KLİNİK MİKROBİYOLOJİK TANI I Prof. Dr. Nuri KİRAZ

Bakterilerin tanımlanması ve çeşitli özelliklerinin belirlenmesi sırasında bazı özelliklerinden faydalanılmaktadır. Bunlar: 1 – Yapısal özellikleri: Şekil, boyut, hareket, boyanma özellikleri,... 2 – Biyokimyasal özellikleri: Enzimler, besiyeri 3 – Fizyolojik özellikleri : Oksijene gereksinimi, ısı etkisi,... 4 – Genetik dizinin özellikleri: DNA, RNA dizi karşılaştırmaları. Günümüzde en çok kullanılan ve bir çok bakterinin yeniden sınıflanmasını ve isimlendirilmesini sağlayan bu yöntemler olmuştur.

MİKROSKOP: Çıplak gözle görülemeyen yapıların ve mikroorganizmaların incelenmesinde kullanılan aletlerdir. İlk olarak 1683 yılında Antony Van Leeuwenhoek Temel olarak bütün mikroskoplarda aynı yapılar bulunmaktadır: a) Işık kaynağı b) Kaynaktan gelen ışınları demet halinde toplayan ve ışık şiddetini denetleyen diafragma c) Gelen ışığı kırarak incelenen cisme toplayan kondansatör d) Cismin görüntüsünü büyüterek göze ulaştıran mercekler ( Göze yakın OKÜLER, örneğe yakın olanlar OBJEKTİF)

Mikroskobun büyütme gücü objektif ve oküler büyültme miktarlarının çarpımı ile belirlenir. 100 büyültmeli bir objektifle bakılıyor ve okülerin büyültme gücü 15 ise o mikroorganizma 100x15:1500 kez büyültülmüş demektir. Genel bir kural olarak boyanmış örnekler immersiyon objektifi ile immersiyon yağı damlatılarak incelenirler. Boyasız lam-lamel arası örnekler ise kuru sistem denilen 10’luk ya da 40’lık objektiflerle incelenirler.

Amaç hareket incelemesi ise çukur lamda asılı damla ile inceleme daha iyi sonuç vermektedir. Burada mikroplu sıvı lamele konur ve lamel üzerine çukur lamın kapatılması sonrasında üste getirilerek kuru sistem objektiflerinde incelenir. Hareket özellikleri faz-kontrast mikroskoplarda da iyi gözlenir. Mikrobiylojik tanımlamada ışık mikroskobu haricinde farklı özellikleri blunan diğer mikroskoplardan da faydalanılır.

Faz-kontrast mikroskobu: Işık mikroskobu kadar büyütürken sıvı ortamda yapıların şekil ve hareketlerini belirgin hale getirir. Özellikle hareketlerin izlenmesinde faydalıdır. Farklı yoğunluklarda farklı fazlar oluşumunu belirgin olarak gösteren bir optik sistemden oluşur Karanlık alan mikroskobu: Işık mikroskobundan farklı olarak kondansatörden geçen ışınların örnekte kırılarak göze ulaşmasını sağlar. İleri düzeyde bir kontrast farkı oluşur ve böylece normalde görülemeyecek kadar ince yapıların (Örneğin spiroketlerin ) kolayca görülmesini sağlar

Elektron mikroskobu: Viruslar gibi küçük mikroorganizmaları ve hücrelerin iç yapılarını belirleyebilmek amacıyla geliştirilmiş özel mikroskoplardır. Bu mikroskoplar > 100 000 büyütme gücüne sahiptir. Ayırt etme sınırı 0.5 nanometre kadar küçüktür. Floresans mikroskobu: Florokrom denilen bazı maddelerin aldıkları ışığı daha farklı bir dalga boyuna dönüştürerek yansıtmaları kullanılarak geliştirilmiş mikroskoplardır. Özel florokrom boyalarla boyanan yapılar floresans mikroskobunda incelenebilir. Auramin M. tuberculosis’i, Calcofluor beyazı mantarları, Acridin turuncusu canlı bakterileri boyayarak görünür hale getirir. Bu mikroskoplarda ışık örneğe üst kısımdan verilmekte ve örnekteki floresans araştırılmaktadır

Mikropların mikroskopta incelenmesi Kuru ortamda mikropları incelemek için sıvı ortamda ince bir örnek lama sürülerek havada kuruması beklenir. Sonra genelde boyama yöntemleri kullanılarak inceleme yapılır. Boyama öncesinde mikroplar önce tesbit edilmelidir. Tesbit; morfolojik özelliklerinin mümkün olduğunca korunarak mikroorganizmaların lama yapışmasını sağlamakdır. Örnekler alevden üç kez geçirilerek ya da kimyasal maddeler ile (metanol, etanol,alkol-eter,...) tesbit edilebilir.

Mikropların mikroskopta incelenmesi-2 Çeşitli boyalar kullanılarak mikroplar boyanabilir. Negatif boyama: Kapsüllü bazı yapıları ortaya çıkarmakta kullanılabilir. Tüm ortam boyanırken kapsülü olan mikroplar boyanmadan kalırlar. Bu boyama yöntemi için genelde çini mürekkebi kullanılır. Pozitif boyamada ise boya mikroplar tarafından tutulur ve ortamdan farklı bir renk alırlar.

Mikropların mikroskopta incelenmesi-3 Basit boyama tek bir boyayla yapılır ve bu boyamaya en iyi örnek metilen mavisidir. Havada kuruyan ve tesbit edilen preparat üzeri metilen mavisi ile kaplanır ve iki dakika sonra boya dökülüp yıkanarak incelenir. Burada tüm yapılar mavi olarak görünür. Birleşik boyama birkaç bazik boyanın peşpeşe ya da birarada kullanıldığı boyama yöntemidir(Gram, EZN yöntemi).

Mikropların mikroskopta incelenmesi-4 GRAM yönteminde temel mekanizma hücre duvar yapısındaki farklılıktan kaynaklanmaktadır. Bu farklılığın kesin nedeni bilinmemekle birlikte duvar yapılarının kalınlığı, lipopolisakkarid yapılarla ilgili olabileceği düşünülmüştür. Bakterilerin hücre duvar yapıları karşılaştırıldığında bazı temel farklılıklar belirlenmiştir. Bu farklılıklar:

+ - ÖZELLİK Gram (+) Gram (-) Hüvre duvarı kalınlığı 20-80 nm 10 nm Duvardaki katman sayısı 1 2 Peptidoglikan içeriği >50% 10-20% Hücre duvarında teikoik asid varlığı + - Lipid ve lipoprotein içeriği oranı 0-3% 58% Protein içeriği oranı 0% 9% Lipopoisakkarid 13%

Mikropların mikroskopta incelenmesi-5 Bakteriler hücre duvar yapılarındaki özelliklere göre çeşitli bölümlerde incelenmektedir: 1 – Firmicutes bölümü: Kalın, Gram (+) hücre duvarına sahip olanlar. 2 – Gracilicutes bölümü: İnce, Gram(-) hücre duvarı 3 – Tenericutes bölümü: Yumuşak, hücre duvarı olmayan bakteriler (Mollicutes sınıfı) 4 – Mendosicutes bölümü: Hücre duvarı kusurlu ve muramik asit içermez.

Mikropların mikroskopta incelenmesi-6 Bazı bakteriler ise uygunsuz koşullarda hücre duvarlarını kaybederek yaşamlarını sürdürebilirler; buna bakterilerin L- formu denilmektedir. Bu bakteriler duvarla ilgili fonksiyonları nı ve boyanma özelliklerini kaybederler. Bakteriler hücre duvar yapılarındaki farklılıklardan başka morfolojik özellikleriyle de ayrılmaktadırlar. Yuvarlak şekillere kok boyu eninden uzun olanlara çomak adı verilir. Boyu enine eşit görünen çomaklar için kokobasil tanımı kullanılır.

Mikropların mikroskopta incelenmesi-7 Uzun zincirler yapmış koklara streptokok, kümeler yapmış koklara stafilokok, dörtlü yapılara tetrad, balya şeklinde biraraya gelenlere sarsin adı verilir. Yanyana duran iki kok diplokok adını alır. Bu yapılar özel görünümlerde bulunabilirler ve tanımlamada önem taşırlar.(Mum alevi gibi diplokok: pnömokok, kahve tanesi gibi: gonokok,..vb) Bazı çomaklar uzayıp dallanmalar gösterebilirler. Bazı bakteriler(spiroketler) ise kıvrımlara sahip olabilir.

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ Klinik Mikrobiyoloji laboratuvarlarının her zaman en önemli sorunu klinik ile yeterli iletişimi sağlayamamaktır. İdeal olan, klinik bulgular ve beklentilerin laboratuvara en uygun biçimde aktarılmasıdır. Genel olarak laboratuvar için gerekli bilgiler tabloda belirtilmektedir. Mikrobiyoloji Laboratuarına Ulaşması Gereken Bilgiler Hastanın adı-soyadı Yaş- Cinsiyet Yatan hastanın kliniği- oda numarası Klinisyenin adı ve ulaşılabilecek telefon Örneğin alındığı anatomik bölge Örneğin alındığı tarih ve saat Klinik bilgi Örnek alınırken uygulandıysa uygulanan özel işlem Antibiyotik kullanım öyküsü Düşünülen tanı

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 Örneklerin gönderilmesi konusunda bir diğer önemli nokta zamandır. Unutulmaması gereken şey mikrobiyoloji laboratuvarında; enzim, kimyasallar, reaksiyonlar,… değil, doğrudan “yaşam” ölçülmektedir. Geciken örnekte ya çok sayıda bakteri üreyecek ve yanlış sonuçlara yol açacak ya da etken ölecek ve deneyden sonuç alınamayacaktır. Eğer gecikme olacaksa uygun sıcaklıklarda veya taşıyıcı besiyerlerinde saklanmalıdır. Bakteriyel inceleme En geç iki saat içinde ya da transport besiyeri içine konularak daha uzun süre Bordetella, Gonokok hasta başında ekim Viral 24 saat içinde. 2-3 gün buzdolabında saklanabilir Anaerobik kültür Yeterli materyel 15-30 dakika içinde uygun ortama ekilmelidir. Biyopsi materyalleri ve çok miktarlarda örnekler gecikebilir

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 Örneklerin gönderilmesi konusunda bazı temel ilkeler şöyle özetlenebilir: Tüm örneklere bulaşıcı enfeksiyon etkenleri içeriyor gibi davranılmalıdır. Hastaları örnek alma konusunda bilgilendirmek uygun ve kaliteli örnek elde etmek yönünden oldukça başarılı sonuçlar vermektedir. Mikrobiyolojik inceleme özellikle bakteri kültürü için ,örnekler antibiyotik tedavisinden önce alınmalıdır. Eğer mümkün değilse laboratuvar kullanılan antibiyotikler konusunda bilgilendirilmelidir

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 Yeni bir test uygulanacaksa ya da rutin dışı bir etken aranacaksa laboratuvardan bilgi alınması esastır. Özel etkenler; özel besiyerleri, özel örnekler ve özel taşıma şartları gerektirir. Flora olan bölgelerden kültür alınırken flora ile temas etmemek, sadece lezyon bölgesinden örnek almak önemlidir. Floralı bölgelerden anerop örnek almak uygun değildir. Foley sonda ucu, kusma örneği, kolostomi içeriği gibi örneklerin kültürü yapılması önerilmez. Gastrik aspirat da sadece tüberküloz için kullanılabilir.

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 Üzerinde etiket ve kimlik bilgileri olmayan örnekler, bulaşmış ya da delinmiş kaplarla gelen örnekler de çalışılmaz. Steril kaplarda gelmeyen örneklerden de çalışma yapılmaması önerilir. Enjektör ile örneklerin gönderilmesi kesici-delici alet yaralanma riski nedeniyle önerilmez, özel taşıyıcı sistemler önerilir.Bu sistemler kulanılamadığında ise en azından iğnenin ucu açık olarak ya da bükülerek örnek gönderilmemelidir. Sinüzit için burun sürüntüsü, otitis media için kulak sürüntüsü uygun örnek değildir, anlamlı sonuç vermez. Tabloda en çok gönderilen örnekler ve dikkat edilmesi gereken noktalar özetlenmiştir:  

ALINMA ve ULAŞTIRMA SAKLANMA ÖZEL UYARILAR Abseler Mümkünse enjektörle aseptik olarak alınmalıdır. Mümkünse enjektörle gönderilmemelidir. En ideal yol özel transfer sistmleridir fakat her zaman sağlanması mümkün değildir. Anaerop kültür isteniyorsa ucu lastik tıpayla kapanarak gönderilebilir. Eküvyonla alınıyorsa en az iki eküvyona alınmalı ve taşıma besiyeriyle ulaştırılmalıdır. En kısa sürede laboratuvara ulaştırmalı ve çalışılmalı Absenin yeri ve bekleniyorsa özel etkenler (tularemi, brusella, kedi tırmığı hastalığı,...) mutlaka bildirilmelidir. Örnek almadan evvel deride alkol-iyot ya da klorheksidin ile antisepsi sağlanmalıdır. Kan (Hemokültür) Kemik iliği için de özel şişelere direkt ekim önerilir. Ateş yükselirken alınmalı. En az iki örnek alınmalı Kateter varsa bir örneğin kateterden alınması gerekir ve bu tüp üzerinde belirtilmelidir. Çok lümenli kateterlerde her lümenden örnek alınmalıdır. En kısa zamanda laboratuvara ulaştırılmalı Hemokültür şişesi ise eğer ulaştırılamıyor ise oda ısısında bekletmek önerilir. Deri mutlaka iyot /alkol ile temizlenmeli ve aseptik koşullarda şişeye ekim yapılmalı BACTEC şişelerine alınış saatleri yazılmalı Önerilen miktar: Erişkin : 10 mL Çocuk: 1-5 mL Kateterli hastalarda kateterden alınan şişede erken üreme varsa kateterin kaynak olduğu belirlenir (> 2 saat) Steril vücut sıvıları (Plevra, eklem sıvısı, perikard sıvısı assit sıvısı) Steril enjektörle alınabilir. (Özel kan kültürü sistemi şişesine ekimin faydalı olacağı düşünülmektedir. Bir miktar örnek (+ ) saklanmalıdır. Kateterler Steril olarak çıkarılıp uç kısımları steril makasla kesilip gönderilir. Kateter çıkarılmadan önce cilt antisepsisi unutulmamalıdır. En geç 2 saat içinde çalışılmalı Foley sonda kültürü önerilmez İntravasküler kateterler dışı kateterlerde standart öneriler yoktur

Beyin omurilik sıvısı (BOS) Hücre sayımı, ekim ve diğer testler için steril 2-3 kaba ayrı ayrı alınmalıdır. İdeal inceleme için en az 10 mL örnek alınması önerilir En kısa sürede çalışılmalıdır. Ponksiyonla alınır. Öncesinde KİBAS, göz dibinde ödem yönünden değerlendirme unutulmamalıdır. Bir kısım örnek (+) saklanmalıdır. Göz, kulak, burun sürüntüsü Eküvyonla alınmalı, en az iki örnek alınmalıdır. Transport besiyeri kullanılabilir En geç 2 saat içinde incelenmelidir. Burun kültürü MRSA taşıyıcılığı dışında çok fayda sağlamaz Sinüzit, otitis media Aspirasyon örnekleri almak gerekir Abse gibi davranmak gerekir Sinüzit ve otitis media tanısında sürüntü kültürleri önerilmez. Otitis eksterna için sürüntü kullanılabilir. Boğaz sürüntüsü Uygun bölgelere sürülen bir eküvyon yeterli. Antijen tayin edilecekse iki eküvyona örnek alınmalı GAS aranması için oda ısısında bekletmek fayda sağlayabilir Dil, diş ve yanaklara dokunmamaya özen gösterilmelidir İdrar Orta akım idrar alınmalı ve 2 saat içinde çalışılmalı. Gecikecekse 24 saat buzdolabında saklanabilir. Sondalı hasta ise laboratuvara bildirilmeli ve örnek sondadan asepsi kurallarına uyularak enjektöre alınmalıdır. Torbada beklenen idrar, sürgü ile toplanan idrar çalışılmaz. Kateterli hastada idrar örneği almak için kapalı drenajın bozulması önerilmez. Böbrek tüpü, J-kateteri olan hastalardan idrar örneği klinikte alınarak laboratuvara gönderilmeli ya da hasta bu konuda eğitilmelidir. Balgam Pürülan ekspektorasyonla alınan balgam değerlendirilebilir. Kaliteli olmayan örnekler çalışılmamalı En kısa sürede değerlendirilmeli Yeni örnek gereksinimi hmen bildirilmelidir. ETA ya da BAL ise mutlaka bildirilmeli ve bu örnekler kantitatif çalışılmalıdır.

Vaginal akıntı Klinikte alınmalı, en az iki eküvyonla örnek alınmalı ve en kısa zamanda laboratuvara ulaştırılmalıdır. Hızlı değerlendirme çok önemlidir. Yoksa T. vaginalis enfeksiyonları atlanabilir Üretral akıntı Üretral sürüntü en az iki eküvyonla örnek alınmalı ve en kısa zamanda laboratuvara ulaştırılmalıdır. Prostatit şüphesinde prostat mayii incelenmelidir. Hızlı değerlendirme çabuk ekim çok önemlidir. Gonokok kurumaya çok duyarlıdır. (hasta başı ekim) Akıntı yoksa üretral sürüntü ya da ilk akım idrar faydalı olabilir. Sperm önerilmez. Chlamydia enfeksiyonu için özel eküvyonlarla örnek alınıp transport sisteminde laboratuvara ulaştırılmalıdır. Dışkı Temiz ağzı kapaklı bir kapta laboratuvara ulaştırılmalıdır. Transport besiyerleri faydalıdır. Ekim en kısa sürede yapılmalıdır. AMİP aranacaksa hemen incelenmelidir. Buzdolabında saklanabilir. Toksin-A aranacaksa –70 C de uzun süreler bekletilebilir. Parazit tetkiki isteniyorsa 3 kez örnek gönderilmesi uygun olacaktır. Serolojik inceleme için kan örneği Kuru –tercihen sarı kapaklı- tüplere kan alınır. Kan alan kişi standart önlemlere her hastada özenle uymalıdır. Serumu ayrılıp buzdolabında ya da dondurularak bekletilebilir Özel testler için mutlaka laboratuvardan bilgi alınmalıdır. Moleküler inceleme Virolojik inceleme için kan örneği Mutlaka laboratuvardan bilgi alınmalıdır. Farklı etkenler için özel kaplar gerekebilir. CMV…..EDTAlı tüp HCV…. Jel içermeyen cam tüp …gibi

KAYNAKLAR Aygün G. Klinik mikrobiyoloji laboratuarında klinik ve laboratuar iletişiminin önemi. Klinik Gelişim Dergisi 2007; 20(4): 48-52. Dune WM, Pinckard JK, Hooper LV. Clinical microbiology in the year 2025. J Clin Microbiol 2002; 40: 3889-3893. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Diagnostic Microbiology. Mosby Elsevier, 12.th eds, St Louis, 2007. Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM Pres, 2.th eds Washington D.C. 2004. Miller JM. A guide to specimen management in clinical microbiology. ASM Pres, Washington D.C., 1999. Öztürk R. İnfeksiyon Hastalıklarında Laboratuar Tanı. Klinik Gelişim Dergisi 2007; 20 (4): 19-35. Rappuoli R. From Pasteur to genomics: progress and challenges in infectious diseases. Natur Medicine 2004; 10: 1177-1185. Unat EK. Temel Mikrobiyoloji. 3.Baskı, İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Yayını, İstanbul, 1997: 461-497.