLERİ

15 Cam pipetler Puar Pipet standı Pipet kutusu

16 Mikropipetler

17 Hamilton şırıngalar (  L düzeyinde sıvı transferi yapabilen cam şırıngalar)

18 TERAZİ pH-metre TEMEL ALET VE EKİPMANLAR

19 SU BANYOSU VORTEX KARIŞTIRICI ISITICILI MANYETİK KARIŞTIRICI BALON ISITICI

20 SAF SU – DEİYONİZE SU CİHAZLARI

21 HAVAN VE HAVAN ELİ

22 KARIŞTIRICI HOMOJENİZATÖR (“Waring Blender”)

23 MİLLİ HOMOJENİZATÖR (“ultra turrax)

24 PİSTONLU HOMOJENİZATÖR

25 FRANSIZ BASINÇ HÜCRESİ

26 BALİSTİK HOMOJENİZATÖR

27 ULTRASONİKATÖR

28 FİLTRASYON DÜZENEKLERİ

29 MEMBRANLI FİLTRASYON

30 SANTRİFÜJLER

31 Vakumlu santrifüj (KONSANTRATÖR)

32 SPEKTROFOTOMETRE – MULTI(MICRO)PLATE READER (ÇOK KUYUCUKLU OKUYUCU)

33 DİĞER ÖZEL ALETLER   Yatay ve dikey elektroforez cihazları   Güç kaynakları   Blotlama sistemleri   Jel kurutma sistemleri   Protein saflaştırma sistemleri   Jel görüntüleme ve analiz sistemleri   Mikroskoplar   İklim kabinleri   Çalkalamalı etüvler   Etüvler  Otoklav  Kuru hava sterilizatörü  Laminar flow – Steril çalışma kabinleri  Ultrasonik banyolar  Vakum pompaları  Balon ısıtıcıları  Distilasyon düzenekleri  Evaporatör-Döner buharlaştırıcı

34 BİYOLOJİK MATERYALLER: MİKROORGANİZMALAR

35 HAYVANSAL ÖRNEKLER

36 HAYVAN DOKU VE HÜCRE KÜLTÜRLERİ

37 BİTKİLER VE BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİ

38 Bir proteinin nasıl izole edileceğine, hangi yöntemle ve ne derece saflaştırılacağına karar verirken göz önünde bulundurulan kriterler:   AMAÇ;   MATERYALİN VE ÇALIŞILACAK PROTEİNİN TİPİ VE MİKTARI;   İŞLEMLERİN SÜRESİ VE MALİYETİ;   ELDEKİ OLANAKLAR PROTEİN İZOLASYONU

39 Protein denatürasyonundan ve inaktivasyondan korunmak için çalışmanın her aşamasında pH ve SICAKLIK kontrol altında tutulmalıdır! Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin SOĞUKTA (genelde 4 o C’da) gerçekleştirilmesiyle önlenir. pH ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri doğrultusunda hazırlanmış tampon çözeltilerin kullanımı ile istenen değerde tutulur. Çalışma pH sı tamponun pKa’sına yakın olmalıdır. HER DURUMDA

40 TAMPON SEÇİMİNDE DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN KURALLAR:   Çalışma pH’sı,   Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olması,   İyonik kuvvet ve sıcaklık etkisiyle pH değişimi,   Kimyasal etkinlik,   Biyolojik etkinlik,   Diğer bileşenlerle etkileşim,   Biyolojik membranların geçirgenliği,   Toksisite,   280 nm ve altındaki dalga boylarında absorbsiyon,   Maliyet,   Çözünürlük

41 Ortam pH’sının 7 ve 7’ye yakın değerlerde olduğu koşulda en geniş çapta kullanılan tamponlar tris ve fosfat tamponlarıdır. Ek bilgi için Bkz. MBKY Kitabı Ek 9, 10, 11

42 İYONİK KUVVET  Bir tamponda yer alan iyonların derişimi ve yükü de protein çalışmalarında önem taşır. c i = iyonun molar konsantrasyonu z i = iyonun yükü (işareti dikkate alınmaz) Fizyolojik iyonik kuvvet: arasında!

43 Ekstraksiyon Tamponunda bulunan diğer bileşenler: Proteaz inhibitörleri: Ör. Fenilmetilsülfonilflorür, PMSF Parçalama sırasında açığa çıkan Proteazlardan kjorunmak için EDTA gibi Kelatörler: Metal iyonlarını bağlamak için, çalışılan proteinin stabilitesini artırmak için (metalloproteazların etkisini azaltmak için 2-Merkaptoetanol (2-ME), Ditiotreitrol (DTT) gibi tiol bileşikleri: Bitkilerle çalışırken ortaya çıkan fenol oksidazların olumsuz etkisini azaltmak için Polivinilpolipirolidon (PVPP): Bitkilerle çalışırken ortaya çıkan fenolik maddeleri bağlaması için Kofaktörler ve diğer katkı maddeleri: Enzimleri stabilize etmek için Deterjanlar: Membran proteinlerinin çözünmesi için Streptomisin sülfat: Nükleik asitleri çöktürmek için

44 PARÇALAMA SIRASINDA MEYDANA GELEBİLECEK OLUMSUZLUKLAR. * Isı oluşması (Soğutma yapılır.) * Proteazların açığa çıkması (Proteaz inhibit ö rleri, Ö r. Fenilmetils ü lfonilflor ü r, PMSF kullanılır.) * Nükleik asit kontaminasyonu ( Çö kt ü rme ile uzaklaştırılır.) * Aşırı köpük oluşumu (Anti-k ö p ü k ajanlar, mekanik y ö ntemlerle uzaklaştırılır.) * Ağır metal toksisitesi (Besiyerinde kullanılan yan ü r ü nlerden ileri gelir. Çö kt ü r ü lerek uzaklaştırılır)

45 PARÇALAMA (HOMOJENİZASYON) YÖNTEMLERİ: Çalışılacak molekül grubunu içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapılarını parçalama işlemi Fiziksel yöntemler Mekanik işlemler Ultrasonikasyon Ozmotik şok Dondurma-çözme Kimyasal yöntemler Çözücülerin kullanılması Enzimlerin kullanılması

46 Mekanik İşlemler: ALETLİ HOMOJENİZASYON FİZİKSEL YÖNTEMLER

47 Mekanik İşlemler: OZMOTİK ŞOK Hücrelerin yüksek ozmotik basınçlı (hipertonik) bir çözeltiden (ör. %20’lik sukroz) düşük ozmotik basınçlı (hipotonik) bir çözeltiye (ör. suya) alınmasıyla suyun hücreleri patlatılması. Hücre duvarı (çeperi) bulunmayan ya da yok edilmiş hücrelere uygun bir yöntem.

48 Mekanik İşlemler: DONDURMA-ÇÖZME Soğuk-Sıcak-Soğuk-Sıcak.....

49 Çözücülerin Kullanılması Organik çözücüler Deterjanlar, Bazik çözeltilerle... KİMYASAL YÖNTEMLER

50 Kimyasal İşlemler: Enzimlerin Kullanılması Lizozim, Tripsin, Proteinaz K, Zimoliyaz gibi enzimlerle...

51 Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı parçalama yöntemleri TeknikMateryal tipi Nazik Ozmotik şokEritrositler Enzim uygulamasıBakteriler, mayalar Deterjan uygulamasıDoku kültürü hücreleri Havan veya pistonlu homojenizatörKaraciğer vb yumuşak dokular Diğer aletlerle parçalamaKas vb. Dokular Orta şiddette Milli homojenizatörle par.Hayvansal ve bitkisel dokular Kum, alumina vb. ile ezmeBitkisel dokular, bakteriler Sert Fransız basınç hücresi Bitkisel dokular, bakteriler UltrasonikasyonHücre süspansiyonları Balistik parçalamaHücre süspansiyonları

52 Parçalama (homojenizasyon) yöntemleri uygulanarak doku veya hücrelerin çeper ve zar yapıları yok edilir. Ele geçen ve çalışılacak molekül grubunu içeren karışıma HOMOJENAT denir.

53 Parçalamanın etkinliğini ölçmek için çeşitli analitik yöntemlere başvurulur.

54 AYIRMA VE SAFLAŞTIRMA Üzerinde çalışılacak molekül grubunu homojenattaki diğer moleküllerden ayırmak ve saf şekilde elde etmek Preparatif veya Analitik amaçlı yapılabilir.

55 SÜZME (FİLTRASYON)

56 VAKUMLU FİLTRASYON

57 Moleküler biyolojide en çok kullanılan filtre edici materyaller:  Müslin (tülbent veya gazlı bez)  Filtre kağıdı (bkz. MBKY kitabı Ek 15, s. 324)  Sinterli cam huni  Membran filtreler (bkz. MBKY kitabı Ek 16, s. 324)

58 Membran filtreler veya ”membranlar” özgül por çaplarına sahip polimer filmlerden oluşur. Porlardan geçemeyecek büyüklükteki partiküller ve mikroorganizmalar için fiziksel bir bariyer oluşturur ve bunları zarın yüzeyinde tutarlar.

59 MEMBRANLI FİLTRASYON

60 ULTRAFİLTRASYON Moleküllerin boyut, biçim ve/veya yüklerine göre ayrılmasını sağlar.

61 Centricon tipi ultrafiltrasyon tüpü (vakumdan yararlanılır) Kapan hücresi (basınçtan yararlanılır)

62

63 NMWC Nominal Molecular Weight Cut-off NMWC Nominal Molecular Weight Cut-off Membrana özgü bir değerdir. Membrandan geçemeyen bir molekülün ağırlığına eş değerdir.

64 DİYALİZ

65 LİYOFİLİZASYON

66 SANTRİFÜJLEME Santrifüj kullanılarak yüksek hızda döndürülen moleküllerin, oluşan merkezkaç kuvvetinin etkisiyle farklı şekilde çökmesini sağlayan teknik

67 Değişik tipte rotorlar Sabit açılı rotor Açılan kova tipinde rotor Dik tipte rotor

68 Santrifüjleme sonunda Üst faz (sıvı faz) “süpernatant” Alt faz (çökelti) “pellet”

69 “Santrifüj kuvveti” F = m x  2 x r m = çöken partikülün kütlesi  = açısal hız r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı

70 “Relative Centrifugal Force” Santrifüj hızı ile ilgili bir ifade (g değeri) RCF = x x rpm 2 x r rpm = dönüm sayısı (devir/dakika) r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı (cm)

71

72

73

74

75 Homojenattaki zar (membran) parçalarını, parçalanmamış doku ve hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ÖN AYIRMA işlemlerinden sonra ele geçen sıvıya adı verilir. Homojenattaki zar (membran) parçalarını, parçalanmamış doku ve hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ÖN AYIRMA işlemlerinden sonra ele geçen sıvıya HAM ÖZÜT (CRUDE EXTRACT) adı verilir.


"MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: PROTEİNLERİN İZOLASYONU VE ANALİZİ Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 1.Ders." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları