TRANSKRİPSİYON: Dr. Lülüfer TAMER GÜMÜŞ MEÜ Tıp Fak. Tıbbi Biyokimya AD

Bir organizmanın genetik yapısını DNA da bulunan dNTP dizeleri belirler ve bu bilginin ifade edilmesi ise (Protein sentezi) RNA lar ile sağlanır.

DNA nın belli bölgelerinden genetik bilgi, kopyalanarak RNA moleküllerine aktarılır. Transkripsiyonda DNA çift sarmalından birisi kalıp olarak kullanılır ve bu kalıbın belli bir bölgesi kopyalanır. İnsülin Geni İnsülin

Transkripsiyon Transkripsiyon, DNA’da saklanan genetik bilgilerin bir RNA molekülü (mRNA, tRNA, rRNA…..) şeklinde kopyalanması veya yazılması olayıdır

Transkripsiyonla RNA’ya kopyalanan, bir protein molekülüne ait genetik bilgilerin okunması veya bir protein molekülü haline çevrilmesine translasyon adı verilir Transkripsiyon ve translasyon olaylarının toplamı, gen ifadesi (gen ekspresyonu) olarak tanımlanır Trans anim 1

Gen ifadesinin düzenlenmesi Gen ifadesinin düzenlenmesi çeşitli aşamalarda olur: 1) Primer transkriptlerin oluşumu 2) Primer mRNA’dan matür (olgun) mRNA oluşumu 3) mRNA’nın sitoplazmaya geçişi 4) mRNA’nın yıkılımı 5) Protein sentezi 6) Proteinlerin posttranslasyonal modifikasyonu 7) Protein yıkılımı

Gen ifadesinin transkripsiyon düzeyinde düzenlenmesi için operon modeli tanımlanmıştır. Kromozomlardaki genler, fonksiyonlarına göre çeşitlere ayrılabilirler: 1) Yapısal genler; mRNA’yı oluştururlar 2) Operatör genler; yapısal genlerin fonksiyonunu denetlerler 3) Promotör genler; üzerinde RNA polimeraz bağlanma bölgesi ve cAMP+reseptör protein bağlanma bölgesi olmak üzere iki bölge içerirler 4) Düzenleyici genler; operonu uzaktan kontrol ederler

Prokaryot hücrede gen ifadesinin düzenlenimi, Transkripsiyon düzeyinde, indüksiyon ile düzenlenim Represyon ile düzenlenim olmak üzere iki şekilde olabilir

Ökaryotlarda ise, genellikle translasyon düzeyinde ve daha az olarak transkripsiyon düzeyinde olur Translasyon düzeyinde kontrol, nicel kontroldür; feedback inhibisyon; İnhibitörün birikmesi, başlama kompleksinin oluşmasını bloke eder ve protein sentezini azaltır. mRNA üzerinde ribozomların yoğunluğu ile sağlanır; mRNA üzerinde ribozomların yoğun olması sentezlenen proteinin miktarını artırır

*RNA zinciri uçlarına bazı grupların eklenmesi (Cap ve Pol A) Transkripsiyonun önemli bir özelliği, oluşan RNA ların daha sonra bazı değişimlere (posttranskripsiyonel) uğramasıdır. *RNA zinciri uçlarına bazı grupların eklenmesi (Cap ve Pol A) *Bazların değiştirilmesi *Bazların çıkarılması *RNA nın bazı yerlerden kırılması (Exon çıkarılması) Bu işlemler sonucunda inaktif primer RNA, daha işlevsel bir molekül haline dönüşür. İnaktif Primer RNA (Het Nükleer RNA) İşlevsel RNA

RNA *rRNA *tRNA *mRNA **snRNA : Eksonların birleştirilmesini kolaylaştırır ve hızlandırır.

rRNA: (%80) Ribozomlarda bulunan RNA dır rRNA: (%80) Ribozomlarda bulunan RNA dır. Değişik proteinler ile birlikte rRNA lar ribozomları oluşturur. Prokaryotlarda; 23 s, 16s, 5s Ökaryotlarda; 28s, 18s, 5.8s, 5s

tRNA: (%15) 3 major RNA arasında en küçük olanıdır (4s) tRNA: (%15) 3 major RNA arasında en küçük olanıdır (4s). Proteinlerin yapısında yer alan 20 aminoasidin herbirine özgü bir tRNA vardır. Her tRNA kendisine özgün a.a di taşır

mRNA: (%5)      5’ 3’ İşlevsel mRNA Kep 5’ tercüme kodlayan bölge 3’ tercüme Poli A edilmeyen bölge edilmeyen      5’ 3’ İşlevsel mRNA

REPLİKASYON TRANSKRİPSİYON *Birbirinin aynı iki DNA DNA üzerinde belirli bir gen *DNA Polimeraz RNA polimeraz *dNTP NTP DNA Pol RNA Pol (dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1 Ppi (NMP)n+NTP(NMP)n+1 Ppi *A-T G-C A-U G-C *Primer gerektirir Gerektirmez *Temlat DNA Temlat DNA

Bir RNA molekülü, DNA’yı kalıp olarak kullanarak ribonükleotidlerin ( ATP, GTP, CTP ve UTP- ) pirofosfatlar ayrılması suretiyle) polimerizasyonu sonucunda, 5  3 yönünde sentezlenir

Nükleotid dizelerinde bazı sinyaller bulunur ve bu sinyaller RNA polimerazın nerede ve ne sıklıkla transkripsiyona başlayacağını ve transkripsiyonun nerede sonlanacağını gösterir. İnternet DNA rep 4

ÖKARYATİK RNA POLİMERAZ ENZİMİ *Genin başlangıç noktasına yapışır ( promotor bölge) Prokaryotlarda ‘’ Pribnow kutusu’’ TATAATG Ökaryotlarda ‘’Hognes kutusu’’ TATAAAG

RNA polimeraz enzimi, DNA nın transkripsiyona uğrayacak gen kısmının başında bulunan nükleotid dizesini (promotor bölge) tanır. Sonra DNA yı bir kalıp olarak kullanır ve buna komplementer bir RNA oluşturur. Complementer RNA

Sonra genin son kısmında bulunan DNA dizelerini (sonlandırma bölgesi) tanır ve transkripsiyonu sonlandırır. *Bitiş noktası ise T bakımından zengindir.

RNA Polimeraz I 28S, 18S, 5.8S rRNA RNA Polimeraz II m-RNA Transkripsiyonu sağlayan RNA polimeraz enzimi çok alt birimli bir enzimdir. RNA Polimeraz I 28S, 18S, 5.8S rRNA RNA Polimeraz II m-RNA RNA Polimeraz III t-RNA RNA PolimerazIV Mitokondride Bakterilerde ise bir cins RNA polimeraz enzimi bulunur. Bu enzim DNA replikasyonu için gerekli RNA primerleri dışında bütün RNA ları sentezler. RNA primerleri ise primaz ile sentezlenir.

RNA polimeraz, sigma faktörü ile birlikte holoenzim oluşturur RNA polimeraz, sigma faktörü ile birlikte holoenzim oluşturur. Sigma () faktörü, DNA üzerinde bulunan promotör bölgeyi tanıyarak RNA polimerazın DNA’ya bağlanmasına yardım eder

m-RNA kalıp (templat) DNA zincirine antiparalel 5’-3’ sentezlenir. GC AU ile eşleşir.

Promotordan sonlanma bölgesine kadar uzanan DNA kısma transkripsiyon birimi denir. RNA polimeraz tarafından sentezlenen ürüne de primer transkript adı verilir. Transkripsiyon birimi Primer transkript

m-RNA SENTEZİ BASAMAKLARI *DNA templatına RNA Polimerazın bağlanması *Sentezin başlaması *Zincir uzaması Sentezin tamamlanması ve enzimin DNA dan ayrılması (sonlanma)

Hem prokaryotlarda hem ökaryotlarda RNA molekülünde ilk ribonükleotid, bir pürin ribonükleotididir. RNA polimeraz DNA molekülü boyunca ilerlerken uygun bazlı ribonükleotid trifosfatların kalıp kolun nükleotidlerine ulaşmasını sağlamak için DNA heliksi 17 baz çifti kadar açılır

Sentezin başlaması: DNA transkripsiyonu yapılacak genin genellikle başında bulunan ve o genin özel bir bölgesine (Promotor) RNA polimerazın bağlanması ile transkripsiyon başlar.

Uzama: Holoenzim bir kez promotor bölgeyi tanıyıp oturduktan sonra transkripsiyona başlar ve sigma alt birimi enzimden ayrılır. RNA polimeraz DNA polimeraz gibi bir primere gereksinim göstermez. Ayrıca RNA polimerazın endo ve ekzonükleaz aktivitesi yoktur. Bu nedenle DNA polimeraz gibi hataları onarmaz.

RNA polimeraz ribinükleotidtrifosfatları kullanarak uzayan zincire her bir nükleotid ilavesinde bir pirofasfat açığa çıkar. RNA polimeraz çift heliksin sarmalları arasında ilerlerken, sarmalları bir miktar iter.

Sonlanma: Uzama işlemi sonlanma sinyaline kadar devam eder.

Sonlanma iki şekilde olabilir. Rho ile Rho dan bağımsız sonlanma: Saç tokası şekli ( palindromlar)

RNA’nın Posttranskripsiyonel Modifikasyonu Transkripsiyon sonunda oluşan RNA’lar primer RNA’lar diye adlandırılırlar ve genellikle hemen kullanılmazlar; RNA processing diye tanımlanan bazı işlemlerden geçtikten sonra işlev görebilecek olgun RNA’lar haline gelirler Ribonükleazlar (ribozom yapısında bazı proteinler, ribozimler) nükleotitleri kopararak bu değişimleri gerçekleştirir.

Ribozomal RNA; Prokaryot ve ökaryotlarda ribozomal RNA “preribozomal (45S) RNA” halinde sentezlenirler. Preribozomal RNA, RNAazlar ile kırılarak 28S, 18S ve 5.8S’lik ribozomal RNA kısımları oluşur.

Primer tRNA’nın işlenmesi, prokaryotlarda ve ökaryotlarda birbirine benzer

Transfer RNA; Uzun molekül halinde sentezlenir ve kısaltıldıktan sonra Nükleotidiltransferaz enzimi aracılığı ile 3’ ucuna CCA dizini eklenir

m RNA Primer mRNA transkriptine heterojen nükleer RNA (hn mRNA) denir. Hn mRNA’nın uğradığı modifikasyonlar ise; *Poly A kuyruğu *Başlık (7 metil guanozin) *Exonların uzaklaştırılıp, intronların birleştirilmesi İnaktif Primer RNA (Het Nükleer RNA) İşlevsel RNA

5’ ucunda şapka oluşumu; 7-metil guanozin mRNA’nın 5’ ucuna guaniltransferaz enziminin katalizlediği reaksiyon ile eklenir-metil grubu vericisi S-adenozil metionindir (SAM) Şapka oluşumu protein sentezinin başlamasına yardımcı olur. Translasyonu hızlandırır. Şapkası olmayan ökaryatik m-RNA ların translasyonu verimli olmaz.

3’ Ucuna Poli A Eklenmesi; 3’ ucuna Poli A polimeraz ile 40-200 adenin nükleotidi eklenir. mRNA dayanıklılığını ve çekirdekten çıkış hızını arttırır. Sitoplazmada zamanla kısalır.

İntron Uzaklaştırılması; intron protein kodlamayan exon protein kodlayan dizinlerdir. İntronlar uzaklaştırılarak exonlar birleştirilir ve olgun mRNA oluşur. Küçük nükleer ribonükleoprotein yapısındaki proteinler (snRNA) exon birleşmesini kolaylaştırır ve hızlandırır.

m-RNA sitoplazmaya geçer ve protein sentezini gerçekleştirir. (Leninger movie 1001-Transkripsiyon) 158701 mRNA

Çoğu kanser tedavisinde kullanılan bazı antibiyotikler transkripsiyonu inhibe etmektedirler Actinomycin D, prokaryotlarda ve ökaryotlarda, guanin bağlanması üzerine etkilidir. Daudonomycin ve distamycin A, prokaryotlarda ve ökaryotlarda, DNA üzerine etkilidirler Rifampicin, prokaryotlarda RNA polimeraz inhibitörüdür  amanitin, ökaryotlarda RNA polimeraz inhibitörüdür

BAZI RNA TİPLERİ Tip Kısalltma İşlev Dağılım Mesajcı RNA mRNA Protein Kod. Tüm Canlılar Ribozomal RNA rRNA Protein Sentezi Taşıyıcı RNA tRNA Ters Anlamlı RNA aRNA Gen Düzen. Küçük enterfarnscı RNA siRNA Çoğu Ökaryot Mikro RNA miRNA Küçük nükleer RNA snRNA Çeşitli Ökaryot Küçük nükleolar RNA snoRNA RNA'nın çekirdekte mod Ribonükleaz P RNaz P tRNA erginleşmesi Ribonükleaz MRP RNaz MRP rRNA erginleşmesi, DNA rep Ökaryotlar Sinyal Tanıma Tanaciği RNası SRP RNA Protein ihracı Tüm canlılar

MikroRNA (miRNA) 1993, İlk miRNA Lee ve ark tarafından bitkilerde tanımlandı 2001, mi RNA terimi ilk olarak kullanıma girdi miRNA'ların varlığı çeşitli bitki ve hayvanlarda teyid edilmiştir MicroRNA lar türler arasında oldukça benzerlik gösterir

Genel Özellikler-1 miRNA yaklaşık 21-23 nükleotid uzunluğunda İnsan genomu 1000 miRNA kodlamaktadır Bir çok hücre tipinde bulunurlar ve farklı hücrelerden farklı miRNA lar expresse edilir Anormal miRNA üretimi çeşitli hastalıklar ile bulunmuş olup miRNA tedavileri araştırma aşamasındadır

Genel Özellikler-2 Gen ifadesini transkripsiyon sonrası düzenlerler miRNAlar hedef mRNA’ya tam ya da kısmi şekilde bağlanarak mRNA’ların parçalanmasına ya da protein üretiminin baskılanmasına yol açarlar.

Genel Özellikler-3 Kodlamayan RNA’lardandır (DNA’dan transkripsiyonu yapılan ama proteine çevrisi yapılmayan genler tarafından kodlanır.) Haberci “messenger” RNA’lardan farklı olarak protein sentezine neden olmazlar. miRNA'lar kendilerini tamamlayan bir grup proteinle (mikroribonükleoproteinler = miRNP) birlikte işlev görürler

Genel Özellikler-4 Pri-miRNA olarak adlandırılan primer transkriptler işlenerek, önce pre-miRNA (prekürsör) adlı kısa sap-ilmik yapılarına, sonra da fonksiyonel miRNA'ya dönüşürler.

miRNA sentez Aşamaları (RNA Pol II) 1 (Başlık) (Primer Transkript) 2 (Poli A) (Prekürsör miRNa, 70 nükleotid, sap ilmik) 3 (Exportin-5) 4 5 6 miRNA sentez Aşamaları

Bir miRNA bir veya daha çok mRNA'yı tamamlayıcıdır (komplemanterdir) miRNA hedef mRNAdaki komplementerliğine göre; ya translasyonel represyona (protein çevirisini engeller) ya da hedef mRNAnın yıkılmasına (RNA interferansa benzer bir süreçle) yol açar.

1. miRNA Transkripsiyonu ve pri-miRNA Oluşumu miRNa lar hem kendi genleri hemde intronlar tarafından üretilirler Transkripsiyon genellikle RNA Pol II tarafından gerçekleştirilir (Bazı miRNA’lar RNA Pol III) Transkripsiyon sonrası oluşan ürün pri-miRNA (Primer transkript) olarak isimlendirilir

2. Pre-miRNA Oluşumu Mikroişlemci protein kompleksi ("Microprocessor" complex ) Drosha adlı nükleaz (Klass 2 RNase III enzim) ve Pasha adlı çift iplikli RNA bağlayıcı protein (insan DGCR8- DiGeorge Syndrome Critical Region 8) Drosha kompleksi, RNA molekülünü uç ilmikten yaklaşık 22 nükleotit uzaktan keser Oluşan ürün pre-miRNA (Prekürsör miRNA), 70 nükleotid Bir pri-miRNA’dan 1-6 miRNA oluşur

3. Nükleer Transport Nucleocytoplasmic shuttle Exportin-5 Karyopherin ailesinden (importer, exporter) Enerji bağımlı olup, GTP (RanGTP) kullanır Ran is a GTP binding protein that is essential for the translocation of RNA and proteins through the nuclear pore complex. The Ran protein is also involved in control of DNA synthesis and cell cycle progression

5. miRNA oluşumu Sitoplazmaya transfer edilen miRNA Dicer ve partner protein ile (Drosophila R2D2, insan TRBP) saç tokası yapısını keser ve iki ipliği açar

6. miRISC (RNA Induced Silencing Complex) Oluşumu miRNARISC oluşumu RISC, microRNA ribonucleoprotein complex (miRNP) Nukleaz aktiviteli bir RNA-multiprotein kompleksidir 500 kDa Yapısında endonukleaz, eksonukleaz ve helikaz bulunur

RISC ; argonaute proteinleri Mi/siRNA’ya homoloji gösteren mRNA’yı parçalar. mRNA’nın translasyonunu inhibe ederek geni susturur

miRNA Fonksiyonları Gene ekspresyonun post-transkripsiyonal regülasyon, Metabolik regülasyon (miR-375 & insulin sekresyonu), Akçiğer, kasların, uzuvların morfogenezinde Tümör oluşumu, Konakçı-patojen etkileşimi (immünogenetik işlevi), Hücresel gelişim, Differansasyon, Proliferasyon, Apoptozis

miRNA Belirleme Yöntemleri real time RT-PCR Analiz Northern blot Analiz miRNA Mikroarray

miRNA ve Hastalıklar miRNA hücrelerin normal bir çok işlevinde görevli bir molekül olduğu için miRNA’lardaki kusurlar sonucu görevini yerine getirememesi çeşitli hastalıklara neden olabilmektedir. MiRNA ların rol oynadığı gösterilen hastalıklar Kanser Kardiyovasküler bozukluklar İnflamatuvar hastalıklar İnfeksiyonlar Gelişimsel bozukluklar Musküler bozukluklar Nörodejeneratif hastalıklar

miRNA ve KANSER Mir-103 ve 107 primer pankreatik tümörlerde artmış ekspresyonu Mir-21, panreatik Ca (%80) benign tümörlere (%20) daha fazla eksprese olduğu miR-143 ve miR-145 seviyeleri Kolon Ca ile bağlantılı miR-17-92; Akciğer kanseri Mir-13 ve miR-17; Lösemi Mir-1 ve 133 kardiyak hücre gelişimi, ve olgunlaşmasını kontrol ettiği belirlendi miRNA’ların (mir-122 ve 92) geleneksel karaciğer serum markerı olan ALT’den daha spesifik olduğu

KANSERİN ERKEN TANISINDA MOLEKÜLER  ALTYAPI LABORATUVARININ OLUŞTURULMASI   (Bu proje Çukurova Kalkınma Ajansı ve MEÜ BAP Tarafından Desteklenmektedir)  Bu projede Mersin ve Adana da yaşayan kanser riski taşıyan gruplarda kanserin erken tanısı İçin kullanılabilecek bir kanser belirteci olan mikroRNA düzeylerinin incelenmesi hedeflenmektedir.    

KORONER ARTER HASTALIKLARINDA miRNA ların TANIDA ÖNEMİ   (Bu proje MEÜ Tıp Fakültesi ve Boston Üniversitesi Tarafından Ortaklaşa Gerçekleştirilmektedir)