METALLO-BETA-LAKTAMAZLAR Araş.Gör.Dr.Fatma Esenkaya Taşbent Danışman:Yrd.Doç.Dr.Mehmet Özdemir

Antibakteriyel Direnç Mekanizmaları Günümüzde antibiyotiklerin düzensiz kullanımının artması, yoğun bakım ünitelerinde yatan ve immün sistemi bozulmuş hasta sayısının artması, gıda endüstrisinde antibiyotik kullanımı gibi nedenlerle mikroorganizmalardaki antibiyotik direnci giderek artmaktadır.

Antibakteriyel Direnç Mekanizmaları Antibiyotiklerin uygunsuz ve gelişigüzel kullanımı ile gerek toplum kökenli gerekse de hastane kökenli infeksiyonların tedavisinde önemli sorunlar yaşanmaktadır.

Antibiyotik direnci Antibiyotik direnci, bir bakterinin antimikrobiyal bir ajanın öldürücü veya üremeyi durdurucu etkisine karşı koyabilme yeteneğidir. Antibiyotik direncinin yalnızca yaygın antibiyotik kullanımı sonucu değil, bakterilerin olumsuz çevre koşulları için kullandığı savunma sürecinin bir parçası olduğu da belirtilmektedir. Günümüzde tüm dünyada bir yandan hızla yeni ilaçlar geliştirilmekte iken, öte yandan bunlara hızla direnç kazanan mikroorganizmalarla oluşan infeksiyonlar bildirilmekte ve bu sorunun boyutları giderek büyümektedir.

Antibiyotik direnci Bakterilerin antimikrobik maddelere karşı gösterdiği direnç mekanizmaları üç grup altında toplanabilir : 1) İntrinsik Direnç 2) Çevre ve koşullara bağlı direnç 3) Kazanılmış Direnç

1.İntrinsik Direnç (Doğal Direnç) Bir bakterinin genetik özelliği nedeniyle bazı antibiyotiklere olan doğal direncini tanımlar. Örneğin; hemen hemen bütün gram negatifler vankomisine,enterokoklarda sefalosporinlere doğal olarak dirençlidir.

2. Çevre ve Koşullara Bağlı Direnç Antibiyotiklerin invitro ve invivo etkinliklerinin farklılık göstermesine neden olan dirençtir. Dokudaki pH değişiklikleri, antibiyotiğin infeksiyon bölgesine ulaşamaması ve oksijen basıncı değişiklikleri gibi nedenlerle invitro testlerde etkili olarak değerlendirilen antibiyotik invivo koşullarda etki göstermeyebilir.

3.Kazanılmış Direnç Bakterinin genetik özelliklerindeki değişimlere bağlı olarak; ya kromozom, transpozon veya plazmid DNA’sındaki mutasyonlarla ya da direnç geni taşıyan DNA dizilerinin başka bakterilerden transformasyon, transdüksiyon veya konjugasyon yoluyla alınmasıyla ortaya çıkan dirençtir.

Kazanılmış direnç mekanizmaları: 1.İlacın hedefinde olan değişiklikler A)Antibiyotiğin bağlanma bölgesinde değişiklikler sonucu afinite azalması B)Bakterinin ilaçtan etkilenmeyen farklı bir metabolik yol kullanması 2. Bakterinin sentezlediği enzimlerle antibiyotiğin inaktive edilmesi 3.Bakteri içinde ilaç toplanmasının engellenmesi A)Permeabilite azalması ve antibiyotiğin hücre içine girememesi B)Aktif pompalama ile antibiyotiğin hücre dışına atılması

Kazanılmış direnç mekanizmaları Bir bakteri,bu mekanizmalardan bir veya birkaçını kullanarak, farklı etki mekanizmasına sahip antibiyotiklere karşı direnç kazanabilmektedir

Kazanılmış Direnç Kromozomal Direnç : Kromozomda spontan mutasyon oluşmasına bağlıdır. Hücrenin ilaca geçirgenliği azalır ya da ilacın hedefinde değişiklik olur. Bir bakteri hücresinde spontan mutasyon oluşma olasılığı her hücre bölünmesinde 10-5 - 10-10civarındadır ve bu nedenle klinikte bu tip direnç çok nadirdir.

Kazanılmış Direnç Plazmidlere Bağlı Direnç : Plazmidler, kromozomlardan bağımsız olarak replike olan, çift sarmallı DNA yapısında, kromozom dışı genetik yapılardır. Klinikte görülen direnç daha çok plazmidlere bağlıdır. R- plazmidi adı verilen direnç plazmidleri, sayıları 10’ a varabilen farklı antibiyotiklere karşı direnç genleri taşımaktadır. Bulaşıcı tipteki bu direnç, daha çok antibiyotiği inaktive eden enzimlerle olmaktadır. Özellikle hastane gibi yoğun antibiyotik kullanılan yerlerde direnç genlerini taşıyan bakterilerde artış görülmektedir.

Kazanılmış Direnç Transpozonlara Bağlı Direnç : Transpozonlar, bir DNA molekülünden diğerine geçebilen DNA dizileridir. Plazmidlerden farkı bağımsız olarak replike olamamalarıdır. Kromozom veya plazmid içinde bulunmakta, bunlar arasında yer değiştirebilmektedir. Son yıllarda bazı transpozon veya plazmidlerde " integron " adı verilen ve yeni genlerin kazanılmasını sağlayan genetik yapılar bulunduğu gösterilmiştir. Bir bakterinin çok kısa bir süre içinde bir çok antibiyotiğe birden “çoğul dirençli " duruma gelişinde bu elementlerin rolü olduğu anlaşılmıştır.

Kazanılmış Direnç Çapraz Direnç : Belli bir ilaca karşı dirençli olan bazı mikroorganizmaların, aynı veya benzer mekanizmalar ile etki eden diğer ilaçlara da dirençli olması halidir. Bu durum genellikle yapıları benzer ilaçlar arasında gözlenmektedir. Ancak bazen tümüyle ilgisiz ilaçlar arasında da görülebilir. Kromozomal veya ekstrakromozomal orjinli olabilir.

Kazanılmış dİrenç mekanizmaları: Yanlış ve gereksiz antibiyotik kullanımı dirence neden olmaz.Bakterilerde dirence neden olan genler doğada zaten var olan genetik yapılardır.İnsanlar bu genlerin varlığından değil, bu genlerin yayılıp yaygınlaşmasından sorumludur. Gereksiz, yaygın ve yanlış antibiyotik kullanılması durumunda duyarlı bakteriler ölürken, mutasyonlar ile direnç kazanan az sayıdaki bakteri seleksiyona uğrar.Sonraki infeksiyonlarda sadece bu dirençli bakteriler ortamda bulunur.

Beta- laktamazlar Beta-laktamazlar, beta laktam grubu antibiyotiklerde beta-laktam halkasının amid bağlarını parçalayarak etki gösterirler. Kromozomal ya da plazmid kaynaklıdırlar.

Beta- laktamazlar Beta-laktamazlar ilk olarak penisilinleri hidrolize etmeleriyle tanımlanmıştır. Bundan sonra her yeni beta laktam grubu antibiyotik kullanılmasıyla bu tabloya yeni betalaktamazlar eklenmiştir. Oksimino sefalosporinlerin 1980’ lerin başında kullanılmasıyla GSBL, 1980’lerin sonlarına doğru beta laktam/beta laktam inhibitörlerinin yaygın kullanımıyla inhibitör rezistan TEM enzimleri, 1990’larda sefamisinlerin kullanımıyla plazmid kaynaklı Amp-C type enzimler, daha sonra da karbapenemlerin yaygın kullanımıyla karbapenemazlar ortaya çıkmıştır.

Beta- laktamazlar Son yıllarda genişlemiş spektrumlu beta laktamazlar, inhibitör-rezistan beta-laktamazlar, AmpC-tipi enzimler ve metallo-beta-laktamaz ve non metallo-beta-laktamaz tip karbapenemazlarda oldukça fazla sayıda artış gözlenmiştir

Beta Laktamazların sınıflandırılması: Beta Laktamazların sınıflandırılmasında en çok Bush-Jacopy-Medeiros ve Ambler sınıflandırmaları kullanılmaktadır.

Beta Laktamazların sınıflandırılması 1980 yılında Beta laktamazlar Ambler tarafından moleküler yapılarına göre 4 sınıfa ayrılmışlardır. Sınıf A: Aktif bölgelerinde serin aminoasiti taşıyan, penisilinleri hidroliz eden beta-laktamazlardır. Sınıf B: Aktivite gösterebilmeleri için çinkoya bağlı tiyol grupları gerektiren metallo-beta-laktamazlardır. Sınıf C: Kromozomal AmpC geni tarafından kodlanması nedeniyle AmpC enzimler olarak da adlandırılan öncelikle sefalosporinazlardan oluşan enzimlerdir. Sınıf D: Oksasilini hidroliz eden serin beta- laktamazlardır.

Beta Laktamazların sınıflandırılması 1995 yılında Bush ve arkadaşları beta laktamazları; penisilin, oksasilin, karbenisilin, sefaloridin, genişlemiş spektrumlu sefalosporinler ve imipeneme karşı hidrolitik spektrumları ve klavulanik asite duyarlılıklarını esas alarak 4 grup ve bazı alt gruplarda toplamışlardır.

Bush-Jacopy-Medeiros (Fonksiyonel Sınıflama) Ambler (Moleküler Sınıflama) Grup 1 sefalosporinazlar Sınıf C sefalosporinazlar Grup 2 penisilinazlar Sınıf A penisilinazlar 2a Stafilokokal penisilinazlar 2b TEM-1 ve SHV-1 Betalaktamazlar 2be-ESBL’ler 2br-inhibitör dirençli Beta-laktamazlar 2c-karbenisilinazlar 2e-sefalosporinazlar 2f-karbapenemazlar Grup 2d Sınıf D kloksasilin hidrolize eden enzimler (OXA) Grup 3 (3a, 3b, 3c) Sınıf B metallo-beta-laktamazlar Grup 4 Sınıflanmamış

Beta Laktamazların sınıflandırılması Bush ve arkadaşları substrat özgüllüğü ve beta- laktamaz inhibitörlerine duyarlılığının temel alındığı fenotipik sınıflandırma ile tüm enzimleri sınıflandırmış ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarında antibiyogram ile ilişki kurulabilmesi gibi avantajlar sağlamıştır. Dezavantajı ise tek bir nokta mutasyonu ile substrat özgüllüğünün değişebilmesidir. Bu enzimlerin moleküler sınıflandırılması ise 1980 yılında Ambler tarafından yapılmıştır.Moleküler sınıf A, C ve D’nin aktif bölgelerinde serin bulunurken, sınıf B’ de ise çinko bulunur. Beta-laktamazların nükleotid dizilenmesini esas alan bu sınıflama mutasyonlardan etkilenmemektedir

Karbapenemazlar Karbapenemleri hidrolize eden beta-laktamazlar karbapenem kullanımına paralel olarak son yıllarda artan oranlarda bildirilmektedir. Saptanmaları çok önemli çünkü GSBL (+) se ilk tedavi seçeneği karbapenemlerdir. Bu direnç mekanizmalarını edinen bakteriler tüm karbapenemlere dirençli olacaktır fakat testlerde duyarlı gözükebilirler. Plazmid ve integron kökenliler kolayca yayılmakta infeksiyon kontrolü için saptanmaları gereklidir. GSBL (+) lerde atlanmamalı!

Karbapenemazlar Karbapenemazlar Ambler sınıflamasında üç grupta yer alırlar: Moleküler sınıf A’ daki karbapenemazların aktif bölgesinde serin iyonu vardır ve klavulanik asit ile inhibe olur. Moleküler sınıf B’ de enzimin aktif bölgesi çinko iyonu içerir ve Metallo-Beta-Laktamaz (MBL) olarak sınıflandırılan bu grup klasik beta-laktam inhibitörlerine dirençlidir. Metal şelatörlere ya da thiol kompenentlerine duyarlıdırlar. Moleküler sınıf D karbapenemazlar enzimin aktif bölgesinde serin içerirler, beta-laktamaz inhibitörlerine zayıf duyarlıdırlar.

Karbapenemazlar Sınıf Enzim En sık görülen tür Sınıf A KPC, SME, IMI, NMC, GES Enterobacteriaceae (P. aeruginosa’da nadir) Sınıf B (metallo-b-laktamaz) IMP, VIM, GIM, SPM, IND, NDM-1 P. aeruginosa Enterobacteriacea Acinetobacter spp. Sınıf D OXA Enterobacteriaceae (OXA-48)

Sınıf D Karbapenemazlar Serin beta-laktamazlardır Klavulanik asit ile inhibe olmazlar İn vitro olarak NaCl ile inhibe olurlar Karbapenemleri genellikle düşük düzeyde etkilerler 3. Kuşak sefalosporinleri etkilemezler En sık Acinetobacter spp. Fakat Enterobacteriaceae’de de yayılmaya başladı

Sınıf A Karbapenemazlar Fonksiyonel grup 2f Karbapenem direncinin yanında penisilin ve aztreonam direnci de mevcuttur. En fazla tazobaktam olmak üzere diğer beta-laktam inhibitörlerine duyarlıdırlar. Meropenemden ziyade imipenem direnci daha belirgindir. Bu direnci taşıyan suşlarda karbapenemazların yanında Amp-C tip beta- laktamazları ve TEM-1 tip beta laktamazları birlikte sentezleyebilmelerinden dolayı geniş spektrumlu bir beta laktam antibiyotik direnci oluşturabilirler

Sınıf B Karbapenemazlar Metallo beta laktamazlar Ambler sınıf B veya Bush grup 3’ de yer alan karbapenemazlar MBL olarak bilinirler, klinik açıdan en önemli karbapenemazlardır. Metallo beta laktamazlar, diğer beta laktamazlardan farklı olarak aktif bölgelerinde çinko iyonu bulunan enzimlerdir. Bu enzimler klavulanik asit, tazobaktam, sulbaktam gibi klasik beta laktamaz inhibitörlerinden etkilenmezler ama EDTA (etilen diamin tetra asetikasit) gibi bir metal şelatörü ile inaktive olurlar.

Sınıf B Karbapenemazlar Metallo beta laktamazlar Bu enzimlerin en önemli özelliği monobaktamlar dışında tüm beta-laktamları ve karbapenemleri hidrolize edebilmeleridir.

Metallo beta laktamazlar 1960 yılında ilk olarak metallo beta laktamaz enzimi Bacillus cereus’ta tanımlandı, sonra 1980’ li yılların başında Stenotrophomonas maltophilia’da gösterildi. Daha sonra imipenemi hidrolize eden metallo beta laktamaz enzimi Bacillus fragilis ve Aeromonas hydrophiliada da tanımlandı.

Metallo beta laktamazlar Aktarılabilir metallo beta laktamaz enziminin bulunmasıyla karbapenemlere direnç gelişimi ile ilgili endişeler artmıştır. Metallo beta laktamazları kodlayan genler genelde klas1 (bazen klas3) integronlarca taşınıp, sonra transpozonların içine yerleştirilip yüksek derecede aktarılabilir bir genetik araç elde edilir. Ayrıca integron içindeki başka gen kasetleri, aminoglikozid direncine neden olarak bu antibiyotiklerin alternatif tedavide kullanımını engeller.

MBL’lerin sınıflandırılması Aminoasid dizilim homolojisini araştırılarak yapılan çalışmalarda 4 tip MBL saptanmıştır. Bunlar IMP, VIM, SPM ve GIM tipi MBL’ dir. Ayrıca MBL’ler imipenem ve diğer beta laktamları hidrolize etme temeline göre alt gruplara ayrılmıştır (alt grup 3a, 3b, 3c) Grup 3a’ da imipenem ve penisilinler güçlü, sefalosporinler zayıf hidrolize olur. 3b enzimleri gerçek karbapenemazlardır. Çünkü karbapenem hidrolizi spesifiktir.

MBL’lerin sınıflandırılması Metallo beta laktamazların moleküler düzeyde sınıflanması ve standardize edilmesi oldukça zordur. Bu enzimler üç alt sınıfta gruplandırılmıştır. Sınıf B1: çinko iyonuyla birleşecekleri aktif bölgelerinde üç histidin, bir sistin aminoasidi içeren enzimlerden oluşur. Bu grup içerisinde transfer edilebilen IPM, VIM, GIM ve SPM-1 enzimleri bulunur. Sınıf B2: Bu enzimlerde ise birinci pozisyonda histidin yerine asparajin bulunur. Bu gruba örnek olarak SFH–1 enzimi verilebilir. Sınıf B3: Tetramer yapısındaki L1 enzimi bulunur.

MBL enzim inhibitörleri Bütün metallo beta laktamazların inaktivatörü olarak EDTA (diaminotetra asetik asit) , 10- phenanthrolin ve dipikolinik asit rapor edilmiştir. Dipikolinik asit (özellikle Enterobacteriaceae) Tiyol bileşikleri (öz. Acinetobacter) Merkaptopropiyonik asit (MPA)ve merkaptoasetik asit (SMA) Metallo beta laktamaz enzimi üreten bakteriler ile oluşan infeksiyonların tedavisinde beta laktam/beta laktamaz inhibitör kombinasyonlarının kullanılması tedavide etkili olmamaktadır.

MBL enzim inhibitörleri Metallo beta laktamaz enzimlerinin yapılarındaki aktif bölgelerin farklılığından dolayı bütün MBL enzimlerine etkili olabilecek tek bir inhibitörün bulunması oldukca güçtür. B-laktamaz inhibitörü olan klavulonik asit düşük toksisiteye sahip ve memeli hücreleri ile etkileşmezken MBL enzim inhibitörleri ile ilgili diğer önemli sorunda MBL lerin aktif bölge yapılarının memelilerdeki hücresel fonksiyonlarda yaşamsal önemi olan enzimlerle benzer özellikte olmasıdır.

MBL enzim inhibitörleri: MBL inhibitörü olarak çok çeşitli, yapısal olarak farklı bileşikler incelenmiş bunlarla ilgili çeşitli çalışmalar yapılmıştır; Tiyoester türevleri, triflorometil alkolleri, ketonlar, tiyoller, sülfonil hidrozonlar, trisiklik doğal ürünler, süksinik asit türevleri, bifenil tetrazoller, sisteinilpeptidler, merkaptokarboksilatlar, 1-β metilkarbapenem, sefotetan, tiyoksi- sefalosporinler ve penisilin türevleri sayılabilir

MBL enzim inhibitörleri Yeni geliştirilen bileşikler beta laktam yapısı çevresinde sentez edilmektedir ve bu bileşikler farmokokinetik açıdan daha umut verici olabilirler. Tedavi edici olarak, klinikte kullanılabilen β- laktamlar (örneğin aztreonam), kompetatif inhibisyona bağlı potansiyel bir MBL inhibitörü olduğu için ayrıca önerilebilir

MBL’ ların Tespiti Bakterilerde MBL enzim genlerinin tespit edilmesi GSBL’ nin erken tespiti kadar önemlidir. MBL enzimi taşıyan bakterilerin tanımlanmasında çeşitli fenotipik yöntemler kullanılmaktadır. MBL üreten etkenle infekte hastaların optimal tedavisi için bu direncin tanınması ve yayılmasının kontrol edilebilmesi gerekmektedir. Ancak halen CLSI’ ın önerdiği bir tarama testi bulunmamaktadır.

MBL’ ların Tespiti Örneğin; Enterobacteriaceae’ların çoğu ve bazı Acinetobacter spp türleri MBL enzimi taşıdığı halde 1–2 μg/ml imipenem MIC değerleri ile duyarlı görünecektir. Bu nedenle MBL tespitinde tarama plağı uygulamasında bakteri türü dikkate alınmalıdır. . Örneğin Pseudomonaslar, Enterobacteriaceae’lardan daha yüksek karbapenem MIC değerlerine sahiptir.

1- Modifiye Hodge test: Hodge ve arkadaşları N. gonorhoeae’de penisilinaz aktivitesinin gösterilmesi için Hodge testini kullanmışlardır. Lee ve arkadaşları ise MBL enziminini saptamak için Modifiye Hodge testini geliştirmişlerdir. Bu test için imipenem hassas E. coli ATCC 25922 kökeni, imipenem diski ( 10 μg ) ve test edilecek bakteri kökeni gerekmektedir. MHA yüzeyine 0.5 McFarland’ı ayarlanmış, bir gece inkübasyona bırakılmış standart E.coli kökeni kültür süspansiyonunun ekimi yapılır, plak kuruyunca ortasına 10 μg imipenem diski yerleştirilir.

Modifiye Hodge test: İmipenem diskinin tam kenarından başlanıp dışa doğru doğrusal olarak imipenem dirençli suşun ekimi yapılır. Bir gecelik inkübasyon sonrasında inhibisyon zonunda yonca yaprağı şeklinde bozulmanın olması MBL pozitifliği olarak kabul edilir.

Modifiye HodgeTesti ATCC 25922 E.coli Klinik izolat Pozitif kontrol Negatif kontrol

2)Kombine disk testi: Kombine disk testi: Plak içerisine yerleştirilen 2 imipenem diskinden bir tanesine EDTA eklendikten sonraki inhibisyon zon çapı farkına göre değerlendirmenin yapıldığı testtir. EDTA solüsyonunun eklendiği imipenem/EDTA diskinin inhibisyon zonu tek başına imipenem diski zon çapından ≥ 7 mm büyük ise MBL pozitif bakteri izolatı kabul edilmektedir.

Kombine disk testi:

3)Çift disk sinerji testi: Çift disk sinerji testi: Amaç imipenem inhibisyon zonunun EDTA varlığında genişleyip genişlemediğini tesbit ederek MBL pozitif bakteri izolatlarını tanımlamaktır. İmipenem diski ve merkezinden 10mm uzağına daha önce hazırlanan boş disk yerleştirilerek yapılan testtir. Boş disk üzerine EDTA eklendikten sonra imipenem diski inhibisyon zonunun EDTA eklenmiş boş diske doğru genişlemesi sinerjistik inhibisyon zonu olarak değerlendirildi.

Çift disk sinerji testi:

MBL E Test yöntemi Test stribinin bir tarafında imipenem diğer tarafında ise imipenem ve EDTA bulunmaktadır. İmipenem MİK değerinin EDTA’nın olduğu taraftaki MİK değerinden 8 kat yüksek ve üzerinde bir değer olması ya da fantom zonunun görülmesi MBL pozitifliği olarak değerlendirilir.

MBL E test yöntemi:

E Test pozitif

E Test negatif

TEŞEKKÜRLER