Prof. Dr. İsmail Hakkı BOYACI Yüzey plazmon rezonans sistemi ve mikroorganizma tayinine yönelik biyosensör hazırlanması Prof. Dr. İsmail Hakkı BOYACI Hacettepe Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Beytepe Ankara ihb@hacettepe.edu.tr

Neden mikroorganizma tayini? Halk sağlığı Çevre sağlığı Gıda güvenliği Biyogüvenlik Biyoterör ajanı Staphylococcus aureus

Mikroorganizma tayini yöntemleri Kültürel yöntemler Mikroskobik yöntemler Kimyasal yöntemler Fiziksel yöntemler Biyokimyasal yöntemler Moleküler yöntemler İmmünolojik yöntemler Biyosensörler

Mikroorganizma tayini yöntemleri A. Diret sayım yöntemleri Kültür sayım yöntemleri (dökme plak, çift tabakalı dökme plak,agar damlatma yöntemi, membran filtre sayım yöntemleri ve diğer yöntemler) Mikroskopik sayım yöntemleri (Thoma lamı, Howard lamı, membran fitre ve diğer sayım yöntemleri) Flow sitometresi B. İndiret sayım yöntemleri En muhtemel sayı yöntemi, Tüp dilisyon yöntemi Türbidimetrik sayım yöntemi Hücre içi reaktifine dayalı yöntemler Metabolik aktiviteye dayalı sayım yöntemleri Kuru maddeye tayinine dayalı sayım yöntemi

Uzun inkübasyon sürelerine gereksinim duyulmaktadır. Kültürel yöntemler Uzun inkübasyon sürelerine gereksinim duyulmaktadır. Zahmetli yöntemlerdir. Analiz süresi 1-7 gün arasında değişmektedir.

Mikrobiyolojik analizlerde hızlı yöntemlere gereksinim duyulmaktadır. HEDEF 100 ml içme suyu içerisindeki 1 Escherichia coli’nin saptanması. Hızlı Hassas Seçici

BİYOSENSÖR Biyolojik tanıma mekanizmasına sahip, hedef molekül derşimine orantılı sinyaller üreten analiz sistemlerine biyosensör denir. Referans (a) Biyoajan (b) Çevirici (c) Yükseltici (d) İşlemci (e) Gösterge

Bioajanlar Çeviriciler Antikor Elektrokimyasal DNA Elektriksel Enzim Protein Mikroorganizma Bitkisel ve hayvansal dokular Aptamer Elektrokimyasal Elektriksel Optik Kütle hassas Termal

Yüzey plazmon rezonans sistemi (SPR): Polarize ışık, yüzeyi altın kaplı bir prizmaya gönderildiğinde ışığın bir kısmı absorplanmakta, bir kısmı da yansımakatdır. Geliş açısı değiştirilip yansıyan ışığın şiddeti izlendiğinde yansıyan ışık şiddetinde azalma görülür. Yansıyan ışığın şiddetinde maksimum kaybın gerçekleştiği açıya rezonans açısı ya da SPR açısı adı verilir. Bu geliş açısında ışık, yüzey plazmonlarını (elektron paketçikleri) harekete geçirecek, yüzey plazmon rezonans olayı gerçekleşecektir. Yüzey plazmon rezonansı iki optik ortamın ara yüzeyine ince iletken bir film yerleştirildiğinde meydana gelir. Spesifik bir geliş açısında metal yüzeyindeki elektron frekanslarının eşleşmeleri nedeniyle gelen ışık ile rezonans durumuna gelecektir. Bu rezonans durumunda enerji absorblanacağı için yansıyan ışının yoğunluğunda bir azalma meydana gelmektedir. Uyarma Yansıma Altın tabaka(~50 nm) Cam SPW ( penetrrasyon derinliği ~400 nm) Dielektrik (tampon + örnek)

Reflaktif Indeks (RI) Kayması-Zaman Grafiği Metal yüzeyiyle temas halinde ortamın özelliklerinin değişmesi veya yüzeyde birikim sağlanması durumunda rezonans açısı değişmektedir. Yüzeyde birikim kontrollü olarak sağlanması durumunda birikin madder derişimiyle ilgili kantitatif sensör çalışmalaırnda kullanılabilmektedir. Bu amaçla zamana karşı SPR açısını takip eden ticari sistemler geliştirilmiştir. Reflaktif Indeks (RI) Kayması-Zaman Grafiği SPR Sinyalinde Kayma Molecule Rinse

Krestschmann ATR Otto

Dedektör Işık Kaynağı Pirizma Altın yüzey Akış hüçresi

Deney düzeneği SpreetaTM sesnör (Texas Instruments, Dallas, TX)

Antikorun tutuklanması Yüzeyin temizlenmsi Avidin ile kaplanması (1 mg/ml, 10 μl/min) Yıkama Streptavidin Au yüzey

Antikorun tutuklanması-2 Biyotin işaretli anti-E. coli antikorunun yüzeye başlanması Yıkama, tampon Yıkama, % 1SDS Biotin conjugated antibodies

Antikor tutuklama Süre (Saniye) PBS PBS Glisin SDS Streptavidin SDS SDS PBS Süre (Saniye) Yüzeye streptavidinin ve biyotin işaretli antikorun bağlanması sonucunda sensör cevabı

Bakteri tayini E. coli Örnek enjeksiyonu (1 ml) Yıkama Rejenerasyon, % 1 SDS Farklı derişimlerde E. coli (~ 102 to 106 kob/ml) örneklerden 1 mL sensör yüzeyle etkilşemesi sağlanmaktadırwere injected. Uygun yıkama çözeltileri ile yıkama gerçekleşmektedir. Örneklem sonrasında sensör cevabında meydana gelen değişimler kaydedilmekte ve sonrasında kalibrasyon grafiği üretilmketedir. Sensör yüzeyi uygun çözeltilerle temizlenerek tekrar kullanılmaktadır.

Immunosensors using surface plasmon resonance (Real time antigen determination) The response (RU) to binding of E. coli and regeneration. Injection of A) E. coli solution (9.0×101 cfu ml-1); B) PBS; C) %1 SDS solution; D) E. coli solution(1.8×103 cfu ml-1); E) E. coli solution(1.8×105 cfu ml-1).

Reusability The sensor responses for E. coli solution (~103 cfu/ml) intra-day.

Selectivity The change in RU induced by the binding E. aerogenes (1.8×105 cfu/ml) and E. dissolvens (1.4×104 cfu/ml) and E. coli (1.8×104 cfu/ml).

SPR-based immunosensor Real water samples Table. The results of real water samples obtained from the developed immunosensor and plate counting method Water Source SPR-based immunosensor (cfu ml-1) Plate counting method River < Detection Limit Not Detected Lake 2.4 × 102 5.6 × 102 E. coli inoculated tap water 1.9 × 104 3.1 × 104

Sonuç… SPR sistemi kullanılarak çok farklı hedef moleküle karşı biyonsensör geliştirilebilmekte farklı etkileşimler takip edilebilmektedir. Diğer biyosensörlere göre daha hızlı, hassas ve seçici uygulamalar gerçekleştirilebilmektedir. En önemli avantajı sandviç analizlerde olduğu gibi ikincil tanıyıcı molekül gereksinim duymamasıdır. Aynı SPR yüzeyleri tekrar tekrar kullanılabilmektedir. Sistem optimize edilerek taşınabilir sistemlerin geliştirilmesi mümkün olabilmektedir. Yaygın kullanıma uygun bir teknolojidir.

Daha fazla bilgi için: F. Baldini, A. N. Chester, J. Homola, and S. Martellucci (editors): Optical Chemical Sensors, NATO Science Series II, Vol. 224, Springer, 2006. J. Homola (editor): Surface Plasmon Resonance Based Sensors, Springer, 2006. M. Piliarik, H. Vaisocherová, J. Homola: Surface Plasmon Resonance Biosensing, in Biosensors and Biodetection, Methods in Molecular Biology, Vol. 503, editors A. Rasooly, K. E. Herold, Humana Press, 2009, 65-88. Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Development of an Immunosensor Based On Surface Plasmon Resonance for Enumeration of Escherichia coli in Water Samples, Food Research International, 40, 803-807 (2007). Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors, Biotechnology Journal 7 1003-1011 (2009). ihb@hacettepe.edu.tr