ICSI için Sperm Seçiminde Yeni Yaklaşımlar Bio. Sevil ÜNAL Acıbadem Maslak Hastanesi Tüp Bebek Laboratuvarı

Rutin semen analizi erkek infertilitesinin tanımlanmasında sınırlı diagnostik değere sahiptir ve ART başarısı için prediktif değildir. Reviewed by Lewis, 2005 ; Lefievre et al, 2005 in Reproduction; in Top 10 downloaded reviews by 2008 ( ~ x3000)

Sperm DNA Fragmantasyon Testleri Acridine Orange (Darzynkiew et al,1975) SCSA (Evenson et al,1980) Aniline Blue, Toluidine Blue TUNEL (Gorczyca et al,1993) Chromomycin A3 (Manicardi et al,1995) Comet assay (Hughes et al,1996) DBD-FISH (Fernandez et al,1998) SCD (Fernandez et al,2003) Halosperm (Fernandez et al,2005) Bu testler DNA hasarlı spermlerin tespit edilmesinde kullanılan yöntemlerdir. Ancak DNA kırıklarını ve fragmentasyonlarını tespit etmemizi sağlayan testler MİKROENJEKSİYON SIRASINDA sağlıklı spermin seçilmesinde bir fayda sağlamamaktadır. Bunun için rutinde kullanılabilecek daha ileri yöntemlere ihtiyacımız vardır.

Konvansiyonel IVF de artan DNA hasarı ile döllenme oranı düşmektedir. ICSI de ise bu ilişki gözlenmemektedir. Sperm parametreleri IVF için uygun olan hastalarda artan DNA hasarı döllenme oranlarının azalmasına sebep olmaktadır. Bu ilişki ICSI vakalarında gözlenmemiştir.

ICSI’de gebe kalamayan hastaların oranı, artan DNA hasarı ile anlamlı olarak yükselmektedir. IVF sonuçlarında bu ilişki kurulamamıştır. ICSI sonucunda atlanan doğal döllenme sürecindeki olayların gebelikte ne kadar önemli olduğuna işaret etmektedir. IVF ve ICSI de artan DNA hasarı ile embriyo kalitesi arasında bir ilişki kurulamamıştır.

Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis Denny Sakkas,,Juan G. Alvarez Fertility and Sterility Vol. 93, Issue 4, 1 March 2010, Pages 1027–1036 1.Spermatogenez sürecinde oluşabilecek apopitoz yada anomaliler 2.spermiyogenez süreecinde sperm kromotinlerin tekrar modellenmesi sırasında DNA kırıklarının oluşması 3.spermin seminifer tübüllerden ve epididimden transportu sırasında post testikuler dna fragmentlerinin baslıca oksijen radikallerinin oluşumuna sebep olması 4.endogenik kaspazların ve endonukleazlarınn dna fragmentasyonunu indüklemesi 5.radyo ve kemoterapinin sebep olduğu DNA hasarı 6.çevresel toksinlerin sebep olduğu DNA hasarı

Güncel meta-analizler sonucunda, DNA hasarlı spermlerin IVF ve ICSI sonrası gebelik kayıpları ile de ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır. Vurgulanması gereken en önemli nokta: Tüp bebek tedavisi gereken hastaların spermlerinde daha yüksek DNA hasarı bulunma ihtimali yüksektir. ICSI işlemleri sırasında, doğal seleksiyon ve sperm yarışının atlandığı düşünülürse tedavide kullanılacak hasarlı spermin izole edilmesi veya uzaklaştırılması ve uygun kalitede sperm seçimi daha da önemli hale gelmektedir.

SPERM SEÇİM YÖNTEMLERİ Spermatogenez süreci ejekülatta yüksek oranda abnormalite gösteren spermlerin bulunmasına sebep olmaktadır. Bu anomalilere, nuklear ve kromozomal bozukluklara ek olarak membran, mitokondriyel sentriyolar bozukluklar da gösterilebilir. Bu anomalileri elimine edebilmiş spermatozoa nasıl seçilebilir? Akrozomal ve nuklear bölge vakuolleri ‘sitoplazmik’

Sperm hazırlık yöntemleri Effects of semen storage and separation techniques on sperm DNA fragmentation Jackson et al., 2010 Sperm sayısı çok az olduğu npn-obs azospemi ve çok ağır OAT olgularında sperm kaybı sebebiyle grad+swimup yapılamaktadır

İleri sperm seçim yöntemleri IMSI Bartoov et al, 2003, Berkovitz et al, 2005; Hazout et al, 2006, Mauri et al, 2010 MSOME Bartoov et al, 2002 Birefringence Gianaroli, Magli et al, 2010 HBA/PICSI/ SpermSlow Huszar et al, 2007; Nasr-Esfahani et al, 2008; Parmegiani et al. 2010 and b

IVF Doğal fizyolojiye en yakın in vitro fertilizasyon yöntemidir. Spermler ve yumurta aynı kültür ortamında inkübe edilerek döllenme elde edilir. İvf video

(Intra-cytoplasmic Morphologically-selected Sperm Injection ) IMSI (Intra-cytoplasmic Morphologically-selected Sperm Injection ) Yüksek büyütme (6600 x) gücüne sahip Nomarski modulasyonu ve dijital görüntüleme sistemi ile desteklenmiş bir invert mikroskop yardımıyla sperm seçimi yapılması yöntemidir. MSOME (Motile Sperm Organelle Morphology Examination) kriterlerine göre sperm değerlendirilmesi yapılmalıdır. Letter to New England Journal of Medicine: “Selection of spermatozoa with normal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperm injection” Benjamin Bartoov ve ark. (2001)

Toplam Büyütme Oranı=6600X 19” LCD monitor DIC condenser DIC slit Hot plate Cam dish 63X objective Magnifier Sperm örneğinin 100x objektif ile gözleyebilmek için “Cam Tabanlı ICSI Kabı”kullanılmaktadır. Yüksek büyütmede sağlamak amacıyla invert mikroskoba Nomarsky modulasyonu veya DIC modulasyonu eklenmesi gerekmektedir. MSOME (Motile Sperm Organelle Morphology Examination) kriterlerine göre sperm değerlendirilmesi yapılmalıdır. DIC polarizer Camera 100x objektif Ara büyütme lensi 1.0x, 1.5x, 2.0x Video kamera adaptör büyütmesi 0.99x 8 mm Diyagonal boyutlu CCD çip ve 355.6 mm diyagonal boyutlu Monitör (100 X 1.5 X0.99)x(350/8) = 6600 Büyütme

IMSI MSOME yönteminde sperme ait 6 farklı hücre organeli incelenmektedir. Akrozom Postakrozomal lamina Boyun Mitokondri Kuyruk Çekirdek; ICSI sonucunu etkileyen en önemli organeldir. Bartoov et al.,2002

IMSI MSOME morfoloji Kriterlerine Göre normal baş morfolojisi; Pürüzsüz Simetrik Oval şekilde (3-3.5 µm en , 4-4.5 µm boy) Çekirdek kromatin kütlesinin homojen olması (en fazla 1 vakuol ve çekirdeğin %4 den daha az alan kaplaması)

IMSI 4 step sperm morphology grading system for IMSI according to Head morphology Existence or absence of nuclear vacuoles No neck,mid-piece and tail abnormalities Vanderzwalmen et al., 2008

Grade I: Normal form and no vacuoles IMSI Grade I: Normal form and no vacuoles Grade II: Normal form and ≤ 2 small vacuoles SV %61.4 blastokist Grade I: normal morfoloji, tail midpiece defekti yok, vakuol yok Grade II: normal morfoloji, en fazla 2 küçük vakuol %56.3 blastokist SV

IMSI Grade IV: large vacuole and abnormal head shapes or other abnormalities Grade III: Normal form, >2 small vacuoles or at least one large vacuole LV LV %0 blastokist SVs LV SVs Grade III: Normal morfoloji, 1 büyük veya 2den fazla küçük vakuol Grade IV: Abnormal morfoloji, 1den fazla büyük vakuol ve diğer anomaliler(tail, midpiece) %5.1 blastokist

ŞİDDETLİ SPERM MORFOLOJİK DEFEKTLERİNDE IMSI İLE SPERM SEÇİMİ Triploidy TUNEL Round head Megalo head Elongated head

ŞİDDETLİ SPERM MORFOLOJİK DEFEKTLERİNDE IMSI İLE SPERM SEÇİMİ İMMATÜR Sitoplazmik droplet Tail-stump

IMSI Sonuçlar MSOME kriterlerine göre sperm seçiminde ICSI vakalarında hem fertilizasyon hem de gebelikle doğru orantılı ilişki gösterilmiştir. (Bartoov, 2002) Daha iyi mitokondriyel fonksiyon, düzgün kromatin yapısı, düşük anöploidi oranı (Garolla et al, 2008) 3.gün embriyo gelişiminde fark yok fakat blastosiste gidiş Grade I-II spermler için anlamlı olarak farklı (Vanderzwalmen, 2008 ) Embriyo kalitesi ve gebelik sonuçlarındaki iyileşmeye ek olarak, düşük oranlarını da anlamlı olarak azaltır (Sakkas, 2013) IMSI özellikle ŞOAT vakaları mutlaka tercih edilmesi gereken bir yöntemdir.

ÇİFT KIRILIM (BIREFRINGENCE) Sperm post akrozomal bölgesinin, akrozom yapısındaki değişimlere (akrozom reaksiyonu) bağlı olarak polarize ışığı kırma özelliğinin değişmesi esasına dayanmaktadır.

Sperm Çift Kırılım Analizi Polarize mikroskopi kullanılarak ICSI için sperm seçimi ilk olarak Baccetti (2004) tarafından öne sürülmüştür. Spermin protoplasmik yapısında kaynaklanan çift kırılma özelliğine dayanmaktadır. Bu çift kırılmanın sperm başında sadece post-akrozomal bölgede gözlemlenmesi akrozomal reaksiyonun gerçekleştiğini göstermektedir. Olgun sperm çekirdeğinde bulunan protein filamentlerinin uzunlamasına dizilmiş çubuksu yapılarının polarize lens takılmış ve iki farklı açıdan ışık gönderme özelliğine sahip bir modülasyonu bulunan inverted mikroskop yardımıyla gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak vermektedir.

Akrozom reaksiyonu geçirmiş ve geçirmemiş sperm kullanımında ET başına ve OPU başına klinik gebelik oranlarında anlamlı farklılık var. Canlı doğum oranında da anlamlı farklılık var

Sperm Çift Kırılım Analizi-Sonuç Gianarolli ve ark. (2009) yaptığı çalışmada çift kırılım özelliğine göre seçilmiş spermlerle yapılan ICSI sonucunda ŞOAT ve azospermi olgularında klinik gebelik oranlarının yaklaşık olarak iki katına çıktığını göstermişlerdir. Aynı grubun daha yüksek hasta sayısı ile yaptığı yeni çalışmada (2010) yumurta toplama başına canlı doğum oranının çift kırılım grubunda kontrol grubuna göre 5 kat artığı gösterilmiştir Bu analizle ICSI için akrozom reaksiyonu geçirmiş spermlerin kullanımıyla, fizyolojik fertilizasyonda oosit sitoplazmasına girmeyen akrozomal kontentin ICSI’de de elimine edilmesiyle normal fizyolojiye yakın bir fertilizasyon sağlanmış olur.

HYALURONIC ACID BINDING ASSAY(HBA) Fizyolojik olarak fertilizasyonun gerçekleşebilmesi için spermin, oositi çevreleyen, hyaluronik asit içeren zona pellusida’ya bağlanabilme özelliği göstermesi gerekmektedir. HBA bu fizyolojik yolu modelleme esasına dayanır. Hyaluronik asite bağlanan spermler düşük DNA fragmantasyonu ve kromozomal anöploidi gösterirken iyi morfolojik yapıya sahip olduğu gözlenmiştir. Jakap ve ark. (2005) çalışması HA bağlanan spermlerde kontrol örneğine göre 5.4 kat DNA hasarında azalma tespit edilmiştir.

HBA Hyaluronan Özellikleri Glycosaminoglycan Hyaluronan is a glycosaminoglycan which is located in the cumulus o-off-or-us of the egg. A hyaluronan recepter is present in the head of mature sperm. Mature sperm is one of the key points here that we will discuss later on. Hyaluronan Özellikleri Glycosaminoglycan Kümülüs-oophorous kompleksde bulunur Olgun Sperm zarının dış yüzeyinde bulunan reseptörlerle bağlanır.

HBA-PICSI(Physiological ICSI) Yıkanmış sperm Petri dish üzerinde bulunan solid HA bölgesine yerleştirilir. Bağlanan spermler ICSI pipetiyle toplanır Oda ısısında 10 dk inkübasyon

PICSI BURAYA VİDEO DAHA İYİ OLUR

HA-BINDING REVIEW Genel olarak fertilizasyon oranı ve embriyo kalitesinde iyileşme gözleniyor.

HA-BINDING SONUÇ Hyaluronik asite bağlanan spermler düşük DNA fragmantasyonu ve kromozomal anöploidi gösterirken iyi morfolojik yapıya sahip olduğu gözlenmiştir. Fertilizasyon oranı ve embriyo kalitesini pozitif etkilediği gösterilmiştir.

Sperm özelliklerine göre ICSI için sperm seçim yöntemlerinin değerlendirilmesi Normal Oligo Asteno Terato Yüksek DNA hasarı Yüksek ROS Yorum Sperm örneği hazırlık yöntemleri Swim-up + Density gradient swim-up’a tercih edilebilir Density gradient Testiküler biyopsi ++ Yüksek DNA hasarı tanımlanmış vakalarda faydalı olduğu gösterilmiştir Sperm seçim yöntemleri IMSI Blastosiste gidişte, gebelik ve implantasyon oranında artış Brifringence ŞOAT ve azospermi vakalarında klinik gebelik oranlarında artış HBA/PICSI Sperm sayısı ve motilitesi düşük olan vakalarda efektif değil Deneysel prosedürler Sperm RNA analizi / DNA metilasyonu / Proteomik analiz Yeterli klinik çalışma yoktur

Sonuç: Bu sunumda bahsedilen uygulamalar, özellikle ICSI yönteminin yoğunlukla kullanımı nedeniyle ortaya çıkabilecek olumsuz etkileri elimine etmeye yönelik tanımlanmış ve pratikte kullanımı olan uygulamalardır. Bu metodların bazıları yaygın kullanılabilmekle birlikte, bazıları sadece belirli hasta gruplarında tercih edilmelidir. Metod seçiminin bu doğrultuda yapılması halinde ART sonuçlarında genel bir iyileşme sağlamaktadır.

TEŞEKKÜRLER... Prof.Dr.M.BÜLENT TIRAŞ Dr. AYŞE SALTIK Dr.EVİS ERTAŞ Msc.DERYA ATICI Phd.CİHAN HALICIGİL Bsc.SEVİL ÜNAL Bsc. MELDA ATAY Msc.İDİL BOZKURT Bsc.BARIŞHAN ARZUL

TEŞEKKÜRLER