IN SITU MELEZLEME (HİBRİDİZASYON)

... konulu sunumlar: "IN SITU MELEZLEME (HİBRİDİZASYON)"— Sunum transkripti:

1 IN SITU MELEZLEME (HİBRİDİZASYON)

2 ln situ melezleme (hibridizasyon) (lSH),
Nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA) morfolojik olarak korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerinde saptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli nükleik asit oluşumu esasını kullanan bir tekniktir. lSH’da nükleik asitler kendi hücresel ortamlarında gösterilir.

3 DNA Zinciri Açılabilir

4 Merkezi Dogma

5 Bir proteinin üretilebilmesi için ilgili genden mRNA üretilmelidir.
Eğer bir dokuda ilgilendiğiniz mRNA üretiliyorsa bu, o dokuda ilgili genin aktif olduğunu yani genin okunduğunu gösterir. mRNA’yı belirleyebilirseniz hangi genin okunduğunu kolayca anlayabilirsiniz.

6 Antisense RNA RNA zincirinin komplomenteri zincir

7 Antisens mRNA’lar protein sentezini durdurmak amacıyla kullanılabilir

8 Tek zincirli DNA ve RNA nasıl belirlenir?

9 Kromozom üzerinde hibridizasyon

10 Etiketler Digoxigenin (DIG, Roche) Sıklıkla kullanılır
Antikorlar tarafından belirlenir Biotin Avidin ile belirlenir 2,4-dinitrophenyl (DNP, PerkinElmer) Floresans etiketler

11 Enzimler Alkalin fosfataz Peroksidaz En hassas görüntüleme sistemidir
Bazı memeli dokularında mevcuttur En yaygın substratı: NBT/BCIP (nitroblue tetrazolium / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), koyu mavi renk Floresans substrat: ELF-97 (Molecular Probes) Peroksidaz Değişik memeli dokularında bulunur Yaygın substratı: DAB (diaminobenzidine), kahverengi

12

13 Nükleik asitlerin hücredeki yerlerinde saptanması ne işe yarar?
Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında, Kromozom yapı ve hatalarının analizinde, Kromozomların ve genomun yapı ve işlevinin araştırılmasında, Gen anlatımının belirlenmesinde, Eşey tayininde, Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında, Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerinin belirlenmesinde önemlidir.

14 ISH’ın başlıca aşamaları
1 Biyolojik materyalin hazırlanması Probun işaretlenmesi 2 Probun ve materyalin denetürasyonu 3 Melezleme 4 Yıkama 5 Saptama 6 Görünür hale getirme

15 Materyale Uygulanan Ön İşlemler
Hibridizasyondan önce, Probun hedef olmayan nükleik asitlerle melezlenmesini engellemek Proteinlerle veya diğer elemanlarla spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak için materyale aşağıdaki işlemler uygulanır: RNaz Uygulaması Asetilleme Dokuyu Geçirgen Hale Getirme (Permeabilizasyon) Endojen enzimlerin etkisiz hale getirilmesi Melezleme öncesi fiksasyon

16 RNaz Uygulaması DNA dizilerini saptamak amacıyla yapılan çalışmalarda sitoplazma ve nükleusdaki RNA’ların probla melezlenmesini önler ve endojen RNA’nın temizlenerek istenmeyen zemin boyanmasını azaltmayı sağlar.

17 Asetilleme Bu işlem genellikle RNA/RNA ISH için uygundur.
Trietanolamin+asetik anhidrid uygulamasıyla asetilleme (+) yüklü molekülleri nötralleştirir ve poli-L-lizin kaplı lamlar kullanıldığına probun lama özgün olmayan bağlanmalarını önler. Endojen biyotini de yok eder (Aksi halde zemin boyanmasına neden olabilir )

18 Dokuyu Geçirgen Hale Getirme (permeabilizasyon)
Proteaz Uygulaması Proteazlar (pronaz E, proteinaz K, pepsin/HCl) prob ve saptama belirtecinin dokuya girebilmesine yardım eder. Hedef nükleik asitleri maskeleyen proteinleri sindirerek etki ederler. Proteolitik enzim uygulaması dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir. Konsantrasyon yetersiz olursa normalin aItında melezleme gerçekleşir; bu durumda konsantrasyon artırılabilir. Morfolojinin bozulması halinde ise konsantrasyonun düşürülmesi gerekir.

19 HCl Uygulaması Bazı yöntemlerde kullanılır. Kesin etkisi bilinmemekle beraber proteinlerin ekstraksiyonunu ve hedef dizilerin kısmen hidrolizini sağlayarak sinyalin artmasına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Deterjan Uygulaması Diğer işlemlerin lipid ekstraksiyonunda yetersiz kaldığı düşünüldüğünde kullanılır. Triton X-100, sodyum dodesil sülfat

20 Endojen Enzimlerin Etkisiz Hale Getirilmesi
Prob işaretleyici olarak herhangi bir enzim kullanılmış ise dokudaki endojen enzim etkisiz hale getirilmelidir. Örneğin, peroksidaz için, kesitlere % 1 H2O2, alkalin fosfataz için substrat solüsyonuna levamisol eklenir.

21 Melezleme Öncesi Fiksasyon (prehibridizasyon)
Proteaz uygulamasından sonra materyali paraformaldehit ile tekrar fikse etmek yararlı olur. Melezleme öncesi fiksasyon hücredeki DNA ve RNA'nın daha sonraki işlemler sırasında kaybını önlemek için yapılır.

22 ln situ Melezleme Problarının Seçimi
lSH'da kullanılacak probların seçilmesinde iki temel nokta vardır: Prob olarak kullanılacak nükleik asidin tipi Uygun işaretleme cinsi

23 Prob Tipleri Prob olarak hazırlanan nükIeik asitler; çift iplikli DNA (dsDNA), tek iplikli DNA ssDNA), tek iplikli RNA ve oligonükleotidler olarak sınıflandırılabilirler . Kromozomlar üzerinde gerçekleştirilen lSH'da ve viral DNA tayinlerinde genellikle DNA probları, mRNA tayinlerinde ise tek iplikli RNA probları veya oIigonükleotidler tercih edilmektedir. Problar izolasyon/ klonlama, in vitro transkripsiyon veya kimyasal sentez yolu ile elde edilebilirler.

24 Prob Tipleri DNA probları: Yüksek spesifik aktivite gösterir.
Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir. RNA probları: RNA-RNA hibridleri en stabil hibridlerdir. RNA probları düşük stabilite gösterir ve RNaz’larla kolaylıkla yok edilebilirler. Oligonükleotid probları : Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak dizayn edilir. Problar çok stabildir. Küçük boyutundan dolayı hedefe kolayca girebilir.

25 Prob Uzunluğu Maksimum melezleme oranı uzun problar ile elde edilir. Ancak lSH'da kısa problar gereklidir. Çünkü, probun hücre veya kromozomlar çevresindeki yoğun matriksten geçerek hedefe ulaşması gerekmektedir. Probların 500 ve üzerinde baz uzunluğuna sahip olanları birçok doku için en iyi sinyali verir. Çok kısa problar ise çok zayıf sinyal verirler, bazen de istenmeyen işaretlere neden olabilirler. Dokunun özelliği, fiksasyon tipi, melezleme öncesi işlemlerinin uygulanıp uygulanmamasına göre de prob uzunIuğunun seçimi değişir. OligonükleotidIer tek iplikli oluşları ve çok iyi penetrasyon özelliklerine sahip olmalarından dolayı lSH için oldukça avantajlı problardır.

26 Probun İşaretlenmesi İzotopik işaretleme İzotopik olmayan işaretleme

27 İzotopik İşaretleme İşaretleme radyoaktif madde ile yapılır ve işaretin belirlenmesi için otoradyografi kullanılır. Reaksiyon sonucunun hızına, prob stabilitesine ve çalışılan konuya göre farklı tipte izotoplar kullanılır. H3 işaretli problar; subsellüler uygulamalar kullanılır, yüksek çözünürlüğe sahiptir. İşaretli problar birkaç yıl saklanabilir. S35 lSH'da en yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretlemedir. S35 işaretli problar, özellikle hücresel uygulamalar için uygundur. Otoradyografi işlemi 1 hafta sürebilir. İşaretli prob birkaç ay içinde tüketilmelidir. P32, geniş çaplı alanlar için uygulanır. İşaretli problar bir hafta kullanılmalıdır.

28 İzotopik Olmayan İşaretleme,
İşaretleme radyoaktif olmayan maddelerle yapılır ve işaretin tayini için immünohistokimyasal yöntemler kullanılır. İzotopik olanlara göre avantajları, İşaretli probların 6 ay veya daha uzun süreli olarak -20°C'da sakIanabilmesi, çözünürlüğün yüksek olması, hızlı sonuç alınması, daha fazla sayıda işaretleme yöntemi bulunması ve daha güvenilir olmasıdır. Dezavantajları ise; duyarlılığının izotopik işaretlemelerden daha az olması ve istenmeyen bağlantılara daha fazla yol açabilmesidir.

29 Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlarla yapılır
Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlarla yapılır. En yaygın kullanılan işaret maddeleri; İşaret molekülü Tayin Yorum BİOTİN DİGOKSİGENİN ENZİM (Peroksidaz, alkalin fosfataz) FLUORESEİN (FITC/ TRITC)

30 lSH'da Kullanılan Probların Enzimatik İşaretlenmeleri

31 Hapten işaretli problar mRNA lSH için güvenilirlik, yüksek stabilite, hızlı sonuç verme ve tek hücre çözünürlüğü gibi avantajlara sahiptirler. En duyarlı yöntem, özgün bir antikora uygun olan bir haptenin, bir nükleotid türevine bağlanması ile gerçekleştirilir (örneğin, digoksigenin ddUTP veya dUTp'ye bağlanır) Melezleme ve yıkamaları takiben doku bir enzime bağlı olan ve hapteni bağlayan bir protein ile inkübe edilir. Daha sonra sinyal bu enzim için uygun substratın kullanılması sonucunda, ürünün renklendirilmesi şeklinde elde edilir. Bu işlem fluoresein işaret maddesinin kullanımı için de benzer şekildedir. İşaret fluoresan mikroskobunda gözlenir.

32 Denatürasyon, Melezleme ve Yıkamalar
Melezleme Öncesi İşlemler (Prehibridizasyon) Zemin boyanmasını önlemek için genellikle prehibridizasyon gereklidir. Prehibridizasyon solüsyonu, prob ve dekstran sülfat dışında melezleme karışımındaki tüm elemanları içerir.

33 Denatürasyon DNA/DNA ISH için prob ve hedef dizilerin denatürasyonu gereklidir. Denatürasyon asit, ısı veya alkali uygulamasıyla yapılır. Alkali maddeler biotinli problarla kullanılmaz. lsı ile denatürasyon, uygulamanın basitliği ve daha etkili oluşu nedeniyle en çok kullanılan yöntemdir. Denatürasyon işlemleri genellikle morfoloji kaybına neden olur. Bu nedenle, hedef DNA'nın denatürasyonu prob denatürasyonuna göre daha kritik bir işlemdir.

34 Melezleme (Hibridizasyon)
Prob ve hedef nükleik asitler tek iplikIi hale getirildikten sonra, DNA/ DNA melezleri için 37°C’ da ve RNA/RNA melezleri için 50-55°C'da bir gece inkübasyona bırakılırlar. Bu sıcaklıklar genellikte Tm değerinin 20-25°C altındadır. Radyoaktif lSH'da nükleik asit probunun her kilobazı için ngµl-1 prob konsantrasyonu önerilmektedir. Prob ne kadar uzunsa konsantrasyonu da o kadar yüksek olacaktır. Genellikle radyoaktif olmayan yöntemlerle işaretlenmiş problar daha yüksek konsantrasyonlarda (klonlanmış problar için ngµl-1, genomik problar için ngµl-1 ) kullanılır.

35 İşaretlenmiş nükleik asit probları, formamid, dekstran sülfat, bloke edici DNA veya tRNA, sodyum dodesil sülfat, sığır serum albumini ve çeşitli tuzlar içeren bir melezIeme karışımı içine konur. Formamid, denatürasyon ve melezleme solüsyonlarında kullanılır. Reaksiyonun doku morfolojisini bozmayacak bir sıcaklıkta gerçekleşmesini sağlar ve aynı zamanda reaksiyonun özgünlüğünü de etkiler. Dekstran sülfat, melezlenme oranını artırır. Kuvvetli su çekici özelliği ile melezleme solüsyonunda bir matriks oluşturur. Prob bu matriksin dışında kalır ve konsantrasyonu artar

36 İşaretlenmemiş bloke edici DNA ve tRNA probun özgün olmadığı bölgelerde melezlenmesini önlemek için kullanılır. Bunlar genellikle som balığı sperm DNA'sından elde edilmektedir. Bu diziler, dokudaki pozitif yüklü elemanlarla elektrostatik bağlar oluşturur ve prob ile bu tip bağlantıların oluşma olasılığını azaltır. Sodyum dodesil sülfat (SDS), probun dokunun içine girmesine yardım eder. Sığır serum albumini (BSA), probun dokuyla özgün olmayan etkileşimlerini azaltır. Tuzlar, melezleme ve denatürasyon solüsyonlarının iyonik gücünü ayarlar ve nükleik asit melezlerini sağlamlaştırır.

37 Melezleme oranı prob uzunluğuna, konsantrasyonuna ve dizinin kompleksliğine bağlıdır. Genellikle uzun problar materyal içine difüzyonun güçlüğü nedeniyle daha yavaş melezlenmeye sebep olur. Melezleme oranı dekstran sülfat kullanılarak artırılır. Melezlenme yaklaşık 3-5 saatte tamamlanmakla beraber, bir gece inkübasyon daha uygundur.

38 Reaksiyonun kesinliği ve kuvveti Bir lSH deneyinin kesinliği ("stringency") prob ve hedef nükleik asitteki hatasız eşleşen nükleotid oranını belirler. Reaksiyonun kesinliği sıcaklık, iyonik şartlar ve formamid gibi, çift sarmalı ayıran moleküllerin melezleme karışımı ve melezleme sonrası yıkama solüsyonlarındaki konsantrasyonu ile kontrol edilir. Reaksiyon sıcaklığı yüksek ve katyon konsantrasyonu düşük ise bu koşullar yüksek kesinlik koşullarıdır ve reaksiyonun özgünlüğü artar. Aksine reaksiyon sıcaklığı azaltılır, yüksek katyon konsantrasyonları uygulanırsa (düşük kesinlik koşulları) başka homolog diziler ile eşleşme gerçekleşebilir, yani reaksiyonun özgünlüğü azalır.

39 Melezlenme Sonrası Yıkamalar (Posthibridizasyon)
Melezleme sonrası yıkamalar zayıf bağlanan probu temizlemek ve sadece doğru eşleşmiş olanları bırakmak amacıyla uygulanır. Genellikle önce düşük sonra yüksek "stringency" yıkamaları yapılır. Böylece önce zayıf melezlenmiş veya melezlenmemiş prob ve melezleme solüsyonunun diğer elemanları temizlenir; daha sonra tuz konsantrasyonu düşük ve sıcaklığı yüksek yıkamalar ile probun melezleme özgünlüğü son bir kez düzenlenmiş olur. RNA/RNA melezlemesi için ek bir işlem daha uygulanır. RNA probları yapışmaya eğilimlidir ve bu nedenle yoğun zemin sinyali oluştururlar. Bu amaçla melezleme sonrası RNaz uygulaması yapılır.

40 ln situ Melezleme Bölgelerinin Saptanması
Yıkama işleminden sonra melezleme bölgeleri saptanır. Saptama ve görünür hale getirme yöntemleri probu işaretlemede kullanılan işaretleyicinin tipine bağlıdır. Radyoaktif işaretli probların saptanması için otoradyografik yöntemler, radyoaktif olmayanlar için ise immünohistokimyasal yöntemler kullanılır.

41 radioactive in situ Hybridization
35S labelled probe mRNA

42 Radyoaktif Olmayan Probların Saptanması
Doğrudan ve dolaylı olmak üzere iki çeşittir. Doğrudan yöntemde işaret, doğrudan doğruya nükleik asit probuna bağlanır ve hedef nükleik asitle melezlemeden hemen sonra mikroskop altında görülebilir. Doğrudan yöntemlerde prob ile işaretleyici molekül arasındaki bağın melezleme ve yıkamalar sırasında uygulanan oldukça tahrip edici koşullara dayanması temeldir. Ayrıca işaretleyici molekülün melezleme reaksiyonunu engellememesi gereklidir.

43 Dolaylı yöntemde proba bağlanan işaretleyici molekül doğrudan doğruya görülemez. Melezlemeden sonra ikinci bir molekül (haberci molekül) probdaki işaretleyiciye bağlanır ve böyIece probun melezIenme bölgeleri görünür hale getirilir. Bu yöntemde de probu işaretleyici molekül, melezleme reaksiyonunu engellememelidir. Ayrıca haberci molekülün kolay saptanabilmesi gereklidir.

44 Radyoaktif olmayan prob işaretlerinin çoğu immünojeniktir ve immünohistokimyasal yöntemler ile saptanabilir. En çok kullanılan radyoaktif olmayan işaretler biotin ve digoksigenindir. Bunlar kendilerine karşı oluşturulan antikorIar (örneğin, antidigoksigenin) ile saptanabilirler. Biotin için ise iki saptama sistemi vardır; bunlar anti-biotin antikorIarı ve biotin-(strept)avidin sistemleridir.

45 İmmünohistokimyasal Yöntem
Probla melezlenme bölgeIerinin görülebilmesini sağlayan, sinyal oluşturan sistemler (haberci moleküller), işarete karşı oluşturuIan birincil (primer) bir antikora bağlanabilirler. Bu yönteme tek aşamalı saptama yöntemi denir.

46 İki aşamalı yöntem ise primer antikorun elde edildiği türe karşı oluşturulan ikincil (sekonder) bir antikor, haberci molekülü taşımaktadır. Bu yöntem tek aşamalı olana göre genellikle daha duyarlıdır. Çünkü her primer antikora sinyali taşıyan birkaç sekonder antikor birden bağlanabilir

47 Biotin - (strept)avidin sistemi
Avidin yumurta akından elde edilen ve biotine karşı aşırı ilgisi olan bir glikoproteindir. Haberci molekülü veya sinyali içeren avidin biotin işaretli proba bağlanır (1) (2) Biotinli antiavidin antikoru eklenir (3) Sinyal oluşturucu sistemi içeren başka bir avidin tabakası eklenerek sinyal artırılır.

48 Bu şekilde sinyal ileri derecede artırılmış olur
Bu şekilde sinyal ileri derecede artırılmış olur. Avidinin yerine kullanılabilen streptavidin ise Streptococcus avidini'den elde edilir. Avidinden farklı oIarak yüksüz bir moleküldür ve özgün olmayan elektrostatik bağlanmalar daha az oluşur. Bununla beraber biotine ilgisi avidininkine göre daha azdır ve daha dayanıksızdır.

49 Sinyal oluşturan sistemler (haberci moleküller)
Prob melezIeme bölgeIerinin görünür hale gelmesi, antikora veya (strept) avidine bağlanan sinyal oluşturan sistemlerle (haberci moleküllerle) sağlanır. Bu sistemler fluorokromlar, enzimler ve metaller olmak üzere üç temel gruba ayrılır 17-aminometil-kumarin-3-asetik asit; 2fluoresein izotiyosiyanat

50 Uygun dalga boyundaki ışıkta fluoresan yayan fluorokromların
streptavidine veya antikorlara bağlanabilen çeşitli tipIeri vardır. En çok kullanılanlar; fluoresein izotiyosiyanat (FITC) yeşil, Teksas kırmızısı ve rodamin kırmızı, amino-metil- kumarin asetik asit (AMCA) ise mavi renkte fluoresan yayarlar. yüksek duyarlılık, çözünürlüğün daha iyi oluşu, kantitatif çalışmaya uygunluğu birden fazla probun aynı anda saptanması bu yöntemin üstünlükleridir morfolojik görüntünün zayıflığı, sinyalin çabuk solması nedeniyle sonuçların hemen fotoğrafla saptama zorunluluğu gibi bazı sakıncaları vardır.

51 En çok kullanılan enzimler peroksidaz ve alkalin fosfatazdır.
Enzimlerle sinyal oluşturan sistemler, melezleme bölgesinde, görülebilen bir ürünün çökelmesini sağlayarak işlemektedir. En çok kullanılan enzimler peroksidaz ve alkalin fosfatazdır. Enzimlerle saptama yöntemlerinin temel üstünlüğü; reaksiyon ürününün dayanıklılığı nedeniyle uzun süre saklanabilen preparatlara olanak vermesi morfoloji daha iyi görüldüğü için melezlerin kesin yerleşimi belirlenebilmesi sinyalin normal ışık mikroskobuyla gözlenebilmesi

52 KulIanılacak enzimin seçimi materyale bağlıdır
KulIanılacak enzimin seçimi materyale bağlıdır. Bazı dokularda endojen enzimler istenmeyen zemin boyanmasına neden olabilir. Endojen peroksidazın sorun olduğu dokularda (örneğin, eritrositler, nötrofiIler, makrofajlar) bu enzimin aktivitesi periyodat ve borohidrit, sodyum nitroferrisiyanit veya fenil hidrazin ile önlenebilir. Endojen alkalin fosfataz ise plasenta ve barsak dokularında bulunur. Plasenta dokusundaki alkalin fosfatazın aktivitesi, kesitlere levamisol uygulaması ile, bağırsak dokusundakinin ise % 20 asetik asit veya 0.2 N HCl ile önlenir.

53 Yabanturpu (Horseradish) peroksidaz (HRP) genellikle sekonder antikora bağlanır (iki aşamalı yöntem) ve en çok kullanılan substrat diaminobenzidindir (DAB). Reaksiyon sonunda iyi görülebiIen kahverengi bir çökelti oluşur. Saptama duyarlılığı peroksidaz/anti-peroksidaz (PAP) yöntemi kullanılarak artırılabilir. PAP; HRP iIe antikorun oluşturduğu bir komplekstir.

54 Alkalin fosfataz için, BClP/NBT (5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat/nitroblue tetrazolium) reaksiyonu oldukça duyarlıdır. Bu reaksiyon sonucu prob melezleme bölgeIerinde mavi bir çökelti oluşur. PAP kompleksine benzer şekilde kullanılan alkaIin fosfataz/anti-alkalin fosfataz (APAAP) kompleksi, prob saptama duyarlılığında artış sağIar.

55 non-radioactive in situ Hybridization
DIG: Digoxigenin (Hapten) AP: Alkaline Phosphatase DIG labelled probe mRNA anti-DIG AP BCIP + NBT purple precipitate Geffers, L.

56 situ Hybridization with TSA
DIG: Digoxigenin (Hapten) POD: Horseradish Peroxidase AP: Alkaline Phosphatase DIG labelled probe mRNA anti-DIG POD Tyramid Biotin Tyramid Biotin Tyramid Biotin Tyramid Biotin Neutravidin AP purple precipitate BCIP + NBT Geffers, L.

57 Metaller lSH için en çok kullanılan metal kolloidal altındır. Bu metal streptavidin ve antikorlara bağlanmış olarak kullanılır ve hem ışık hem de elektron mikroskop düzeyinde görülebilir. lşık mikroskobu düzeyinde, altın probları ile saptamanın duyarlılığı gümüşle çoğaltma yöntemi ile artırılabilir. Elektron mikroskop düzeyinde kolloidal altının enzimlerle oluşturulan çökeltilere göre birçok üstünlüğü vardır.

58 Farklı büyüklükte altın tanecikleri birlikte kullanılarak aynı anda birden fazla dizi saptanabilir. Bu metal tek tek yuvarlak tanecikIer halinde gözlenebildiğinden bunların sayılması ile kantitatif değerlendirme imkanı vardır. Ayrıca sinyal en yüksek çözünürlükte saptanır. Fakat bu yöntemin duyarlılığı diğer saptama yöntemlerine göre daha azdır. Ferritin ve hemosiyanin gibi diğer metallerle saptama yöntemleri de vardır. Ancak bunların boyutları kolloidal altın kadar iyi kontrol edilemediğinden daha az kullanılırlar.

59 ln situ Melezlemede Kontrol
ISH deney sonuçlarının doğru olarak yorumlanabilmesi ve güvenilirliği açısından çok dikkatli davranılmalı ve işlem sonuçlarından emin olmak için çeşitli kontroller yapılmalıdır. Spesifik olmayan prob bağlanma kontrolü Tayin ayıraçlarıyla kontrol Üretkenliğin kontrolü Hedef dağılımın kontrolü

60 Melezleme reaksiyonlarında, problar ile hedef olmayan nükleik asit dizileri arasında, olası homolojilerden dolayı istenmeyen sonuçlar ortaya çıkabilir. Ayrıca probun G-C bakımından zengin bölgeleri ile hedef olmayan nükleik asitler arasındaki melezleme de yanlış pozitif sonuç verebilir. Böyle hatalı melezleme reaksiyonlarının önlenmesi için prob dizisinin çok dikkatli seçilmesi ve kontrol probların kullanılması gereklidir.

61 Melezleme öncesi uygulamalarda yer alan RNaz veya DNaz ile sindirme DNA veya RNA gibi hedef nükleik asitlerin varlığının saptanmasında önemli bir kontroldür. Enzim uygulamaları çok dikkatli yapılmalıdır. Nükleaz uygulamasından sonra hedef nükleik asitin ortadan kaldırılmasını takiben, eğer enzim dokudan tam olarak giderilememiş ise daha sonraki aşamada probu da sindireceğinden melezleme sinyali gözlenemez.

62 İstenmeyen meIezleme sinyallerinin bir kısmı da probların spesifik olmayan hücresel bölgelere bağlanması ile ortaya çıkabilir. Bu duruma, proteinler ile prob arasındaki elektriksel çekimler yol açabilir. Bir diğer prob-protein ilişkisine DNA'ya bağlanan proteinler neden olabilir. Bu gibi özgün olmayan ilişkiler, hücresel nükleik asitlerle melezlenmeyen negatif kontrol problar kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Bunlara ek olarak, histokimyasal veya immünohistokimyasal tekniklerdeki bir hata yanlış pozitif sonuçlar doğurabilir. Bu da prob içermeyen melezleme tamponu ile inkübe edilen kesitlere işaret tayin sistemlerinin uyguIanması ile kontrol edilebilir. Ayrıca immünolojik tayin sistemlerinde kullanılan enzimlerin, dokuda endojen olarak varlıkları dikkate alınmalı; gerekirse bir başka enzim seçilmeli ya da prehibridizasyon aşamasında endojen enzim maskelenmelidir.

63 Kontrol probları olarak sense veya antisense oligonükleotidler, ayrıca rastgele dizili oligonükleotidler ve oligo d(T) veya d(A) kullanılabilir. Oligo d(T) probları, dokudaki mRNA'nın korunmuşluğu ve hücresel aktivitesi hakkında önemli bilgi veren poliadenil RNA'ları tayin etmek için kullanılır. Bu aynı zamanda lSH protokolünün optimizasyonunda kullanılan bir adımdır.

64 In Situ Melezlemede Ortaya Çıkan Sorunlar ve Çözümleri
Olası nedenler Çözüm 1) Kesitlerin düşmesi 2) ISH reaksiyon işaretlerinin yokluğu veya azlığı

65 Sorun Olası nedenler Çözüm 2) ISH reaksiyon işaretlerinin yokluğu veya azlığı 3) Kesitte özgün olmayan, çok fazla işaret olması (istenmeyen zemin boyanmaları)

66 ISH Protokolü (Eichele Lab.’ın protokolünden)
1. Örneklerin hazırlanması ve dokunun fiksasyonu, 2. Ön hibridizasyon işlemi, probların ilavesi ve hibridizasyon işlemi, 3. Son hibridizasyon işlemi ve spesifik olmayan bağlanmaların giderilmesi, slaytların bir seri çözeltiden geçirilerek fikse edilmesi ve üzerlerinin lamelle kapatılması, örneklerin mikroskopta incelenip uygun olanlar taranarak genel kullanım için internet ortamına aktarılması.

67 Slâytların sandviç şeklinde hazırlanmasında kullanılan özel camlar bir gece 180°C sıcaklıktaki fırında bekletilir. Kullanılan bütün çözeltilerin büyük bir kısmı otoklavlanır veya özel şekillerde hazırlanır. RNA’ları korumak için DEPC’li su kullanılır ve böylece RNase’a karşı korunur. Fare embriyosu fareden alındıktan sonra OCT (optimal freezing medium) içine gömülür. Bu amaçla özel alaşımlı kablar kullanılır. Bu özel kablar içine konulduktan sonra ani dondurmayla dondurulan embriyo -70°C saklanır.

68 Mikroton cihazı kullanılarak lamlar üzerine fare embriyoları Cryosections cihazıyla 20 µm kesitler halinde yayılır.

69 Slaytlar robota yerleştirilir ve Prehibridizasyon işlemi yapılır.
NBT/BCIP kullanarak renk reaksiyonu uygulanır. İşlemler robotto otomatik şekilde yapılır. Cihaz bilgisayar programı ile kontrol edilir. Slâytların hazırlanma şekli (sandviç); slâyt resminde slâyt ile kullanılan cam arasındaki boşluk 80 μm

70 İn situ hibridizasyon işlemlerinin basamaklar halinde gösterilmesi
Prehybridization/Hybridization fresh frozen tissue sections are fixed in 4% PFA , acetylated and dehydrated before they are used on the robot cycles T (min) volume Reagent l. class container temperature 5 5 min. 300 H2O2 in MeOH ethanol 325 24º C 7 PBS (1) water 1000 2 0.2M HCl 200 4 PBS (2) 1 400 PK buffer 10 min. Proteinase K in PK buffer PBS (3) 4% PFA (1) PBS (4) 15min hyb-mix (1) hyb-mix 15 min. heat up to 64º C - 64º C 330 min probe hybridization probe Robot Geffers, L.

71 Posthybridization Robot Geffers, L. cycles T (min) volume Reagent
l. class container temperature 5 5 min. 300 5 x SSC water o/n 450 62º C 10 min. 350 formamide I 12 min. formamide II 3 8 min. 0.1 x SSC (1) 1 0.1 x SSC (2) 24º C Robot Geffers, L.

72 Immuno and TSA Robot Geffers, L. cycles T (min) volume Reagent
l. class container temperature 4 5 min. 300 NTE (1) water o/n 1000 24º C 6 20 mM iodoacetamide (1) 325 NTE (2) 2 TNT (1) 5 min 4% sheep serum (1) 200 TNT (2) 10 min. TNB blocking buffer TNT (3) maleate wash buffer (1) 350 blocking reagent maleate wash buffer (2) 250 TNT (4) 3 TMN 30 min antiDIG-POD 1 25 min tyramide-biotin - water 20 min Neutravidin Robot Geffers, L.

73 Color Reaction Robot Geffers, L. cycles T (min) volume Reagent
l. class container temperature 2 5 min. 400 TMN water 325 24º C 3 10 min 350 BCIP/NBT 200 x System liquid (1) System liquid 1 300 NTE (3) 1000 10 min. 4% PFA (2) System liquid (2) Robot Geffers, L.

74 Slâytlar bir gece bekledikten sonra slâyt kaplama makinesinde yüzeyleri kaplanarak kurutulur. Daha sonra slâytlar mikroskopta incelenir ve sonra taranarak bilgisayar ortamına alınır. C A): Slâyt kaplama makinesi, (B): Slâytları incelemede kullanılan mikroskop, (C): Slâytların taramasının yapıldığı scanner cihazı

75 Geffers, L.

76 Gene Expression E14.5 Trp63 Runx1 MyoD Slc25a37 P7 Pax6 Geffers, L.

77 Atlas Building Geffers, L.

78 in situ hybridization with a 35S-radioactive
In situhybridization of BDNF, c-Fos and Arg3.1/arc in adult rat cochlea and AC. - HRP-DAB System Tan, J. et al. Neuroscience Yamamoto, N. et al. Neuroscience

79 Bütün Halinde Hazırlanan Preparatlar (whole mount ISH)
Bir organizmanın tümünü (örneğin Drosophila embriyoları, bezelye embriyoları vb.) araştırmak iç̧in, 1 -2 mm büyüklüğündeki parçalar fikse edilir. Bu şekilde hazırlanan preparatlarda prob ve saptama belirtecinin materyale girmesinde karşılaşılan sorunların aşılması için örneğin; bitki hücreleri selülaz ve pektinaz gibi hücre duvarını sindiren enzimler ile ön işleme tutulabilir .

80 whole mount ISH protokolü
zebrafish embryos Thisse, C. and Thisse, B. (2008) High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3: 59 – 69

81 Thisse, C. and Thisse, B. (2008) High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3: 59 – 69