AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE YENİLİKLER Yrd.Doç.Dr.Hakan Özveri Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı

Genetikte Yaşanan Gelişmeler “ERA of GENOMICS” “GENETİK ÇAĞI” Tüm DNA sekanslarının sistematik olarak çalışılarak ortaya konulması Human Genome Project(HGP)- İnsan Genom Projesi International Hapmap Project Encylopedia of DNA Elements Project(ENCODE)

Genetikte Yaşanan Gelişmeler 30-35 bin gen (Tahmin 80-140 bindi) Normal spermatogenezde görev alan gen sayısı: 2000 ve üzeri 1 no’lu kromozom- 2968 gen Y Kromozumu- 231 gen Gen az ama ürün çeşitliliği inanılmaz!!!(500 bin-1 milyon protein)

Hap-MAP Projesi Kişiye özel ilaç üretimi Hastalıkların hızlı tanısı SNP’lerin analizi: Etnik Farklılıklar İnsanlar arası farklar Kişilerin ilaçlara/çevresel faktörlere yanıtı Kişiye özel ilaç üretimi Hastalıkların hızlı tanısı

Microarray Teknolojisi Gen çipi DNA çipi Biyoçip Ekprese edilen binlerce genin ekspresyon düzeyini aynı anda izlemek için sıralı bir şekilde oluşturulmuş DNA spotları

Microarray Teknolojisi Microarray’de onbinlerce spot Yüzeye tutturulan DNA segmentleri (20 ile 100 ya da daha fazla nükleotid uzunluğunda olabilir) probe olarak tanımlı

Microarray Teknolojisi Tüm sekanslama girişimlerinde olduğu gibi microarray kullanımında da amaç Bir organizmanın belirli bir hücresinde,belirli bir zamanda ve belirli koşullar altında hangi genler ifade edilmektedir?

Microarray Teknolojisi Anormal Hücreler Normal Hücreler RNA İzolasyonu Reverse Transcriptase İşaretleme Microarrayde Hibridizasyon

Microarray Teknolojisi-İnfertilite Spermiyogramda anomali saptanmayan fertil ve infertil erkeklerde Microarray analizlerinin karşılaştırılması Fertil ve infertil erkeklerin Transkriptom’ları arasında istatistiki fark var. Özellikle erkek gamet formasyonu ve maturasyonu ile ilgili genlerin ekspresyonlarında anlamlı farklar mevcut. Garrido N ve ark., Fertil Steril; Vol 91, No: 4, Supp Nisan 2009

Çoğunluğunda tam gösterilememiş olsa da GENETİK PATOLOJİ? Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji Tanı (n=500) % Varikosel 34.0 Obstrüksiyon 26.0 Testiküler Yetmezlik 16.4 Idiyopatik 26.0 Ejakülatuar 2.4 Kriptorşidi 3.0 ASA 2.0 Genetik nedenler 0.5 Gonadotoxinler 2.0 Infeksiyonlar 1.0 Sistemik hastalıklar 0.2 Endokrinopati 1.0 Travma 1.0 Çoğunluğunda tam gösterilememiş olsa da GENETİK PATOLOJİ? HGP Öncesi

Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji 1. Genetik (%15-20) A)Kromozomal Bozukluklar Azoospermi- Normospermi ~%5.8 Klinefelter Sendromu (XXY) Azoospermi-Şiddetli Oligospermi ~%4.15 Diğer Eşey kromozomal değişik. Azoospermi- Normospermi %0.15 Robertsonian Translokasyonlar Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %0.75 Resiprokal Translokasyonlar Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi %0.75 B)Y Kromozom Delesyonları Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi ~%8.2 AZFa Azoospermi-SCOS %0.4 AZFb Azoospermi-Spermatogenik Arrest %1.3 AZFc Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %2.7 AZFb-c SCOS/Spermatogenik Arrest %0.7 AZFa-b Azoospermi-SCOS-Şid. Oligospermi %0.1 AZFa+b+c Azoospermi-SCOS %0.3 Parsiyel AZFc Azoospermi-Normospermi %2.3 AZF dışında %0.5 C)Gen Mutasyonları %1-6 CFTR (CBAVD hastalarında %60-70) Obstrüktif Azoospermi %5 AR Azoospermi-Oligospermi %1.7 INSL3-LGR8 Kriptorşidizm <%5 2.Varikosel (%35) 3. İdiyopatik (%25) 4. Enfeksiyon (%10) 5. Endokrin (<%5) 6. İmmünolojik (<%5) 7. Kanal Obstrüksiyonları(<%5)

İNFERTİLİTEDE GENETİK 9.766 İnfertil Erkek 94.465 Erkek Yenidoğan Kromozomal Anomali %5.8 %0.38 Seks Kromozomal Anomali %4.2 %0.14 Otozomal Kromozomal Anomali %1.5 %0.25 Johnson MD, Fertil Steril,1998; 70:397 Van Assche E, Hum Reprod, 1996; Dec; 11 Suppl 4:1-24.

Erkek faktörüne Bağlı İnfertilitede GENETİK Gros kromozomal anomaliler Tüm infertil erkeklerin %6’ında %1 Normospermik %4-5 Oligospermik %5-20 azospermik Klinefelter Translokasyonlar Y Kromozom Mikrodelesyonları Azospermide %5-15

İnfertilite - Azoospermi: % 5-20

Azoospermi değerlendirmesinde Amaç – Ürolog gözüyle Düzeltilebilir patolojilerin saptanması ve tedavisi İnfertilite ile görülebilen hayatı tehdit edici hastalıkların tanınması ve tedavisi Üremeye yardımcı tedavi yöntemlerine gereksinimi azaltmak- maliyetin düşürülmesi Üremeye yardımcı tedavi yöntemleri ile çocuklara geçebilecek genetik geçişli patolojilerin saptanması ve çiftlerin bilgilendirilmesi

Hormonal değerlendirme Genetik değerlendirme Radyolojik değerlendirme Azoospermi Değerlendirmesi Azoospermi En az 2 semen analizinde, mikroskopik incelemede ejakülatta hiç spermatozoa görülmemesi durumu Anamnez Fizik muayene Semen analizi (2x) Hormonal değerlendirme Genetik değerlendirme 10 TEDAVİ Radyolojik değerlendirme Biyopsi/Sitoloji 20

Azoospermi-Tipleri Obstrüktif olmayan azoospermi (% 60-70) Testiste sperm üretiminde bir problem varlığı Obstrüktif azoospermi (% 30-40) Üreme sisteminin herhangi bir yerinde obstrüksiyon varlığı

GENETİK BOZUKLUKLAR Grup I: Kromozoma ait nümerik ya da yapısal anomaliler 47 XXY Kromozomların yapısal anomalileri (delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon) Grup II: Epigenetik Mutasyon ya da kırılma olmaksızın oluşan ve gen ekspresyonunu değiştiren biyokimyasal DNA modifikasyonları (DNA Metilasyonu, Histon Metilasyonu, Histon asetilasyonu, histon fosforilazyonu, kromatin re-modelling) Grup III: Tek gen hastalıkları Kistik Fibrozis Grup IV: Poligenik/multifaktöryel genetik hastalıklar En sık görülen ve insanda infertilitede dahil hastalıkların çoğunluğunda etyolojik faktör Grup V: Non-Kromozomal DNA Mutasyonları Mitokondriyal Mutasyonlar

Kromozomal Anomaliler(Nümerik) Klinefelter Sendromu (47 XXY – Non-mozaik Form) 1/500-1/1000 canlı doğumda Azospermide en sık kromozomal neden(%14) Atrofik testisler ( ~ 5 ml) Azospermi Jinekomasti KS’lu hastaların %80-100’ünde normal haploid sex kromozomu Sperm elde etme oranları %27-45 Denschlag ve ark., Fertil Steril, 2004 Klasik Triad ?

Klinefelter Sendromu Tanı Periferik kandan karyotip analizi Uzun süre, fazla işgücü, pahalı, Mozaik tipte düşük sensitivite 2. Yanak içi mukozasından Barr Body(Cisimcik) Sitolojisi Ucuz ve sensitif 3. FISH Pahalı, tecrübeli eleman, software 4. X Kromozomu üzerindeki iki genin metilasyon düzeyleri arasındaki fark – 5 $ Familial Mental Retardation Gene 1 (FMR1) ile X-Chromosome Inactivating Transcript(XCIT) Quantitative Flourescence PCR- Multipl genetik patoloji

Kantitatif Floresan PCR(QF-PCR) Seks kromozom anomalileri Mikrodelesyonlar/Duplikasyonlar AR CAG tekrarları Bütün kromozomal bozuklukların eş zamanlı saptanabilmesi

Y Kromozom Mikrodelesyonları Erkek infertilitesi ile Y Kr.Mikrodelesyon ilişkisi : 1976 Tiepolo ve Zuffardi Y Uzun kolunda AZF bölgesi Gen bölgesi Aday Gen/genler AZFa USP9Y, DBY(Dead Box on the Y), UTY AZFb E1F1AY, RBMY AZFc DAZ, CDY1, BPY2, PRY AZFd DYS237 Oligospermi - %6-8 Azospermi - %3-15

AZF delesyon tiplerinin dağılımı

Y Kromozom Mikrodelesyonları Kimi taramalıyız? % Fertil Erkek 0.4 İnfertil erkek 7.0 Azospermi 7-11 Sertoli Cell Only 35

Aday gen olarak DAZLA DAZ’ın 3. kromozom kısa kolundaki otozomal homolog geni DAZ ile %83 benzer DAZL DAZ geninin 30-40 milyon yol önce oluşmuş babası mı? Tanı konulamayan erkek infertilitesinin %60’ı Otozomal resesif mutasyonlara bağlıdır Lilford R ve ark., Br Med J, 1994

Y-Mikrodelesyonlarında Sperm Elde Etme Komplet AZFa ya da AZFb - Kombine AZFa+AZFb+AZFc Kombine AZFb+AZFc Kombine AZFa+AZFc Parsiyel AZFa ve AZFb(Tek ya da kombine) + Parsiyel ya da komplet AZFc Kombine parsiyel AZFb+AZFc

Y-Mikrodelesyonlarında Testis Histolojisi Komplet AZFa Germ Hücre Aplazisi ya da SCO Komplet AZFb Matürasyon arresti(Spermatosit ya da spermatid evresinde) Komplet AZFc Şiddetli Hipospermatogenez Şiddetli Oligospermi Kombine parsiyel AZFa+AZFb Miks Histoloji Kombine parsiyel AZFb+AZFc SCO ya da matürasyon arresti

Gr/gr Delesyonları AZFc bölgesinde segmentler arasındaki Homolog Rekombinasyonlar sonucu 21 gen delesyona uğrar AZFc’de DAZ geninden 2 kopya, CDY1 den 1 kopya ve çeşitli transkripsiyon ünitelerinden de bazı kısımların delesyonu

AZFc AZFc delesyonu olan erkeklerde zamana bağlı olarak sperm üretiminde azalma Simoni ve ark, Fertil Steril, 1997, 67:542-547 AZFc delesyonu bilinen erkeklerde Kriyoprezervasyon yapılmalıdır. Krausz C ve ark, Hum Reprod, 1999, 14:1717-1721

AZF Duplikasyonları 4 adet DAZ geni oluşumu ile giden duplikasyonlar Repping 2003, 2004 AZFc parsiyel duplikasyonu erkek infertilitesinde bir risk faktörüdür. Lin ve ark., 2007, Hum Mutat Azospermik ve Oligospermik hastalarda DAZ gen sayısında artış Writz ve ark., 2005, Fertil Steril

Y Kromozom Mikrodelesyonları Klinik Önemi Spermatogenezde ciddi bozulma İnfertiliteye neden olan genetik hastalıklar arasında en sık tespit edilen bozukluk Yardımla üreme teknikleri Üreme için tek şans Sperm elde etmenin mümkün olmadığı durumlar(AZFa, AZFb) Erkek çocukta da kalıtsal olarak Mikrodelesyon geçişi Genetik bilgilendirme çok önemli!

EPİGENETİK Transkripsiyondaki Rolü Epigenetik Modifikasyon DNA Metilasyonu Gen Baskılanması Histon Metilasyonu Gen baskılanması ve aktivasyonu Histon Demetilasyonu Histon Asetilasyonu Gen aktivasyonu Histon Deasetilasyonu Gen baskılanması Histon Fosforilizasyonu Gen aktivasyonu ve baskılanması Histon Ubiquitylation Histone sumoylation

Spermatogenezin Hormonal Stimülasyonunda Rol Oynayan ve Mutasyonunda Spermatogenezi Bozan Genler Gonadotropin Releasing Hormon(GnRH) Kalig 1 geni Fibroblast growth factor receptor GnRH receptor Folikül Stimülan Hormon Beta-Subunit Alfa subunit(LH ve TSH ile ortak) FSH receptor LH Beta Subunit Alfa subunit(FSH ve TSH ile ortak) LH receptor Testosteron Steroidogenezdeki biyosentez enzimleri Steroid acute regulatory protein gene Androgene receptor gene (CAG repeat-26 dan fazla tekrar riski arttırıyor)

Gen Mutasyonları Kistik fibroz gen mutasyonları Konjenital bilateral vaz deferens agenezisi İdiyopatik bilateral epididimal obstrüksiyon Kallman sendromu (KAL-1) Androjen reseptör gen mutasyonu İmmotil silia sendromu Polikistik böbrek hastalığı Orak hücre anemisi ve talasemi

Kistik Fibrozis-CBAVD Otozomal resesif geçiş 1/2500 sıklık Pulmoner ve pankreatik fonksiyon bozukluğu 7q31 üzerinde ”Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Geni” CVAD’li hastaların %85’inde en az 1 CF gen mutasyonu KF’li hastaların >%95 CBAVD nedeni ile infertil

Kistik Fibrozis-CBAVD Klinik Kronik pulmoner obstrüksiyon ve enfeksiyonlar Pankreatik yetmezlik Neonatal mekonyum ileusu İnfertilite

Kistik Fibrozis-CBAVD Muayene Epididim gövde ve kuyruğu yok Testis, caput epididim palpabl

Kistik Fibrozis Kromozom 7q. 31 Kistik Fibrozis Kromozom 7q.31.2 >1200 mutasyon En sık görülen 24 mutasyon Mutasyon Sıklık% ΔF508 66 R117H 0 0.3 A455E 0.1 G542X 2.4 R1162X S549N G551D 1.6 R347 0.2 R560T N1303K 1.3 Dl507 1898+1G®T W1282X 1.2 3849+10kbC®T 2184delA R533X 0.7 G85E 2789+5G®A 621+1G®T 1078delT 3659delC 1717- G®T 0.6 R334W 711+1G®T Jarvi K, Chan PTK. In: “Reproductive Medicine Secrets”. 2004. Chan PTK. J Male Sex Reprod Health. 2002;2:161-164.

Kistik Fibrozis-CFTR CFTR geni non-coding DNA bölgesinde İntron 8’in splicing alanında Polythymidine yolunda varyasyonlar, azalmalar (5T, 7T, 9T) 5T azalması Splicingde azalma CFTR mRNA’da %50 azalma Matür ve fonksiyonel CFTR proteininde azalma

CFTR-Fertilite Sperm kapasitasyonu için hücre içi pH ve Plazma membran hiperpolarizasyonu Gerekli olan- Ekstraselüler HCO3- Adenil siklaz aktivasyonu ve CAMP üretimi Sonuç- CFTR spermde azalmış fertilizasyon kapasitesine neden oluyor. Xu MW ve ark, Proc Natl Acad Sci, June 2007

Kistik Fibrozis-CFTR İdiyopatik Obstrüktif Azospermide ve Palpable Vaz Deferens %50 CFTR gen Mutasyonları Öneri : CBAVD, CUAVD ve İdiyopatik Obstrüktif Azospermide CFTR taraması (5T)

Kistik Fibrozis-CBAVD Klinik Önemi 1 partnerde CFTR mutasyonu var ise diğer partneri tara! Erkekte CBAVD var ise kadın partneri tara! CBAVD, CUAVD de renal hipoplazi ya da ageneziyi araştır!

Androjen Reseptör Gen Mutasyonları 1/60.000 sıklıkta AR’nin olmaması ya da fonksiyonel olarak farklılaşması X Kromozomu üzerinde (Xq11-q12) 300’den fazla mutasyon

Androjen Reseptör Gen Mutasyonları AR – 8 exon Exon 1 – CAG Tekrarı Normal bireylerde 17-26 tekrar Hasta bireylerde 40-52 tekrar Tanı – PCR ile AR CAG tekrar bölgesinin incelenmesi

Erkek faktörüne Bağlı İnfertilitede GENETİK Hangi hastada hangi test? Non-obstrüktif azoospermi Karyotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi Şiddetli oligospermi CBAVD – obstrüktif azoospermi Kistik Fibrozis taraması– Genişletilmiş panel 5T analizi (Tek ya da çift taraflı vaz deferens yokluğu tespit edildiğinde)

İnfertilitede genetiğin rolü Yanıt bekleyen sorular: 1-Normal spermatogenezde, sperm maturasyonunda ve sperm fonksiyonlarında hangi genler rol oynamaktadır? 2- İnfertiliteye yol açan polimorfizm ya da mutasyonlar nelerdir, bunları saptayarak hastaları daha iyi tedavi edebilir miyiz? 3- Spermatogenez esnasında normal gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmalar nelerdir? 4- Erkek infertilitesinde anormal mayotik rekombinasyon ya da ayrışma nasıl rol oynar? 5- Embriyogenez üzerinde anormal DNA hasarlarının etkisi nedir?

SONUÇ Daha ayrıntılı genetik ve moleküler çalışmalara ihtiyaç var Yeni metodlar hızlı, tekrarlanabilir ve maliyeti kabul edilebilir olmalı

İnfertilitede genetiğin rolü HGP’in katkısı: Micro-RNA’lar: Post-transkripsiyonel düzenleyici fonksiyon Kısa non-coding RNA’lar. Fonksiyonları ve ekspresyon şekilleri tam bilinmiyor. NOA’li hastalar ve kontrol grubunda testiste microarray tekniği ile miRNA ekspresyonu NOA hastalarında kontrol grubuna göre farklı miRNA ekpresyonu Lian J ve ark., Reprod Biol Endocrinol, 2009, Feb 11;7:13

İnfertilitede genetiğin rolü HGP’in katkısı: Ultraconserved elements(UCEs) En azından 200 bp’lık sekanslar 481 UCE saptandı Omurgalıların gelişimsel regülasyonunda görev? Lian J ve ark., Reprod Biol Endocrinol, 2009, Feb 11;7:13

SPERMİYOGRAM- Dünya Sağlık Örgütü Kriterleri-1999 (En az 2 semen analizi sonucuna göre) Parametre Normal Değer Volüm 1.5-5 ml pH 7.2-7.8 Sperm Konsantrasyonu  20 mil./ml. Toplam sperm sayısı  40 mil./ml. Sperm Hareketi  50% (Normal morfolojide) Sperm Morfolojisi  30% Normal morfoloji (WHO 1999)  %14(Kruger-Tygerberg Strict Kriterleri

MSOME(Motile Sperm Organellar Morphology Examination) a Morfolojik olarak normal şekil ve içerik b Morfolojik olarak normal şekil ancak küçük nüklear vakuoller c Morfolojik olarak normal şekil ancak büyük nüklear vakuoller

Sperm Morfolojisi 400X 6600X

MSOME(Motile Sperm Organellar Morphology Examination) Büyük Vakuoller

Morfolojik olarak normal spermatozoa nükleus kriterleri Şekil Oval, simetrik ve düzgün konturlu olmalı Ortalama uzunluk 4.75±0.28 μm Ortalama genişlik 3.28±0.20 μm İçerik Nüklear kromatin kütlesinden ekstrüzyon ya da invajinasyon olmaması Normal nüklear alanın %4’ünden fazlasından vakuol olmaması