Elongasyon, terminasyon ve ökaryotlarda RNA işlenmesi 5’ ucuna cap yapısı eklenmesi 3’ ucuna poly A kuyruğunun takılması İntronların uzaklaştırılması-splaysing İşlenme süreci transkripsiyon sürerken devam ettiği için cotranskripsiyoneldir. CTD tüm bu işlenme sürecinin koordinasyonunu sağlar. CTD yedi ardıl aminoasidin birçok kez yinelenmesiyle oluşur ve butekrarlar cap, splaysing ve polyA kuyruğunun takılması gibi modifikasyonları gerçekleştiren proteinler için bağlanma bölgesi olarak işlev görürler. CTD tam sentezlenen RNA zincirinin olduğu yerde konuşlandığından RNA sentezi yapılır yapılmaz transkrisiyon baloncuğundan çıkan RNA üzerinde bu modifikasyonların yapılması oldukça kolaydır. Bu olgunlaşma sürecinin çeşitli evrelerinde CTD fosforile ve defosfirile edilir. Dolayısıyla bu fosforilasyon aşaması hangi işlenme proteinin bağlanacağına ve ayrılacağına karar verir

5’ ve 3’ uçlarının modifikasyonu mRNA zincirinin 5’ ucunda, RNA enzimin aktif merkezinden çıktıktan hemen sonra 7-metil guanozin takılarak cap yapısı oluşturulur. Capin 2 görevi vardır RNA’yı parçalanmadan korur Translasyonun başlaması için gereklidir

3’ ucunun işlenmesi RNA uzaması konsensus dizilerden AAUAAA yada AUUAAA’ya gelinceye kadar devam eder bu diziden 20nt sonra bir enzim RNA’yı keser BU kesilen uca 150-200 adenin nt eklenir buna polyA kuyruğu denir. Protein kodlayan genlerin AAUAAA dizisine poliadenilasyon sinyali adı verilir polyA kuyruğu polyA polimeraz tarafından eklenir

RNA splaysing-intronların uzaklaştırılması Ökaryot genler,nin çoğu intron içerir ve bu diziler protein kodlamazlar tRNA ve rRNA genlerinde bile bulunurlar.İntronlar RNA sentezi sürerken ve cap yapısı eklendikten sonra çıkarılırlar.İntronların uzaklaştırılması ve ekzonların birleştirilmesi olayına splaysing adı verilir ( bir teyp yada sinema bandında bazı bölümleri çıkarıp atmak düzeltmek gibi). Splaysing kodlayan dizileri yani ekzonları yanyana getirir. İntron sayı ve boyu ve bulunduğu organizmaya göre değişir Memeli intron boyu ortalama 2000nt.insan duchenne müskülar distrofi geninde 79 ekzon 78 intron bulunur ve genin tamamı 2.5 milyon bçden oluşur.splaysing sonrası mRNA 14000 nt lik 79 ekzon yanyana gelir.

Alternatif splaysing Splaysingin alternatif yolağı farklı mRNAlar üretir sonuçta da aynı transkriptten farklı proteinler oluşur.aynı proteinin alternatif formları bu mekanizmayla oluşur ve farklı hücre tiplerinde kullanılır yada gelişmenin erken dönemlerinde farklı aşamalarda bu proteinlere rastlanır.alfa-tropomiyozin geninde alternatif splaysing ile meydana gelen farklı proteinler şekil 8-14te gösterilmektedir.bu mekanizma ile akraba, herbir hücre tipinde optimum olarak çalışan proteinler üretilir.

Şekil 8.14 alfa tropomiyozin pre-mRNAsının alternatif splaysing ile çeşitli dokularda oluşturduğu proteinler

Şekilde intron-ekzon kavşakları görülmektedir ve bu kavşaklar splasing reaksiyonunun gerçekleştiği noktalardır.Bu kavşaklarda bulunan diziler türler arasında ve genlerde aynıdır.herbir intron iki uçtan kesilir ve bu uçlar 5’ucunda herzaman GU ve 3’ ucunda AG taşır (GU-AG kuralı). Diğer değişmez bölge 3’ splays bölgeden 15-45 nt önde bulunan A nükleotididir. Bu birim ara bir reaksiyonda görev alır ve intronun kesilmesi için gereklidir. Bu korunmuş nükleotidler small nüclear ribonucleprotein partikülleri (snRNP)ler tarafından tanınır (snRNA ve protein kompleksi). Bu işlevsel snRNP splaysing birimi splaysozom (spliceposome) olarak adlandırılır. Splaysozom bileşenleri CTD ile etkileşir ve intron exondizilerini birbirine bağlarlar. Splaysozomda bulunan snRNA’lar korunmuş intron dizileri ile H bağı kurarak splays bölgeleri karşılıklı olarak dizer. Sonraki aşama splaysozomun reaksiyonu katalizyerek intronları uzaklaştırmasıdır Bu intron uzaklaştırma 2 aşamada gerçekleşir

Splays1, intronun bir ucunun korunmuş adenine tutunmasını sağlar ve kovboy kementi biçiminde bir yapı oluşur (lariat) Splays 2 kementi serbest bırakır ve iki ekzon ucunu birleştirir Kimyasal olarak 1 ve 2 evreleri transesterifikasyon reaksiyonlarıdır.

Kendi-kendine splays olan intronlar DNAnın keşfi kadar önemli keşiflerden biri özel bir RNA splaysing mekanizmasıdır ve 1981 yılında Tom Chech tarafından rapor edilmiştir. Test tüpünde silyalı protozoonlardan Tetrahymenanın rRNAlarından birinin primer transkriptinin hiçbir protein ortama konulmadan 413 nt lik intronu kendi kendine uzaklaştırdığı belirlendi Sonraları başka intronlarında bu yeteneğe sahip oldukları bulundu ve genel olarak bunlara self-splicing intronlar adı verildi Bunun önemi proteinlerin dışında ilk kez başka bir molekülün enzimatik aktiviteye sahip olduğu bulundu bu buluş RNA dünyası teorisini destekleyenler için önemli bir kanıt olarak bilim dünyasına sunuldu Bu teoriye göre ilk hücrelerde RNA genetik materyaldi çünkü yalnızca RNA hem şifreleme hemde enzim aktivitesine sahip tek moleküldü Splaysozom kompleksinde intronların uzaklaştırımasını snRNA2larmı yoksa proteinlermi yapmaktadır. Bilim bu sorunun yanıtını çözmeye çalışmaktadır.

Bakteri ve Ökaryotlarda genden proteine bilgi akışı:Özet Ökaryotlarda transkripsiyon sonrası oluşan mRNA molekülüne primer Transkript adı verilir (pre-mRNA). Bu transkript hem intron hemde exon Dizilerini içerir ve daha ileri düzeyde olgulaşma süreci geçirir. Örneğin 5’ ucuna cap, 3’ ucuna polyA kuyruğu eklenir. İnronlar ise splaysing ile Uzaklaştırılır. Prokaryotlarda oluşan transkript (mRNA) değişime uğramaz Protein sentezinde kullanılır.

Prokaryot ve Ökaryot mRNA Yapısı Prokaryot mRNA’nın 5’ve 3’ uçları değişime uğramaz. Ökaryot mRNA’larının bu uçları modifiye edilir. Ayrıca prokaryot mRNA’ları birkaç proteinin bilgisini taşırken ökaryot mRNA’ları bir tek proteinin bilgisini taşır. Ökaryot mRNA’nın 5’ ucuna eklenen 7-metilguanozin (5’cap) 7-metil guanozinin 5’-5’ bağıyla oluşur. Ayrıca birçok Ökaryotik mRNA molekülü 5’ ucunda başka bir modifikasyon taşır:2. ribozun 2’ OH grubu metillenir.

RNA Fabrikası Ökaryot RNA pol II sadece DNA’yı RNA’ya transkribe etmez aynı zamanda 3’kuyruk kısmında pre-mRNA’nın olgunlaşması için gerekli proteinleride taşır Olgunlaşma (processing) sürecinde tüm proteinler enzimin kuyruk kısmında taşınmaz örneğin intronları uzaklaştıran splisozom kompleksinin bileşenlerinin sadece kritik öneme sahip olanları burada taşınır. Polimerazın kuyruk kısmı fosfrolie olduktan sonra bazı komponenetler ayrılır. Buradaki fosfat grupları fosfatazlar tarafından uzaklaştırılarak polimerazın başka bir RNA sentezine başlaması sağlanır

Pre-mRNA’nın 5’ Cap yapısının oluşması

RNA Splaysing: pre-mRNA yapısından intronların uzaklaştırılması İlk evrede introndaki kırmızı ile gösterilen spesifik bir adenin (A) 5’ splays bölgeye saldırır ve bu noktadaki şeker-P omurgasını kırar. İntronun kesilen 5’ ucu Şeklin B kısmında gösterildiği gibi kovalent olarak bu özel adenine bağlı kalır ve RNA yapısında bir loop oluşturur. Exon dizisinin salınan serbest 3’ OH ucu bir sonraki exonun başlama kısmıyla reaksiyona girer ve iki ekzonu birleştirir. Bu birleşme lariat formunda intron dizisinin salınmasına neden olur.

İntronların yapısında konsensus diziler bulunur İntronların yapısında konsensus diziler bulunur. Bunlardan bir tanesi bir önceki slayatta gösterilen A (kırmızı)birimidir ve buraya dallanma noktası denir. İntronun 5’ ucunda GU (5’ splays bölge) ve 3’ ucunda AG (3’ splays bölge) değişmez konsensus dizilerdir. Bu bölgelere splaysingi sağlayacak olan splaysozom kompleksinin elemanları bağlanır. Birleştirilen 1.ekzonun ise 3’ ucunda AG ve 2. ekzonun 5’ ucunda G nükleotidi bulunur.

RNA Splaysing Mekanizması RNA splaysingi snRNP (small nuclear ribonucleoproteinlerin ve diğer bazı proteinlerin (şekilde gösterilmemekte) tarafından katalizlenen reaksiyonlarla olur. Bu proteinlerin tamamına splaysozom denir. Splaysozom intron üzerindeki splaysing sinyallerini tanır ve intronun iki ucunu birbirine yakınlaştırır. Önce dallanma noktasındaki adenin (A) buraya özgü bir protein tarafından tanınır (BBP-branch point binding protein) ve bunu yardımcı bir protein olan U2AFnin bağlanması izler. Sonraki evrede U2snRNP BBP ve U2AF’yi bağlandığı yerden uzaklaştırır ve dallanma noktasındaki adeninle bağ oluşturur. U1 snRNP ise bu arada 5’ splays bölgeye bağlanır ve bunu U4/U6*U5 snRNP’lerin komplekse katılması izler. Bu üçlü komplekste U4ve U6 birbirine sıkıca U5 ise daha gevşek bağlıdır. Sonra bazı RNA-RNA yeniden düzenlenmeleri gerçekleşir ve U4/U6 arasındaki bağ kırılır ve U4 splaysozom kompelksinden salınır. Serbest kalan U6 5’ splays bölgeye bağlanan U1’i yerinden koparır. Daha sonra gerçekleşen yeniden düzenlenmeler ve farklı proteinlerin işe karışmasıyla splaysing reaksiyonu tamamalanır ve lariat formunda intron uzaklaşır iki ekzon birbirine bağlanır

Splaysing Hataları A:Exon atlanması 2. Ekzon intronla beraber uzaklaştırılır büyük olasılıkla buradaki konsensus diziler kaybolduğundan splaysozom kompleksi bir sonraki sinyali algılamıştır B:Kriptik-güdük splays sinyali Ekzondaki mutasyon nedeniylesplaysozomun tanıdığı konsensus dizisi ortaya çıkmış olabilir bunedenle splaysing intronun ucundaki sinyal yerine ekzonun ucunda mutasyonla oluşan sinyali tanır.

Beta talasemi: beta globin geninin splaysing hataları A: Normal erişkin b-globin geni B:tek nükleotid değişimleri normal splays bölgeyi bozar ve exon atlanmasına neden olur C:bazı tek nt değişimleri normal splays bölgeyi bozar ve kriptik splays bölge oluşturur D:yeni splays bölge oluşması ve yeni bir ekzonun mRNA yapısında bulunması

Ökaryot pre-mRNA’nın 3’ ucunda bulunan konsensus diziler Bu diziler genomda kodlanır ve spesifik proteinlerce tanınır.Bu diziler a)AAUAAA hexamerine CPSF bağlanır (cleavage and poly adenilation specific factor). b)GU-zengin dizi c)Her iki dizinin ortasında bulunan CA dizisi:kesilme noktası

Pre-mRNA’nın 3’ ucunun oluşturulması CPSF ve CstF (clevage stimulation factor F) RNA pol II’nin kuyruk kısmında taşınır ve pre-mRNA’nın 3’ucuna transfer edilir. CPSFin bazı altbirimleri TFIID ile de ilişkiye girer. Bu iki protein hexamerik konsensus dizisine bağlanır ve bu diziden RNA’yı keserler.polyA-polimeraz (PAP) enzimi bu kesilen bölgeye bağlanır ve mRNA’nın 3’ ucuna yaklaşık 200 A ekler. Enzim herhangi bir kalıba gereksinim duymaz. Çünkü poly A kuyruğu genomdaki DNA dizisi tarafından kodlanmamıştır. PolyA sentezlendikçe polyA binding proteinler bu A’lara bağlanırlar ve bu proteinler mRNA nükleustan sitoplazmaya geçinceye kadar ona bağlı kalırlar.