KÜLTÜR ALMA ve KOLONİ SAYMA YÖNTEMLERİ

KÜLTÜR ALMA TEKNİKLERİ

Mikrobiyolojide uygun örnek toplama neden önemlidir? Örnek toplama mikrobiyolojik çalışmaların bel kemiğini oluşturur. Farklı örnekler için faklı örnek toplama yöntemleri vardır. Kaliteli hizmet için bunlar mutlaka uygulanmalıdır.

Örnek toplamadan önce sorulması gereken önemli sorular? Enfeksiyon şüphesi var mı? Enfeksiyonun doğal yapısı nedir? (Bakteriyel, viral, mikolojik veya parazitolojik)‏ Hangi test önceliklidir? Uygun istem yapıldı mı?

Örnek toplamadan önce sorulması gereken önemli sorular? Ne zaman, Nereden, Nasıl alınmalı? Doğru örnek kabı seçtim mi? Örneği neden hemen göndermeliyim, gönderemezsem ne yapmalıyım ? Laboratuvara ne zaman göndermeliyim?

İDEAL İSTEM FORMU Hasta adı : yaşı: cinsiyeti: Tanı : Zaman : Tarih: Alan kişi : Acil / Rutin : Örneğin yapısı: Nereden alındığı: Ne araştırılacağı: Kullanılan antibiyotik: Doktor/Hemşire Telefon no: bilgileri içermelidir.

Neden uygun yazılmış bir istem? İsteminiz yasal bir evraktır. Test sürecini belirler. Eksik istem formları olumsuzluklara yol açabilir. Doktor tarafından doldurulmuş okunaklı formların, laboratuvar-klinik ilişkisinde önemli katkısı bulunur. Telefon numarası belirtilmesi hastayla ilgili ciddi durumlarda kolay iletişimi sağlar.

Örnek en erken ne zaman alınmalı? ANTİBİYOTİK TEDAVİSİ BAŞLANMADAN ÖNCE!!!

Nasıl kaplar kullanılmalı? sızdırmaz, kırılmaz, steril olmalıdır.

Yüksek riskli örnekler işaretlenmelidir. Tbc Tifo, Kolera, Şarbon, HIV/ HBV/HCV şüpheli TÜM ÖRNEKLER

Uygun sonuç için: Sonuç kalitesi hasta başında yapılan işlemlerle yakın ilişkilidir. Uygun örnek alma ve transport işlemleri çok önemlidir. Örnek toplama esnasında mikrobiyoloji ile zamanında iletişim önemlidir. Toplama ve transport esnasındaki olumsuzluklar laboratuvara mutlaka bildirilmelidir. Örneği alan kişi kuralları bilmeli ve bu kurallara mutlaka uymalıdır. Mike

Örnek, (mümkünse) kontaminasyonu minimum düzeye indirecek enfeksiyona kapalı yerlerden alınmalıdır.

KAN KÜLTÜRÜ Kan miktarı sensitiviteyi etkileyen çok önemli faktördür. Tek set; bir aerob bir anaerob şişeden oluşur. İdeal olarak 10 ml kan iki şişeye paylaştırılmalıdır. Tek set kan kültürünün duyarlılığı %5’ den azdır. Mike/Mary?

KAN KÜLTÜRÜ Alınan set sayısı ile gerçek sepsis pozitifliğini yakalama arasında doğru ilişki vardır. Kateter kan kültürü örneği Kateterden kan kültürü alınırsa aynı zamanda periferik damardan da alınmalıdır. Kan kültürü PPV’si; Aynı anda kateter ve venden alındığında % 96 Her ikisi de kataterden alındığında, %50 Her ikisi de venden alındığında ise %98’dir. Mike

KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ *Ateş yükselmeden 1 saat önce veya ateş yükselir yükselmez *Kanda en yüksek konsantrasyon *Ateşin ne zaman yükseleceğinin tespiti zor olduğu için 3 set kan kültürü/24 saat *Antibiyotik verilmeden hemen önce

ŞİŞE HAZIRLAMA Hasta barkodu şişe barkodunu kapatmayacak şekilde yapıştırılır.

KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ-2 Deri% 70 isopropil veya etil alkolle temizlendikten sonra 1-1,5 dakika beklenir, %2 iodin ile silinir 1 dakika beklenir tekrar palpe edilmeden kan alınır. *Yetişkinler için her şişeye en az 5 ml kan alınır. Kültür şişesi kapağı %70 alkolle dezenfekte edilip kan aseptik koşullarda şişeye boşaltılır.

KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ-2 Şişe üzerine kanın alındığı saat ve yer (Periferik damar, kateter) yazılır. Kan örneğinin uygun şişeye konulup konulmadığı kontrol edildikten sonra laboratuvara gönderilmelidir. Gönderilemiyorsa oda ısısında bekletilmeli, kesinlikle buz dolabına konulmamalıdır!!!!!

KAN KÜLTÜR ÖRNEKLERİ-3 *2 saat oda ısısında bekletilebilir. Zorunlu hallerde 24 saate kadar oda ısısında bekleyebilir. Kan kültür şişesi kesinlikle buzdolabına konmaz. * Kan kültürü alma tarihi ve saati hastaya ait bilgilerle beraber ve şüphelenilen infeksiyon mutlaka belirtilir.

VÜCUT SIVI ÖRNEKLERİ BOS . Yeterli miktarda örnek gönderilmelidir. *BOS örnekleri laboratuvara 15 dakika içinde ulaşmalıdır. Kesinlikle buzdolabında bekletilmemelidir.

Asit , Safra , Perikard , Plevra ve Sinoviyal Sıvılar Yeterli miktarda örnek bekletilmeden laboratuvara gönderilmelidir. *Buzdolabında bekletilmemelidir.

GERÇEK ETKEN İZOLASYONU İÇİN; Örneği uygun zamanda alınız. Patojen izolasyonunu kolaylaştıracak zaman aralığını kullanınız. Yeterli miktarda örnek alınız.

Personelin bilgileri periyodik eğitimlerle güncellenmelidir. PERSONEL EĞİTİMİ Doktor ve hemşireler örnek toplama konusunda yeterli donanıma sahip olmalıdırlar. Personelin bilgileri periyodik eğitimlerle güncellenmelidir.

YARA ÖRNEKLERİ Laboratuvar araştırmaları için genellikle püy ve eksuda swapla laboratuvara gönderilir. Swap etkili bir örnek toplama aracı değildir.

YARA ÖRNEKLERİ *İstemde: Örneklerin alındığı spesifik anatomik bölge mutlaka belirtilmelidir. *Yüzeyel yara ile derin veya cerrahi yaralar ayırt edilmelidir. *Cilt flora bakterileri ile kontaminasyon değerlendirmeyi güçleştirdiği için aspirat veya biyopsi örnekleri tercih edilmelidir. *İnfeksiyonu temsil eden örnek lezyonun ilerleyen kenarından alınmalıdır.

YARA ÖRNEKLERİ *Yanık yaralarından kültür: Temizleme ve debridman sonrası alınmalı ve biyopsi örnekleri tercih edilmelidir. *Tüm örnekler en geç 1 saat içinde lab.’a gönderilmelidir. *Zorunlu hallerde 24 saate kadar oda ısısında bekletilebilir.

Yüzeyel Yaralar *Aspirasyon örnekleri tercih edilmelidir. *Cilt %70 alkol ve iyot solüsyonu ile dezenfekte edilmelidir . *2-5 ml enjektör ile lezyon tabanından aspirasyon yapılmalıdır. *Eğer materyal gelmez ise steril SF verilerek aspirasyon tekrarlanmalıdır. * Eğer vezikül veya bül varsa hem sıvı hem lezyon tabanındaki hücreler aspire edilmelidir.

Derin Yaralar ve Apseler *Yüzey dezenfeksiyonu yapılmalıdır. *Lezyon tabanından aspirasyon yapılmalı ve steril SF içerisinde gönderilmelidir.

Kültür İçin Örnek Alınırken Dikkat Edilmesi Gereken Koşullar: 1-Örnek esas enfeksiyon bölgesinden alınmalıdır. Bu sırada bitişik doku, organ veya sekresyonlara temas edilmemelidir. 2-Etken mikroorganizmanın izolasyon şansı, muayene maddesinin uygun zamanda alınmasına bağlıdır. Sabah alınan örnekler konsantredir ve patojenleri en yüksek konsantrasyonda içerirler. Sabah alınan ilk idrar ve balgam örneklerinde aside dirençli bakteriler, mantarlar ve diğer patojenler için optimum üreme sağlanır.

3-İstenen kültür tekniklerini uygulayabilmek için yeterli miktarda örnek alınmalıdır. Yetersiz miktarlar yanlış negatif sonuca yol açabilir. 4-Uygun örnek alma araçları ve steril örnek kapları kullanarak, aseptik teknikle örnek alınmalı.

5-Örnek mümkünse antibiyotik verilmeden önce alınmalıdır. 6-Uygun istem yapılmalıdır.

7-Örneğin alındığı yerin bulunduğu anatomik bölge tanımlanmalıdır. 8-Örnekler mümkün olan en kısa sürede (30 dakika içinde) laboratuvara gönderilmelidir. .

ÖRNEKLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Buzdolabı ısısında (+4° C)‏ -İdrar -Dışkı, rektal sürüntü -Virüs, klamidya, mikoplazma tanımlanacak örnekler (En fazla 24 saat!)‏ -Balgam, BAL -Mantar kültürü için alınmış örnekler

Oda ısısında (22° C )‏ -Anaerop örnekler -Kan (otomatik sistemler için)‏ -Genital bölgeden örnekler, -Göz, iç kulak örnekleri -Vücut sıvıları(peritoneal, perikardiyal, plevral, safra, eklem sıvısı)‏ -Boğaz, nazofarenks sürüntüsü

Vücut ısısında (37° C)‏ -Gastrik biyopsi (hemen ekilmeli)‏ -BOS (hemen ekilmeli)‏ -Gastrik biyopsi (hemen ekilmeli)‏ -Kemik, kemik iliği

Dondurucu ısısında (-20 /-70° C)‏ -Serum örnekleri -Dokular (-70° C) (formol veya alkol koyulmamalı)‏ - Bakteri stok kültürleri - Virüs tanımlanacak örnekler - Uzun süre saklanacak tüm örnekler (-70° C)‏

İDRAR ÖRNEKLERİ *Böbrekler, üreter ve mesane normalde sterildir. *Atılırken üretradaki bakterilerle kontaminasyon oluşur

İDRAR ÖRNEKLERİ-2 *Dışardan bulaş önlenmeli *Steril, geniş ağızlı kaplar *Sabah idrarı/ mesanede 4 saat beklemiş idrar

İDRAR ÖRNEKLERİ-3 *Orta akım idrarı *Sonda ile idrar alınması *Suprapubik aspirasyon

İDRAR ÖRNEKLERİ-4 Orta akım idrar örneği *İlk 10-15 ml idrar dışarı atılır. *Orta akım idrar örneği steril idrar kabına alınır. *Son idrar dışarı atılır. *Örnek en az 10 ml

İDRAR ÖRNEKLERİ-5 Taşıma ve saklama koşulları: *oda ısısında hemen laboratuvara ulaştırılmalı. *Zorunlu durumlarda +4 oC'de en fazla 24 saat saklanabilir. .

İDRAR ÖRNEKLERİ-6 Üriner sistem tüberkülozu şüphesinde *3 gün, sabah idrarı steril kaplara alınarak hemen laboratuvara gönderilmelidir. *24 saatlik idrar toplanması uygun değildir.

İDRAR ÖRNEKLERİ-7 Kateter ile idrar örneği alımı: *Aseptik kurallara uygun olarak kateter mesaneye yerleştirilir. * İdrarın ilk 15 ml'si akıtıldıktan sonra gelen kısmı steril kap içerisine alınır. *Yüksek oranda hastane infeksiyon riski taşıdığı için kaçınılmalıdır.

İDRAR ÖRNEKLERİ-8 Sürekli idrar kateteri ile idrar örneği alımı: *İdrar torbasının borusu klemplenerek idrar birikmesi sağlanır. *Kateterden örnek alınacak bölge % 70’lik alkol ile silinerek dezenfekte edilir. *Enjektör ile 5-10 ml idrar alınır ve steril bir tüp ya da kap içerisine aktarılarak göderilir.

İDRAR ÖRNEKLERİ-9 Bebeklerde plastik torbalarla idrar örneği *Bebekte penis/vulva çevresi iyice temizlenir. Steril idrar toplama torbaları yapıştırılarak sık sık izlenir. (45 dk içinde idrar toplanamazsa yeni torba) bekletilmeden laboratuvara gönderilir. NOT: Yenidoğan ve küçük bebekler dışında idrar torbalarından mikrobiyolojik örnek alınmaz.

İDRAR ÖRNEKLERİ-10 Suprapubik aspirasyon: *Yenidoğanlar, küçük bebekler ve temizleme yöntemi ile idrar alınmasına rağmen başarısız olan erişkinlerde

GAİTA ÖRNEKLERİ *Örnek kaplarının steril olması gerekmez. *Temiz geniş ağızlı ve kapalı kaplar yeterlidir. *Parazit incelemesinde örnekler bekletilmeden lab’.a ulaştırılmalıdır. Spesifik mikrorganizmalar aranacaksa önceden laboratuvar bilgilendirilir

GAİTA ÖRNEKLERİ-2 *Baryum , magnezyum veya kristal bileşikleri uygulamasından hemen sonra alınan örnekler parazit incelemesi için uygun değildir. İlk uygulamadan 5 gün sonra örnek alınmalıdır. *Gaita kültürlerinde anaerobik inceleme yapılmaz. *Kültür için örnekler 1 saat içinde laboratuarda olmalı bu sağlanamıyorsa 24 saati aşmayacak şekilde buzdolabında saklanabilir.

KOLONİ SAYMA YÖNTEMLERİ

Koloni Sayımı Bu yöntemlerin prensibi mikroorganizmanın katı besiyerinde koloni oluturması, bu kolonilerin sayılarak örnekteki mikroorganizma sayısının hesaplanmasıdır. Dökme, yayma ve damlatma olarak 3 ekilde uygulanır

Dökme Yöntemi Dökme yönteminde 1 ml örnek steril petri kutusuna pipetlenir, üzerine 45 oC 'a kadar soğutulmuş agarlı besiyerinden yaklaşık 15 ml dökülür, besiyeri ile örnek karıştırılır, besiyeri katılaştıktan sonra petri kutuları inkübasyona bırakılır. Bu yöntemin avantajı ekim yapılacak tüpten 1 ml pipetlendiği için yayma yöntemine göre 10 misli daha az mikroorganizma içeren örneklerde sayım yapılabilmesidir

Yayma Yöntemi Yayma yönteminin esası, önceden petri kutularına dökülüp katılaştırılmış (hatta bu şekilde stoklanmış) ve belirli bir düzeyde kurutulmuş besiyerleri üzerine 0,1 ml örnek aktarılarak drigalski spatülü denilen kıvrık bir cam baget ile bu miktarın besiyeri yüzeyine yayılmasıdır.

Damlatma Yöntemi Damlatma yönteminde ise 0,01 (ya da 0,05 ; besiyeri uygun ise 0,1) ml örnek petri kutusunda önceden dökülmüş, katılaştırılmış ve belirli bir düzeyde kurutulmuş besiyeri üzerine damlatılır, yayma yapılmadan besiyerinin damlayı emmesi beklenir. Dolayısı ile koloniler sadece yaklaşık 2-3 cm kadar çapı olan bir alanda yoğun ve bu nedenle küçük olarak gelişir.

Bu yöntemin rutin gıda kontrolünde kullanımı yaygın deildir Bu yöntemin rutin gıda kontrolünde kullanımı yaygın deildir. Bir petri kutusunun tabanının 2; 3; 4; hatta 6' ya bölünerek her bölmede farklı örnek ve/veya seyreltiden ekim yapılması, buna göre laboratuvarda besiyeri ve petri kutusundan tasarruf salanması bu yöntemin en büyük avantajıdır. Bu yöntem sayımdan ziyade titre belirleme (yarı kantitatif sayım) amacıyla kullanılabilir.

Petri film Besiyeri bir film tabakası halinde plastik bir destek tabakasına bir film tabakası halinde dökülmüş, kurutulmuş ve bu şekilde kullanıma hazır steril preparat haline getirilmiştir. Analiz aşamasında üstteki korutucu tabaka kaldırılarak 1 ml örnek 5 cm çaplı bu alana aktarılır, koruyucu tabaka kapatılır ve özel bir aparatla bu hacmin tüm alana eşit olarak dağılması sağlanır. Standart inkübasyon sonunda koloniler sayılarak işlem bitirilir.

Koloni Sayısının Hesaplanması Hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın inkübasyon bitiminde petri kutularında sayım vakit geçirmeden yapılmalıdır. Önceleri 30-300 arasındaki koloni içeren seyreltilerdeki ekimler dikkate alınır iken, son zamanlarda ardışık iki seyreltiden yapılan ekim sonuçlarından hareketle ve ağırlıklı aritmetik ortalama ile örnekteki sayı hesaplanmaktadır.

En Muhtemel Sayı (EMS) Yöntemi Yöntemin prensibi ardışık 3 seyreltiden sıvı besiyerlerine ekim yapıp inkübasyon sonunda gelime olanları pozitif olarak değerlendirmek ve istatistik yöntemlerle elde edilmiş tablolardan yararlanılarak örnekteki sayıyı hesaplamaktır

Spiral Plak Yöntemi Spiral plak yöntemi uygun katı besiyeri içeren petri kutularına spiral eklinde (Arşimet spirali) bir eksen etrafında dönen sistemde sıvı inokülümün dağıtıcı bir kol ile merkezden kenarlara doru seyrelerek ekim yapılmasıdır. Cihaza tutturulmuş olan özel şırınga örnek hacmini 10000:1 'e kadar azaltarak dağıtmakta olup besiyerinin her bölmesine bırakılan sıvı miktarı bellidir.

Uygun sıcaklıkta inkübasyon sonucunda koloni gelişiminin merkezde daha yüksek yoğunlukta olmak üzere kenarlara doru azalarak meydana geldiği gözlenir. Yöntemde sayım, manuel olarak sisteme ait bir grid (şablon) kullanılarak veya lazerle çalışan elektronik sayıcılarla yapılır. Kolonilerin gerçek yoğunluğuna balı olarak bir veya daha fazla alanda görünen koloniler sayılır

Spiral plak sisteminde sadece örnek sisteme verilmekte, cihaz örneği otomatik olarak analize almakta ve sonraki örnek için sistemi sterilize etmektedir. Her ne kadar spiral plak analizinde kullanılan cihaz yüksek maliyet ile elde edilmekte ise de, analiz işlemleri sırasında bata besiyeri ve seyreltme tüplerinden tasarruf edilmekte, ayrıca pipet gibi laboratuvar malzemesi kullanılmamakta, böylece analiz giderleri kayda değer ölçüde azalmaktadır

Yüzeyden Yapılan Sayımlar Çalıma tezgahları ve gövde et gibi çok farklı materyalde yüzeyden alınacak örneklerde çeşitli mikroorganizmaların sayımı yapılmaktadır. Daha önceleri standart bir alan steril bir şekilde işaretlenerek buradan sürtme (swab) yöntemi ile örnek alınmakta, bu sürtme çubukları örnek olarak kabul edilmekte, buradan standart seyreltme ile ekim yapılmakta iken bugün "dip slide" adı verilen ve pek çok ticari firma tarafından pazarlanan hazır besiyerleri bu amaçla kullanılmaktadır.

Bu hazır besiyerleri, alanı belirli bir plastik levha üzerinde genellikle ön ve arkada farklı agarlı besiyerlerini hafif dışa doğru bombeli bir şekilde bulunduran, böylelikle aynı örnekte aynı sıcaklıkta inkübe edilecek 2 farklı mikroorganizmayı beraberce kontrol edebilecek sistemlerdir.

Havadan Örnek Alma Çeşitli gıda iletmelerinde havada bulunan mikroorganizma sayısının bilinmesi ve buna balı olarak önlem alınması gerekmektedir. Havada bulunan mikroorganizma sayısını belirlemede en pratik gibi görülen yöntem, çalıma ortamına amaca uygun besiyeri dökülmüş bir petri kutusunun kapağının belirli bir süre açık bırakılması ise de, bu uygulamada belirli bir süre içinde iletme havasındaki sirkülasyona balı olarak farklı sayım sonuçları elde edilebilmesi gibi kayda değer bir dezavantajı vardır

Membran Filitrasyon Teknii Membran filitrasyon yöntemi su (içme, iletme, kullanma), merubat gibi sıvı gıdaların ve eker, tuz gibi suda tam olarak çözülen katı gıdaların analizinde ve özellikle gıdada aranılan mikroorganizma sayısı 10 ml 'de 1 ve daha az gibi standart EMS yöntemi ile belirlenemeyecek kadar az ise uygulanabilecek hemen hemen tek yöntemdir.

Her ne kadar EMS yöntemi ile teorik olarak 3 adet 10'ar litre besiyerine 1'er litre, 3 adet 1'er litre besiyerine 100' er ml ve 3 adet 100' er ml besiyerine 10' ar ml ekim gibi uygulamalar ile EMS yönteminin duyarlıı artırılabilirse de bu tip uygulamaların rutin gıda kontrollerinde yeri yoktur.

Metabolizmaya Dayalı Sayımlar Mikrobiyel aktivitenin ölçülmesine dayanan pek çok sistem içinde gıdaların rutin kontrolünde yaygın olarak kullanılan yöntem elektriki impedans ölçümüdür.

Mikroskobik Sayımlar Bu sayım yöntemleri mikroorganizma sayımı yapılacak olan materyalin mikroskop altında incelenmesi prensibine dayanmaktadır. Bu amaçla çok sayıda sayım teknii ve bu tekniklere uygun ekipmanlar gelitirilmitir. Direk mikroskobik sayım yöntemleri canlı ve ölü tüm mikroorganizmaların sayılması gibi önemli bir dezavantaja sahip olmakla birlikte bu yöntemlerin bata sayım süresi ve maliyet olmak üzere pek çok üstün yanı da bulunmaktadır.

Thoma Lamı ile Sayım