SOMATİK HÜCRE KALITIMI (epigenetik kalıtım) Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMİR “Aynı organizmaya ait hücrelerarası gen aksiyon farklılığını inceleyen genetik alt dalı” Ocak 2005

TEŞEKKÜR Öğrenci Komite Not 1-Ayşe Gül VURAL III 87 1-Mustafa ORAL III 87 2-Bilgin DEMİR III 86 3-Naciye AYGÜN III 85

GENETİK DÜZENLEMEDE – SOMATİK KALITIM EVRELERİ 1- Yumurta hücresi düzeyinde düzenleme : Yumurta hücresinde bulunan anterioposterior gradiyent farkı fertilizisyon öncesi yumurta hücresinden meydana gelecek embriyonun anteriyor ve posteriyor kısmını verecek bölgeler öncelikle belirlenmektedir. Burada sadece yumurta hücresiyle sınırlı bazı regülatör-modülatör proteinler yumurta-polarity ve segmentasyondan sorumlu (25 adet tanımlanmıştır) genler görev almaktadırlar. 2. Zigot evresinde düzenleme : Bu evrede yine çoğu yumurtadan orijin alan ve döllenmeyi takiben aktive olan zigotik-effekt genler olarak bilinen; remodelling faktörler, integrinler, transkripsiyonel faktörler ve kromatin bağlayıcı özgül proteinler gibi düzenleyici moleküllerin görev aldıkları saptanmıştır. Bu genlerin görevi yumurta ve sperm çekirdeklerinin kaynaşmasını sağlamak ve hücre bölünmesi öncesi görev yapan proteinlerin bazı regülasyonunda görev alırlar.

  3. Gastrulasyon-Embriyogenez evresinde düzenleme : Bu evrede görev alan en önemli gen grubunun yine yumurta hücresine ait 8 çift oldukalı saptanan pair-rule ve 10 adet oldukarı saptanan segment polarity genlerdir. Bu gen grubu her tür için farklı olmakla birlikte embriyogenezin 2, 8 ve 16 hücrelik bölünme evrelerinde inaktive edilirler. Örneğin farelerde zigot 2, koyun ve insanda 16 hücrelik embriyo olana kadar görev yapmaktadırlar. Bu sayı türe göre değişmektedir. Zigot hücresinin maksimum 16 hücreye kadar bölünmesinden sorumlu gen grubudur. Bu genler sadece totipotent hücrelerde görev alırlar.   4. Fetus dönemi düzenleme : Bu dönem, fetus hücrelerine ait genlerin ifade edilmesiyle başlar. Bu dönemden sonra yumurta regülasyonu yerini fetus gen regülasyonuna terk eder. Görev yapan genler homeotik ya da homeodometik (hox) gen ailesi olarak adlandırılır. Diğer bir tanımla bu genler geniş bir aileden ibaret olup, yetişkin dokuların ilkin farklılaşmasından sorumlu oldukları için homeotik seçici genler olarak adlandırılırlar. Türlerarası somatik doku farklılaşmasından birinci dereceden bu gen grubu sorumludur. Bir dokunun normal ya da anormal bir şekilde farklılaşması bu gen grubunun normal ve zamanında fonksiyon yapmasına bağlıdır. İlk kez blastoderm evresinde aktive olurlar. Memelilerde 4 adet homolog homeotik kompleks genin varlığı saptanmıştır. Homeodometik seçici genleri meydana getiren homeodomain zincir genleri evrim süresince korunan ve en az varyasyon gösteren genlerdir. Herbiri 60 aa uzunluğunda protein sentezinden sorumlu 650.000 bç uzunluğunda regülatör alt birimlerinden ibaret genlerdir. Genlerin regülatör alt birimlerini meydana getiren diziler, segmentasyonel ve yumurta -polarity gen ürünlerine özgül bağlantı bölgeler içerirler. Vücudun segmentasyonunda spesifik görev yapan bu gen grubudur. Moleküler mekanizmaları kesin olarak bilinmemekle birlikte regülatör alt birimleri aracılığıyla aktive ve inhibe edildikleri sanılmaktadır.

5-YETİŞKİN (ADULT) DÖNEM DÜZENLEME 1- Housekeeping genler 2- Doku spesifik genler 3- Alel spesifik genler 4- Diğer (ekspresyon farklılığı gösteren genler, onkogenler, TS genler vb)

EPİGENETİKTE (SOMATİK KALITIM) ETKİLİ MEKANİZMALAR I- DNA METİLASYONU II- FOSFORİLASYON III- ASETİLASYON IV- UBİQUTİNASYON V- HIGH MOBIL NON-HISTON PROTEİNLER

DNA METİLASYONU - Hücre farklılaşması - Gen ekspresyonu - Yaşlanma - DNA replikasyonunun başlatılması - DNA transkripsiyonunun başlatılması - DNA tamiri - Mutagenezis - İkili sarmal DNA stabilitesinin sağlanması - Lokal mutasyon oranının artırılması - Nükleer parçalanmanın engellenmesi - Kromozom paketlenmesi - Hücre farklılaşması - X-kromozom inaktivasyonu - Gen ekspresyonu - Yaşlanma - Tümör baskılayıcı gen inaktivasyonu ve proto-onkogen aktivasyonu aracılı onkogenezis - Genomun aktif gen ya da kondanse bölgeler şeklinde yapılanması ve yerleşimi - Apoptozis

DNA METİLASYONU Post-replikatif bir mekanizmadır DNA düzeyinde yapılan modifikasyonla karakterize epigenetik mekanizmadır DNA metiltransferaz görev alır İnsanda % 90 oranında metillenenz nükleotidler mCpG dinükleotididir. DNA metilasyon oranı açısından; Ametile DNA (Ökromatik DNA, Housekeeping genler) Hipometile DNA (Fakültatif heterokromatik DNA, Pseudogenler, inaktif X) Undermetile DNA (bazı onkogenler) Metile DNA (Heterokromatik DNA, İnterkalar heterokromatik DNA, protoonkogenler) Hipermetile DNA (Sentromerik DNA, İnaktik Junk DNA) mC, 5-metilsitozin yada episitozin olarak adlandırılır Semikonservatif kalıtılır

ELEMANLARI Metil vericisi SAM (S adenozil methionin) - Substrat template DNA Enzim DNA Metil transferaz SAM metil grubunu kaybedince SAH (S adenozin homosistein)’e dönüşür. Ökaryot ve prokaryot hücrelerin herikisinde en yaygın metillenen baz sitozin ( C) dir. Prokaryotlarda CCGG dizilerindeki ilk sitozin, ökaryotlarda ise CpG dinükleotidlerdeki ilk sitozin en yaygın metillenen bazdır. DNA yapısından metil grubunun koparılmasında görev alan enzim DNA Mtaz dır.

METİLASYONUN ONKOGENEZDE ÖNEMİ Bütün onkogenler ökaryotik hücrelerde öncelikle DNA düzeyinde modifiye edilerek inaktive dilir DNA metisyonu görev alır Onkogenler hipermetile durumda inaktif durumdadırlar Onkogen hipermetile ya /yada metillenerek inaktive edilir, protoonkogene dönüştürülür. Fosforilasyon, ubiqutinasyon, yüksek mobiliteye sahip non-histon proteinlerin varlığı ve asetilasyon ise nükleoproteinler düzeyinde (histon –non-histon) yapılan epigenetik modifikasyon mekanizmaları olup gen ekspresyonu farklılaşmasında rol alan en önemli mekanizmalardır. Tümör supressör (20 adet) genler ÖR : p53 DNA hipermetilasyonu sonucu ekspresiyonel olarak inaktive edilir, hücre onkogeneze girer. Bu genler normal hücrelerde aktif genlerdir, inaktif durumda hücrede kansere neden olurlar. Genlerin inaktivasyonları da DNA hipermetilasyonu ile olur.

Alternative models for CpG methylation in cancer

HÜCRE ÖLÜM MEKANİZMALARI Apoptozis Nekrozis Sitotoksisite

Tablo I. Apoptozda etkili basamaklara genel bakış.   Tablo I. Apoptozda etkili basamaklara genel bakış.   Uyarıcılar Upstream Caspase Aktivasyonu Mitokondriyal membranında potansiyal kayıp    ROS üretiminde artış Asidifikasyon Downstream Caspase Aktivasyonu     Kromatin condensasyonu Fosfatidilserin translokasyonu Hücre membran permeabilitesinde artış DNA fregmantasyonu Apoptatik body oluşumları Fagositozis (ölüm)

APOPTOZİS Kontrol edilen – proğramlı hücre ölümüdür Fizyolojik bir process olup istenmeyen yada yararsız hücrelerin ölümünden sorumlu mekanizmadır. yüksek canlılarda özellikle gelişme ve doku farklılaşması dönemlerinde görev yapar”fiyolojik apoptozis”. Farklılaşmasını tamamlamış doku –hücrelerde meydana gelirse “patolojik apoptozis “adlandırılır.

APOPTOZİS EVRELERİ Membran blebbing Kromatin(çekirdek)kompertmentalizasyonu Sitoplazma kondensasyonu DNA fragmentasyonu Mitokondri membran yapı bozukluğu Apoptotik body oluşumu Fagositozis

APOPTOZİS 1- Özel grup hücrelerde meydana gelir 2- Hormonal değişim ve büyüme faktörlerinin yokluğu gibi fizyolojik sitimülasyona bağlı gelişir 3- Apoptotik body ler makrofaj ve diğer komşu hücrelerce fagosite edilir 4- İnflamasyonel yanıt görülmez.

APOPTOZİS ÖZELLİKLERİ Enzimatik basamakları düzenlenebilen mekanizmadır 37 C’de meydana gelen ATP bağımlı bir mekanizmadır. Agaroz elektroforezde ladder yapı gösterir Mitokondri membran değişiklikleri mevcuttur: - Fosfatidilserin translokasyonu -AIF ve sitokrom C sekresyonu

APOPTOZİS GÖREVLERİ Embriyogenezis Doku homeostazisi İmmün tolerans Sinir hücrelerinin gelişimi Normal hücre gelişimi Endokrin bağımlı doku atrofisi Primer gonad - seks gelişimi  Metamorfozis

APOPTOZİS TETİK ÇEKİCİLERİ Hücre yüzey reseptör ölümleri (CD95, APO 1, Fas ve ras aktivasyonu) Fosfatidilserin translokasyonu, extrinsik matiriks değişimi 11 farklı intrasellüler Cystein proteaz enzimlerin sitozole salınımı (Caspase 8 ve 9) AIF salınımı Ca ve Mg bağımlı oligonükleozomal endonükleaz aktivasyonu

NEKROZİS Kazaen hücre ölümüdür Patolojik bir process tir İstenmeyen hücre ölüm mekanizmasıdır Hücrenin çok ciddi bir fiziksel yada kimyasal ajanlara maruz kaldığı durumda kendi siteği dışında gelişen bir ölüm mekanizmasıdır. İnflamasyonel yanıt mevcut (yangı) Makrofajlarla fagositozis görülür Homeostazis yokluğu en önemli etkendir

NEKROZİS ÖZELLİKLERİ Vesikül oluşumu görülmez Homeostazis regülasyonu ortadan kalkmıştır Enrji gereksinimi yoktur Hücre özgüllüğü yoktur “Smear DNA” yapısına sahiptir + 4 C’de meydana gelir Hücre ölümünün son basamağında rastgele DNA parçalanması görülür Vesikül oluşumu görülmez Smoot mitokondri ve hücre membran yapısı Sitoplazma vemitokondri membran yapısında irreversible swelling (şişme) Total hücre ölümü ile sonlanır

NEKROZİS ETKENLERİ metabolik zehirlenmeler ischemia hipoksi Hipertermi litik viruslar complemen ataklar - homeostasis gerilemesi(hücreye su ve iyon geçişinde düzensizlikler)

SİTOTOKSİSİTE İlaç Kozmetikler  Çeşitli yiyecekler Ağır kimyasal bileşenler gibi toksik etkenlerin neden olduğu hücre ölüm mekanizmasıdır. Patolojik bir mekanizmadır T-hücreler aracılı fagositozis bu mekanizmaya dahil edilir MHC reaksiyonların tamamı sitototoksisite ile ölümdür Apoptotik body fagositozu yine bir sitotoksisite ölümdür olarak kabül görür.

histone modifications Dr Alan Wolffe (1999) “Epigenetics is heritable changes in gene expression that occur without a change in DNA sequence” Epigenetics is ingenious system to selectively utilize genome information, through activating or inactivating functional genes. Identified epigenetic processes involved in human disease: DNA methylation imprinting histone modifications Each of these processes influences chromatin structure and Thus regulates gene expression and DNA methylation, replication, recombination and repair.

Ac -acetylated histones; mC-methylated Cytosine HDAC -histone deacetylases: Pol II- RNA polymerase II GTF- general transcription factors HAT -histone acetyltransferases; MBD -methylated DNA binding domain

1. System of DNA methylation *CpG islands: >200 bp stretches of DNA that have a significantly higher concentration of 5’-CpG;3’ dinucleotides than the bulk of the genome *Cytosine resudue in complementary 3’-GpC-5’ that makes a basepair, is also methylated symmetrically, and these two methyl groups show a three-dimentional structure prominent in the major groove of the dsDNA *50-60% of human genes have CpG islands in front of and covering core promotor and transcription start site *70-80% of CpGs in the genome is methylated *CpG islands in front of genes are mostly unmethylated *exceptions: imprinted genes and X-linked genes *CpG island are divided into several classes: (1) methylated on both alleles in all tissues located in high CG isochores (2) differentially methylated and located in low CG (<0.5) isochores *genomic methylation pattern is stable and heritable *genome-wide methylation patterns are reprogrammed in mammalian germ cells and in pre-implantation embryos

Mammalian methyltransferases: DNMT1 - maintenance DNA methyltransferase *methylates hemi-methylated DNA providing methylation pattern to the newly replicated daugther strand, based on parent strand *represses transcription in complex with histone deacetylases 2. DNMT3a, DNMT3b - de novo methylases *add a methyl group to unmethylated CpG base pairs, resulting in creation of a new hemi-methylated and then fully methylated CpG *de novo methylation is implicated in cell growth and differentation, and in altered methylation in tumorigenesis. DNMT3b - mutated (common splice variant) in patients with ICF syndrome (immunodeficiency in association with centromere instability of chromosome 1, 9, 16, and facial anomalies): hypomethylation of pericentromeric satellite sequences Methyl-CpG binding proteins: MeCP2, MBD1-4

Replicated (active) genes *Methylated DNA is replicated later than actively transcribed DNA *Monoallelically expressed genes (imprinted) have coordinated replication timing along human chromosomes Replicated (active) genes Non-replicated (silenced) genes FISH analysis with imprinted gene pairs selected from one chromosome

2. Histone modifications The amino termini of histones contain a diversity of posttranslational modifications. The most promonent of them are acetylation and methylation of Lysine (K) residues in the highly concerved H3 and H4 174 bp of Histone tails Histone fold domain ACETYLATION Methyl modifications TRANSCRIPTION Acetyl modifications

Many of trans-acting factors required for HT assembly are either enzymes that directly modify histones or factors binding to histones *e.g. SIR (silent information regulator) genes in yeast - Sir 2 is a NAD-dependent histone deacetylase; Sir3&4 bind to deacetylated histone tails *in mammals, Drosophila and yeast methylation of H3 lysine 9 correlates with heterochromatin assembly. This residue is methylated by concerved methyltransferase SUV39H1 in human, Su(var)3-9 in drosophila and Clr4 in fission yeast *Swi6 (yeast) and HP1 (human, Drosophila) bind to Lys 9 methylated H3 tails Histone methylation/HP1-binding cycle is an ancient mechanism for propagating epigenetic states. CpG methylation/histone deacetylase binding cycle in evidently added later.

How are heterochromatin complexes targeted to a specific chromosomal domain? Evidence suggests a role for repetitive DNA elements and non-coding RNAs in regional targeting of HT complexes. S. cerevisiae S. pombe Small HT RNAs

RNA interference (RNAi) pathway Required for HT formation and H3 Lys9 methylation in S. pombe : Argonaute (ago1), member of PAZ/Piwi family Dicer (dcr1), RNaseIII-like protein RNA-dependent RNA polymerase (rdp1) 2. Centromeric repeat sequences that are transcribed at low levels and produce ds RNA are sufficient to recruit HT at an ectopic site 3. Small HT RNAs provide specificity for targeting histone modifying activities and epigenetic modification of the genome through homology recognition 4. The role of RNAi in epigenetic gene silencing appears to be concerved among diverse species

1. 2. 3. RISC- RNA induced silencing complex

Model for formation of silenced chromatin domains E-histone-modifying Enzyme SF- silencing factor BE- boundary element Deacetylation and methylation of H3 Lys9 are followed by deacetylation of H3 Lys 14 and create a binding site for Swi6 silencing factor H3 Lys 9 acetylation+ H3 Lys4 methylation= STOP heterochromatin

Ac -acetylated histones H3 Lys9 CpG-Me -methylated Cytosine HDAC -histone deacetylases DNMT -DNA methyltransferase HMT-histone methyltransferase MBD -methylated DNA binding domain HDAC deacetylates lysine residues as the prerequisite for methylation HP1 protein recognizes MeK9, binds also HMT and heterchromatin can spread

3. Chromatin remodeling The positioning of histones along DNA is mediated by ATP-dependent nucleosome - remodeling complexes that use the energy of ATP hydrolysis to noncovalently reposition histone octamers and generate nucleosome free or dense chromatin.

Genes Mechanims where involved Diseases SIOD - Schimle immuno-osseous dysplasia COFS - cerebro-oculo-facio-skeletal syndrome CBS - Cockayne syndrome type B RTS - Rubinstein Taybi syndrome

Chromatin remodelling disorders: 1.ATRX, SNF2-family helicase (a-thalassemia X-linked mental retardation) mutations: Causes several mental retardation disorders, facial, skeletal, an urigenital abnormalities, a -thalassemia and microcephaly ATRX protein resides predominantly in repetitive DNA, ribosomal gene clusters, pericentromeric heterochromatin. In ATRX cells, the ribosomal DNA repeats are hypomethylated. 3. SMARCAL1 (SWI/SNF-related matrix-associated, actin-dependent regulator of chromatin, subfamily A-like protein 1): Schimke immuno-osseous dysplasia characterized by T-cell immunodeficiency, renal failure, hypothyroidism, bone-marrow failure etc. SMARCAL1 probably regulates a subset of genes necessary for cellular proliferation.

2. ERCC6 gene (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, compelentation group 6): (a) COFS (cerebro-oculo-facio-skeletal) syndrome: failure of multiple systems and premature death (b) Cockayne syndrome: UV-sensitivity, dwarfism, skeletal abnormalities, mental retardation etc. Both cellular phenotypes include increased sensitivity to oxydative and UV-induced DNA-damage and failure to recover RNA synthesis after UV irradiation ERCC6 plays key role in transcription coupled DNA repair, presumably opens the chromatin allowing access of the DNA repair apparatus to the DNA

Epigenetics and human disease MeCP - Methyl-CpG binding protein IGF2 - insulin-like growth factor 2 Epigenetics and human disease CBP - CREB binding protein, co-activator of transcription Mi2 - nucleosome remodelling histone deacetylase

How is the heterochromatic state inherited? *During DNA replication, histones H3 and H4 are randomly distributed to sister chromatides. *modified parental histones and assambled heterochromatin proteins (Swi6/HP1 or Sir 3) can serve as “molecular bookmarks” to imprint the parental histone-modification pattern onto newly assambled nucleosomes.

4. Cancer epigenetics Feinberg and Vogelstein (1983): loss of DNA methylation in cancer cells compared to normal tissues

Hypomethylation and gene activity: 1. Hypomethylation can lead to gene activation (e.g. HRAS, which is normally expressed only in testis) *Overexpression of: cyclin D2 in gastric carcinoma MN/CA9 in renal-cell carcinoma S100A4 metastasis associated gene in colon-cancer HPV16 in cervical cancer 2. A cellular ‘methylator phenotype’ has been linked to mismatch repair (Lengauer et al) *Hypermethylation of the mismatch-repair gene MLH1 is commonly found in mismatch-repair-defective tumors

3. Hypomethylation in cancer is related to chromosomal instability *Frequent unbalanced chromosomal translocations with breakpoints in pericentromeric satellite sequences (otherwise highly methylated) 4. Hypomethylation is a mechanism of drug, toxin and viral effects in cancer *MDR1, multidrug resistance gene correlates with increased expression and drug resistance in acute myelogenous leukemia *Cadmium inhibits DNA methyltransferase activity and leads to acute hypomethylation, which is followed by hypermethylation of dna after chronic exposure to this “epigenic’ carcinogen *Arsenic induces Ras hypomethylation in mice *cervical cancer latency is caused by hypermethylation of HPV16 genome

Hypermethylation and cancer Promotor CpG hypermethylation of tumor supressor genes: Retinoblastoma gene RB Cyclin-dependent kinase inhibitor (INK4A,p16, CDKN2A) Mismatch repair gene MLH1 Von Hippel-Lindau (VHL) tumour supressor E-cadherin Is the INITIAL SILENCING HYPERMETHYLATION? Or is HYPERPEMTHYLATION a consequence? Probably it is part of “programmed” silencing, but is not per se responsible for inactivation of a gene

Loss of imprinting in cancer sporadic germline BWS is fetal overgrowth disorder due to deregulation of imprinted genes at 11p15: paternally expressed IGF2, KCnQ1OT1 & maternally expressed H19, CDKN1C, KNCQ1 Wilms tumour: hypermethylation of H19 due to LOI of IGF2 leading to biallelic expression and twofold increase in doses