Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV) Etmenine Dayanıklılık Sağlayan Sw-5 Geninin Moleküler İşaretleyiciler Yardımıyla Belirlenmesi Asu OĞUZ1 Şebnem ELLİALTIOĞLU2 Hülya İLBİ3 Nejla ÇELİK1 Aylin KABAŞ1 Sinan ZENGİN1 1 BATEM (Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü), ANTALYA; ersoyasu@yahoo.com 2 Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü, ANKARA 3 Ege Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü, İZMİR Domates, Dünya’da ve Türkiye’de en fazla yetiştirilen sebze türüdür. Domates üretimini sınırlayan etmenlerin başında hastalıklar gelmektedir. Üretim alanlarında görülen önemli hastalık etmenlerinden olan domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV=Tomato Spotted Wilt Virus) %42.1-%100 arasında ürün kayıplarına neden olabilmektedir. Bu viral hastalık etmenine karşı alınacak en etkili önlem, genetik dayanıklılığın kullanılmasıdır. Daha önce yapılan çalışmalarla Solanum peruvianum’da bulunan Sw-5 genin en etkili dayanıklılık kaynağı olduğu ve bu genin varlığının CAPS moleküler işaretleyicileri ile tespit edilebildiği ortaya konmuştur. Araştırmada, ülkemizde ilk defa bu hastalık etmeni virüse karşı dayanıklılığın moleküler olarak tespiti sağlanmış; bu amaçla hem moleküler hem de mekanik inokulasyon yöntemi kullanılmış olmakla birlikte bu makalede sadece moleküler çalışmalardan bahsedilmiştir. Bitkisel materyal olarak Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü (BATEM) gen havuzunda bulunan bazı domates hatları ile TGRC (Tomato Genetic Resource Center)’den gelen ve Sw-5 geni taşıyan dayanıklı LA 3667 domates hattı ve yine dayanıklı ticari bir çeşit olan Formula F1 kullanılmıştır. Önceki uygulamalarımızda hastalıktan çok etkilenen Batem Özçelik F1 çeşidi, duyarlı çeşit olarak denemelere alınmıştır. Bu çalışma, ileride hastalık etmeni virüse karşı planlanacak ıslah programlarına yol gösterecek nitelik taşımaktadır. ÖZET Metot GİRİŞ PCR Protokolü -1 x PCR buffer (2 µl), -50 ng genomik DNA (1 µl), -188 µM dNTP (0.4 µl), -Her primerden (4 adet primer) 100 nM (0.2 µl), -5.75 mM toplam MgCl2 (4 µl), -0.1 unit Taq DNA polymerase (0.4 µl), olacak şekilde 20 µl toplam hacimde gerçekleştirmiştir. DNA izolasyonu Doyle ve Doyle (1987) CTAB metoduna göre Sw-5 geninin moleküler olarak tespiti CAPS moleküler işaretleyicileri ile yapılmıştır (Stevens vd. 1992). Primer dizilişleri Çizelge 2’de verilmiştir. Domates Üretimi Dünyada 5.227.883 ha 129.649.883 ton üretimi Ülkemiz 300.000 ha 10.985.400 ton üretim (FAO, 2010) Çin ABD Türkiye Çizelge 2. Primer dizilişleri Primerin adı Primerin dizilişi Sw-5b-LRR-F 5’-TCTTATATTGTGGAGTTTTTGTCG3’ Sw-5b-LRR-R 5’-TCCACCCTATCAAATCCACC- ZUP641 5’-AAGCCGAATTATCTGTCAAC- ZUP642 5’-GTTCCTGACCATTACAAAAGTAC- PCR döngüsü koşulları; DNA denatürasyon aşaması: 3 dak. 94 ºC Primer hibridizasyon aşaması: 35 döngü; 94 ºC’ de 30 sn, 56 ºC 30 sn,72 ºC’ 1 dak. Son yazılım aşaması: 72 ºC’ de 1 dak. 3. sırada Tüm dünyada ve ülkemizde domates yetiştiriciliğini sınırlayan en önemli etmenler hastalık ve zararlılardır (Rosello vd. 1996). TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus ) Hassas Hat-1(+) LA 3667(+) Formula F1 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 300 bp 200 bp Sw -5 geni 1906’larde Avusturalya’ da ortaya çıkmıştır. Dünyada 90’dan fazla ülkede özellikle Akdeniz ülkelerinde görülmektedir, Ülkemizde de domates yetiştirme alanlarında özellikle Akdeniz, Ege ve Marmara Bölgelerinde %42.1 ile %100’lere varan ürün kayıpları Şekil 1. CAPS moleküler işaretleyici ile Sw-5 gen bölgesi taraması Hastalık semptomları; TSWV ile mücadele; Genetik dayanıklılık Sw -5 geni Solanum peruvianum’ da bulunuyor Dominant tek gen Stevens çeşidine aktarılmış CAPS moleküler işaretleyicisi ile moleküler olarak tespit ediliyor MATERYAL VE METOT BULGULAR ve TARTIŞMA Çalışmada dayanıklı kontrol olarak kullanılan Sw-5 genini taşıyan ve dayanıklı olduğu bilinen LA 3667, dayanıklı ticari çeşit FORMULA F1 ‘in DNA analizinde 300bp’lik bantın varlığı ile dayanıklılığı net bir şekilde görülmüştür. Ancak BATEM domates hatları içerisinde Sw-5’ i taşıyan herhangi bir genotipe rastlanmamıştır (Şekil 1). SONUÇ Bu araştırmada elde edilen sonuçlar, daha önce bu çalışmaya paralel olarak yürütülen dayanıklılığının mekanik inokulasyon ile tespiti araştırmaları sonuçlarını destekler niteliktedir. Her iki çalışmanın sonucuna göre Sw-5 geninin hastalık etmeni virüse karşı etkinliği ispat edilmiştir. Bundan sonraki çalışmalarda optimize edilen bu moleküler yöntemin kullanılmasıyla TSWV’ ye karşı dayanıklılık ıslahı programlarında daha kısa sürede daha kesin sonuçların elde edilmesi mümkün olabilecektir. Materyal Çalışmada kullanılan materyallerin listesi Çizelge 1’de verilmiştir. Çizelge 1. Materyal Listesi No Materyal Adı Materyal Kaynağı 1 BATEM 17 BATEM 2 BATEM 18 3 BATEM 19 4 BATEM 20 5 BATEM 21 6 BATEM 22 7 BATEM 23 8 BATEM 24 9 BATEM Özçelik F1 BATEM (hassas çeşit) 10 LA 3667 TGRC (Sw-5 geni taşıyor) 11 FORMULA F1 Dayanıklı ticari çeşit (Sw-5 geni taşıyor)