Kromatografik Ayırmalar Kromatografi, bütün bilim dallarında uygulama alanına sahip güçlü bir ayırma yöntemidir. Kompleks karışımlarda bulunan birbirine yakın özellikteki bileşenleri ayırmak, teşhis etmek ve tayin etmek için kullanılan bir çok farklı ve önemli yöntemler grubunu kapsar. Rus botanikçi Mikhail Tswett (1872-1919) tarafından bulunmuş ve isimlendirilmiştir. (Yunancada Chroma: renk ve Graphein: yazmak anlamına gelmektedir.) Kromatografi tekniğini geliştirmelerinden dolayı 1952 yılında A.J.P. Martin ve R.L.M. Synge’ye Nobel ödülü verilmiştir. Numune, gaz, sıvı veya süperkritik akışkan bir hareketli fazda (mobil faz) çözülür. Bu hareketli faz sonra, bir kolonda veya bir katı yüzeyde sabitleştirilmiş kendisi ile karışmayan bir durgun faz (sabit faz) içinden geçmeye zorlanır. Bu iki faz numune bileşenlerinin hareketli ve durgun fazlarda farklı oranlarda dağılmasını sağlayacak şekilde seçilir. Durgun faz tarafından farklı kuvvetlerde tutulan numune bileşenleri birbirlerinden nitel veya nicel olarak analizlenebilen farklı bantlar veya bölgeler şeklinde ayrılırlar.

Kromatografi temelde iki şekilde sınıflandırılır: Kolon kromatografisi: Durgun faz ince bir kolonda tutulur ve hareketli faz basınç veya yerçekimi etkisiyle bu durgun faz arasından geçmeye zorlanır. Düzlemsel kromatografi: Durgun faz düz bir plaka üzerine veya bir kağıdın gözenekleri arasına tutturulur ve bu durumda hareketli faz durgun faz arasından kapiler (kılcallık) veya yerçekimi etkisiyle hareket eder. Hareketli faza (çözücüye) elüent denir. Hareketli fazın ilerlemesiyle çözünen maddelerin durgun faz üzerinde taşınmasına ise elüsyon denir.

Kolon kromatografik yöntemlerin hareketli faz tiplerine göre sınıflandırılması:

Karışımı oluşturan komponentlerden durgun faza kuvvetlice tutunanlar, zayıf tutunanlara göre daha yavaş ilerler. B bileşeni durgun fazda daha kuvvetli tutunduğu için bu bileşen göç sırasında geride kalmaktadır. Komponentler görünür bantlar ya da bölgeler oluştururlar. Bantların ilerleme hızları hareketli fazda geçirdikleri zamana bağlıdır. Elüsyon zamanı (alıkonma süresi) veya hacmine karşı dedektör cevabından elde edilen grafiğe kromatogram denir. Bu grafikler hem nitel hem de nicel analizler için kullanılabilir. Bir kromatogramdaki pik sayısı, numunedeki bileşen sayısı kadardır. Kromatogramdaki zaman ekseni üzerindeki pikin yeri, onun hangi maddeye ait olduğunu, numune miktarı ile orantılı pikin alanı da, o bileşenin kantitatif ölçüsünü vermektedir.

HPLC için çalışma parametreleri Ayırma gücü (Rs), bir kolonun herhangi iki analiti ayırabilmesinin kantitatif bir ölçüsüdür. İki bant arasındaki uzaklığın, bant genişliği cinsinden değeri demektir. Ayırma gücüne göç hızı ve bant genişlemesi etki eder. Rs=2[(tR)B – (tR)A] / (WA + WB) Ahareketli ↔ Adurgun Çözünenin, durgun fazdaki derişiminin, hareketli fazdaki derişimine oranına dağılma sabiti veya partisyon oranı (Kc) denir. Kc, bir A türünün iki faz arasında dağılmasını ifade eden bir denge sabitidir. Kc = CD / CH Numune kolona verildikten sonra çözünenin dedektöre ulaştığı ana kadar geçen süreye ise alıkonma süresi (tR) denir. Kolonda hiç tutulmayan ya da hareketli fazda alıkonulmayan bir türün dedektöre ulaşması için geçen süreye ise ölü süre ya da boş süre (tM ya da t0) denir. Çözünenin kolondaki hızına ise alıkonma/kapasite faktörü (k) denir. Analitlerin kolondaki göç hızlarını karşılaştırmada çok işe yarayan önemli bir deneysel büyüklüktür. Bir A türü için k; kA = tR - tM / tM Hız ne kadar yüksek olursa, bantların (maddelerin) ayrışması o kadar zor olur. Bir kolonun A ve B gibi iki tür için seçicilik faktörü (α) ve KB ve KA, sırasıyla daha kuvvetle tutulan ve daha zayıf tutulan türler için dağılma sabitleri; α = KB/KA = kB /kA Ayırmayı iyileştirmenin en kolay yolu, çözücünün bileşimini değiştirmektir. Böylece alıkonma süresi uzar. HPLC için çalışma parametreleri

Kromatogram Sıvı ve gaz kromatografi için genel cihaz şeması

Kromatografinin Uygulamaları 1. Kalitatif analiz İçeriği tam olarak bilinen daha önce çalışılmış numunelerle aynı şartlarda çalışılarak karşılaştırma ile kalitatif analiz yapılabilir. Kromatografi kolonlarının UV, IR veya kütle spektrometrelerine doğrudan bağlanmasıyla kalitatif analiz yapılabilir.

2. Kantitatif analiz Kromatogramda analit pikinin yüksekliği veya alanı, konsantrasyonla doğru orantılıdır. Kantitatif kolon kromatografisi genel olarak, analit pikinin yüksekliği ya da alanının bir ya da daha fazla standardınki ile kıyaslanmasına dayanır. Pik yüksekliğine dayalı analizler (geniş piklerde) hatalara sebep olabilir. Pik alanına dayalı analizlerde ise pik genişlemesinden etkilenme olmaz. Standartlarla kalibrasyon: Bilinmeyenin bileşimine yakın bir dizi standart çözelti hazırlanıp, konsantrasyona bağlı standart grafikler çizilip bilinmeyenin bu grafik ile karşılaştırılması ile uygulanır. Standart ilave yöntemi: Hem standart hem de numuneye dikkatle ölçülmüş miktarda iç-standart ilave edilerek uygulanır.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) HPLC, bütün analitik ayırma teknikleri arasında en yaygın kullanılanıdır. Yöntemin bu kadar yaygın olmasının başlıca sebepleri, duyarlılığı, doğru nicel tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir olması, otomasyon kolaylığı uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen türlerin ayrımasına uygun olması ve hepsinden önemlisi endüstriyi, birçok bilim dalını ve halkı yakından ilgilendiren maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. HPLC’de, hareketli faz bir sıvı ve durgun faz ise çok küçük katı parçacıklardan oluşmuştur. Uygun akış hızları elde edebilmek için sıvıya birkaç yüz psi’lik veya daha yüksek basınçlar uygulanır. 1 atm = 760 mmHg = 14,7 psi (pound-force per square inch) Sıvı kromatografi, hareketli fazın sıvı olduğu başlıca dört ayrı temel kromatografi ile ilgilidir: Dağılma (Partisyon) kromatografisi (Sıvı-sıvı kromatografisi) Adsorbsiyon kromatografisi (Sıvı-katı kromatografisi) İyon-değişim kromatografi (İyon kromatografisi) Boyut ayırıcı (Jel-geçirgenlik veya Jel filtrasyon) kromatografisi

Sıvı kromatografinin uygulamaları

HPLC cihazı:

Hareketli faz (çözücü) hazneleri ve gaz giderme sistemleri HPLC cihazlarında bir veya daha çok cam veya paslanmaz çelikten yapılmış kaplar vardır ve her biri 500 mL’den daha fazla çözücü alacak kapasiteye sahiptir. Çözünmüş gazlar ve bulunabilecek toz partikülleri kolonlarda kabarcıklar oluşturarak pik genişlemesine sebep olabilir veya dedektör sisteminde girişim yaparak dedektörün performansını düşürebilir. Gaz giderme sistemi, bir vakum pompa sistemi, bir damıtma sistemi, ısıtıcı ve karıştırıcı sistemden oluşabileceği gibi düşük çözünürlükteki inert bir gazın küçük kabarcıkları yardımıyla çözünmüş gazların sürüklendiği üfleyici de olabilir.

Pompalama sistemleri HPLC pompalama sistemlerinde şu özellikler bulunmalıdır: 400 atm’e kadar basınç üretimi Puls içermeyen basınç çıkışı 0,1-10 ml/dakika aralığında akış hızları % 0,5 veya daha iyi tekrarlanabilirlikte akış kontrolü Korozyona dayanıklı parçalar

Numune enjeksiyon sistemleri HPLC’de ölçmelerin kesinliğini belirleyen faktör numunenin dolgu kolonuna sevkinin tekrarlanabilirliğidir. Bunun için numune hacmi 500 µL değerlerinden daha düşük olmalıdır. Ayrıca, numune sisteme basıncı düşürülmeden uygulanmalıdır. Pek çok modern kromatografi cihazında otoenjektörler bulunur. Bunlar numune kaplarından sıra ile numune alarak LC kolonuna enjekte edebilir. Uygulama iki şekilde yapılabilir: Akış durdurma enjeksiyonu: Çözücü akışı bir an durdurulup numune enjekte edilir ve tekrar basınç uygulanır. Kolaydır fakat enjeksiyonun tekrarlanabilirliği çok düşüktür. Çözücü akışının durdurulmadığı numune sarımı sistemi: 5-500 µL arasında numune enjeksiyonu yapılabilmektedir. Yüksek numune enjeksiyon tekrarlanabilirliğine sahiptir.

Kolonlar Düzgün iç çaplı paslanmaz çelikten oluşan kolonlar kullanılır. Kolonların çoğu 10-30 cm uzunluğundadır ve düzdür. İç çapları homojen olup, 4-10 mm kalınlığındadır. Gözenekli kolon dolgu malzemelerinin (silis, alumina, sentetik reçine gibi) mikrotanecik boyutu 3-10 µm arasındadır. Kolon sıcaklığının kontrolü genellikle gerekli değildir ve kolonlar oda sıcaklığında kullanılırlar. Fakat çoğu zaman kolon sıcaklığının derecenin onda birkaçı hata ile sabit tutulduğu zaman daha iyi kromatogramlar elde edilir. Bu yüzden modern cihazlarda 100-150oC’a kadar sıcaklık ayarının yapılabildiği termostat sistemleri mevcuttur. Bir de analitik kolonun ömrünü arttırmak ve kirliliklerden korumak amacıyla, analitik kolondan önce, genellikle emniyet kolonu adı verilen kısa bir kolon yerleştirilir.

Dedeksiyon sistemleri Sıvı kromatografi için ideal bir dedektörde aranan özellikler: Yeterli duyarlılık İyi bir kararlılık ve tekrarlanabilirlik 400 oC’a kadar varan sıcaklık aralığı Akış hızından bağımsız kısa cevap zamanı Yüksek güvenilirlik ve kullanım kolaylığı Her türden analite tahmini kolay ve seçici cevap verebilme Numuneyi parçalamamalı Bant genişlemesini azaltmak için minimum iç hacime sahip olmalıdır.

Sıvı kromatografi dedektörlerinin performansları

Elüsyon metotları Tek bir çözücü veya sabit bileşimdeki çözücü karışımı kullanılarak yapılan ayırma izokratik elüsyon, polarlıkları birbirinden farklı iki veya daha fazla çözücü sistemlerinin kullanıldığı ve ayırma sırasında bileşimlerinin değiştirildiği ayırma tekniğine ise gradient elüsyon denir. %50 su, %50 metanol karışımı Başlangıç karışımı: %60 su, %40 metanol Bir süre sonra metanol konsantrasyonu %8/dakika artırılmıştır.

Dağılma Kromatografisi Dört ayrı tip sıvı kromatografi içinde, en yaygın kullanılanıdır. Düşük ve orta mol kütleli iyonik olmayan polar moleküllerle ilgilidir. Bu teknik sıvı-sıvı kromatografi ve sıvı-bağlı faz kromatografi olarak ikiye ayrılır: Sıvı-sıvı kromatografide; durgun faz, katı dolgu parçacıkları yüzeyine adsorblanmış çözücüdür. Durgun faz, hareketli fazda çözünerek zamanla kaybolabilir. Gradiyent elüsyon için uygun değildir. Sıvı-bağlı faz kromatografide; durgun faz, katı dolgu parçacıkları yüzeyine kimyasal bağlarla tutturulmuş organik maddedir. Dağılma kromatografisi, hareketli ve durgun fazların bağıl polarlığına göre iki kısma ayrılabilir: Normal faz kromatografi; Durgun faz polar ve hareketli faz ise apolardır. Ters faz kromatografi; Durgun faz apolar (hidrokarbon) ve hareketli faz ise polardır (su, metanol, asetonitril, tetrahidrofuran gibi).

Normal faz kromatografide, en düşük polaritedeki bileşenler hareketli fazda nispeten çok çözündükleri için en öne elüe edilirler. Hareketli fazın polaritesindeki artış, elüsyon süresinin azalması ile sonuçlanır. Bunun aksine, ters faz yönteminde, en polar bileşenler, en önde yürür ve hareketli fazın polaritesindeki artış, elüsyon süresini arttırır. Bütün HPLC’nin dörtte üçünde, ters faz dolgu maddesi ile doldurulmuş kolonlar kullanılmaktadır. Ters faz ayırmaların üstünlüğü, hareketli faz olarak su kullanılmasının mümkün olmasıdır. Suyun ucuz olma, toksik olmama, UV geçirgenlik ve biyolojik türlere uygunluk gibi üstünlükleri vardır.

Dağılma kromatografisinin uygulamaları Alan Tipik karışımlar Farmasötikler Antibiyotikler, Sedatifler, Steroidler, Analjezikler Biyokimya Aminoasitler, Proteinler, Karbonhidratlar, Lipidler Gıda Ürünleri Suni Tatlandırıcılar, Antioksidantlar, Aflatoksinler, Katkı Maddeleri Endüstriyel Kimyasallar Kondanse Aromatikler, Yüzey Aktif Maddeler, Boyalar Kirleticiler Pestisitler, Herbisitler, Fenoller Adli Tıp İlaçlar, Zehirler, Kan Alkolü, Narkotikler Klinik Tıp Safra Asitleri, İlaç Metabolitleri, İdrar Ekstraktları, Östrojenler

Gaz Kromatografisi (GC) Gaz kromatografide, buhar haline getirilmiş bir numunenin bileşenleri, hareketli bir faz ile bir kolonda tutulan sıvı veya katı durgun faz arasında dağılması sonucu birbirinden ayrılır. Gaz kromatografide numune buharlaştırılır ve kromatografik kolonun girişine enjekte edilir. İnert bir hareketli gaz fazı ile elüsyon yapılır. Diğer kromatografik yöntemlerin aksine, hareketli gaz fazı analitik molekülleriyle etkileşmez. Gazın tek işlevi, analiti kolon boyunca taşımaktır. İki tür gaz kromatografi vardır: Gaz-sıvı kromatografi (GLC) Gaz-katı kromatografi (GSC) En yaygın olarak kullanılan gaz-sıvı kromatografisi olduğundan, ismi kısaltılarak GC olarak kullanılır. GSC, küçük mol kütleli gaz halindeki moleküllerin ayrılmasının dışında, fazla bir uygulama alanı bulamamıştır. GLC ise, analitin gaz halindeki hareketli faz ile inert bir katının yüzeyine veya kılcal bir borunun iç cidarına tutturulmuş durgun sıvı faz arasında dağılımı üzerine kurulmuştur. GC’de hareketli faz, taşıyıcı gaz olarak adlandırılır ve bu gaz kimyasal olarak inert olmalıdır. Argon, azot ve hidrojen de kullanılmasına rağmen, en yaygın kullanılan hareketli faz helyumdur. Bu gazlar basınçlı tüplerde piyasada bulunur.

GC de dolgulu ve kılcal (kapiler) olarak adlandırılan iki tür kolon kullanılır. Günümüzdeki uygulamaların pek çoğunda kılcal kolonlar kullanılmaktadır. Kromatografi kolonlarının boyu, dolgulu tüpler için 0,5-10 m, kapilerler için ise 5-100 m olabilir. Çoğu zaman paslanmaz çelik ve silis, daha seyrek olarak da cam veya teflondan yapılmış olanlar kullanılır. Sabit sıcaklık sağlamakta kullanılan bir etüve sığmaları için genellikle çapları 10-30 cm arasında değişen bobinler şeklinde sarılıdırlar. Ayrıca kolonlar sıcaklıklarının kontrol edilebilmesi için doğal olarak termostatlı bir fırın içinde tutulurlar.

Uçuculuğu sınırlı olan bazı analitler, kimi zaman daha uçucu maddeler olan türevlerine dönüştürülerek ayrılabilir. Yeterince iyi ayrılmayan uçucu maddeleri aha iyi ayırmak veya dedektör duyarlılığını artırmak için de bazen türevlendirilmeye başvurulabilir. Gaz kromatografide kullanılan ideal dedektörler şu özellikleri taşımalıdır: Yeterli duyarlılık İyi bir kararlılık ve tekrarlanabilirlik Geniş bir doğrusal çalışma aralığı 400 oC’a kadar varan sıcaklık aralığı Akış hızından bağımsız kısa cevap zamanı Yüksek güvenilirlik ve kullanım kolaylığı Her türden analite benzer cevap alınmalı Numuneyi parçalamamalı Yalnız hiçbir dedektör bu şartların hepsini birden sağlamaz. En fazla kullanılan dedektörler:

Gaz kromatografisi yöntemi, sadece uçucu bileşiklere uygulanabildiği halde, HPLC yöntemi uygun çözücü, kolon ve dedektör kullanılması durumunda bütün bileşiklere uygulanabilmektedir. LC’de yöntem geliştirilmesi, gaz kromatografiye göre daha zordur. Çünkü hareketli sıvı fazdaki numune bileşenleri durgun ve hareketli sıvı fazların her ikisiyle de etkileşir. Tersine gaz kromatografide hareketli faz ideal bir gaz olarak davranır ve ayırma işlemine herhangi bir katkısı olmaz. Bu durum, numune bileşenlerinin durgun fazda taşınmasını basitleştirir. Yani gaz kromatografideki ayırmalar, hareketli fazın helyum, azot ya da hidrojen olmasından önemli ölçüde etkilenmez. Bunun aksine, LC’de ayırma hareketli fazın asetonitril, hekzan veya dioksan olmasından etkilenir. Hareketli fazı analit ile etkileşen kromatografi işlemlerinde ayırmayı etkileyen üç aktif faktör (çözünen madde, hareketli faz ve durgun faz) arasındaki moleküller arası kuvvetler, uygun şekilde dengelenmelidir. Özet olarak, iyi bir kromatografik ayırmanın makul sürelerde gerçekleştirilmesi isteniyorsa, çözünen madde, hareketli faz ve durgun fazın polariteleri dikkatlice seçilmelidir. Bazı durumlarda da kromatografik ayırmadan önce veya sonra, bir numunenin bileşenlerini bir türevine dönüştürmek uygun olabilir. Polariteyi azaltmak ve seçiciliği arttırmak için türevlerin kullanılması önerilir. Türevleme yapılmışsa çoğu zaman, floresans, elektrokimyasal veya kütle spektrometrik dedektör gibi seçici dedektörler kullanılır.