Sperm, Oosit Transportu ve Fertilizasyon Doç. Dr. Erbil DOĞAN Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Üreme Endokrinolojisi ve İnfertilite Bilim Dalı

ÖZET Spermin genital sistemde transportu Ovulasyon sonrasında oositin transportu Fertilizasyon IVF’de fertilizasyon başarısızlığı

Aristotle (M.Ö. 384-322.) Hipokrat (M. Ö.460-377) “Embriyonun doku ve organlarını oluşturan biyolojik materyal menstrüel kandan gelmektedir.”

“… kadın overlerde (dişi testisleri) kendi tohumunu oluşturur, bu tohum tüpler vasıtasıyla uterusa gelir ve erkek tohumu ile birleşir.” Aristo doktrinine ters olarak Ancak bu görüş 12.yy’a kadar fazla kabul görmedi!! Claudius Galen (MS. 130-200.)

Preformasyon teorisi Anton van Leeuwenhoek (1632 -1723) İnsanın tamanlanmış hali oosit veya spermin içinde hazır bulunmaktadır. Preformasyon teorisi

“Zigot nükleusu iki farklı nüklesun birleşmesinden oluşur: germinal vesikülden gelen dişi nükleus ve penetre olan spermden gelen erkek nükleus” Wilhelm oscar hertwig alman biyologu ilk olarak1875 de fertilizasyonu deniz kestanelerinde yaptığı deneylerle tanımladı. Oosit ve spermin nukleuslarının füzyonunu gösterdi ve fertilizasyon için tek bir sperm gerektiğini ilk kez o söyledi (1876) cleavage nucleus (i.e., the zygote's nucleus) arises from the conjugation of two different sexual nuclei, a female nucleus which is derived from the germinal vesicle and a male nucleus which is derived from the body of an entering spermatozoon Wilhelm Oscar Hertwig (1849 – 1922)

spermin genital sistem transportunun regülasyonu fertilizasyon şansını en yüksek tutabilmek ve en iyi morfoloji ve motiliteye sahip spermerin başarılı olmasını sağlamak amacıyla düzenlenmiştir. A- External servikal osdan geçiş B- Fallop tüpünde endosalpingeal epitel ile sperm intreaksiyonu C- fallop tüpünde hiperaktive spermler D- Tubal ampulla transverse kesitinde occ

Sperm Transportu Spermatogenezin başlamasından 72 gün sonra sperm kaudal epididime ulaşır. Motilite ve fertilizasyon yeteneği yavaş yavaş epididimisdeki transport sırasında kazanılır. Epididim resmi epididim ejakülasyon için bir depolama görevi görür ve bu fonksiyonu yerine getrimesi için dolaşımda yeterli testosterona uygun skrotal ısıya gerek duyar.

Spermlerin %35’i geri akımla kaybedilir. Ejakülasyon sonrası semen önce koagüle olur, sonra 20-30 dakika içinde prostat enzimleriyle likefiye olur Alkali pH vajen asiditesinden spermleri geçici olarak korur vaginada kalan spermler iki saat içinde inaktive olur. Spermlerin %35’i geri akımla kaybedilir. Ejakulasyondan 90 saniye sonra sperm servikal mukusa ulaşır. %1 üst genital sisteme ulaşır coitusların %12 sinde %100 ü elimine olur (1995 çalışması 11 kadın üzerinde yapılan çalışma) spermlerin %35’i geri akımla kaybedilir Spermlerin bu çok hızlı transportu immun sistem ve nötrofil fagositozundan da sperlmeri koruyan bir mekanizmadır

Servikal kanalda sperm transportu Estrojen etkisiyle serviks yüksek oranda sulu mukus salgılar (>%96) Mukusun hidrasyon derecesi sperm penetrasyonu ile doğrudan ilişkilidir En yüksek sulu mukus üretildiği gün yapılan koitusda gebelik oranı daha yüksektir.

Mukozal katlantılar uterin kaviteye uzanan kanallar oluştururlar Servikal mukus motilitesi kötü olan ve morfolojisi bozuk spermlerin geçişini engeller Mukozal katlantılar uterin kaviteye uzanan kanallar oluştururlar Filtre görevi görür

mukozal katlantılar spermi uterusa yönlendirirken Servikal mukusun mikromimari glikoprotein yapıda mucinler uzun linear moleküler yapıdadır ve spermin uterusa doğru yönlenmesine yardımcı olurlar Spermlerin seminal plazma veya mediumda davranışlarından farklı olarak mukus içinde daha düz bir hatta hareket ederler

Uterusda Sperm Transportu Sıvı mediumda sperm hızı 5mm/dk ve uterin kavite içinde <10dk kısa sürede geçerler. (Mortimer & Swan 1995) İnseminasyondan 10 dk sonra tubalardan sperm elde edilebilir. (Settlage et al.1973) Geç foliküler fazda uterin düz kas kasılmaları kranial yönde artar ve sadece endometriumun alt tabakası ile sınırlıdır. (Lyons et al. 1991; Kunz et al 1996) Seminal plazmada bulunan PGE2 bu kontraksiyonlara yardımcı olur (Claus 1990) Sperm transport dominant folikülün olduğu ipsilateral tubaya daha fazladır. (Kunz 1996) Bu kontraksiyonlar menstrüasyon sırasındaki kontraksiyonlardan farklıdır tüm tüm myometrium katlarını içermez. Midsiklusda uterin kavitedeki sıvı miktarı 100 mikrolitredir servikal mukus da bu transporta yardım edebilir. Dominant folikül tarafına daha fazla transport olması lokal ovaryan etkiler ve utero ovaryan anastamozların etkili olduğu düşünülmekte.

Tubal sperm transportu Ejakülattaki 200-300milyon spermden yalnızca birkaç yüz adeti (<1000) oositin yakınına ulaşabilir. Tubada sperm rezervuarı oluşmaz. Endosalpingeal epitel sperm fertilite ve motilitesini korumak için en uygun ortamdır. Uterotubal bileşkeyi geçmek için sperm yüzey membran proteinleri (calmegin, fertilin β, testis spesific ACE) gerekir. Normal motilite ve morfoloji tubal geçişi garanti etmez. Ovulasyondan 5 gün öncesine kadar koitusda gebelik elde edilebileceği gösterilmiştir. bu biraqz da polispermik penetrasyonu engeller IVF’de 50-100 bin sperm oosit başına Serviksin tersine tubada sperm rezervuarı oluşmaz Calmegin testis spesific ACE, fertilin Beta gibi proteinleri eksik olan spermler uterotubal bileşkeyi geçemezler ve zonaya bağlanamazlar

Tubal sperm transportu Tubal istmus bölgesindeki mukozal katlantılar ve mukus spermin ampullaya geçişini yavaşlatır, böylece fallop tüpünde sperm varlığını uzatır ve polispermik fertilizasyonu engeller. Sadece kapasitasyon sürecini tamamlayan spermler ampullaya doğru ilerleyebilirler. TUBAL SİLİER EPİTELDE SPERMLER istmus bölgesine epitele yapışırlar ancak capasitasyon sürecini tamamlayan spermler ampullaya doğru ilerler Ovulasyondan beş gün öncesine kadar yapılan koituslarda gebelik elde edilebildiğinden dolayı sperlemler kadın genital sisteminde bir yerde depolanması gerekmekte ki bu da tubal epitel bu depolama görevini yapıyor olabiliyor

Ovülasyon 2. mayoz bölünmenin metafaz safhasındadır. Glikopretein yapısında zona pellusida ile çevrilidir. Corona radiata hücreleri tarafından çevrilmiş hyanüronik asit makriksle kaplanmıştır. Perivitellin boşlukta 1. polar cisim bulunmakadır.

Oosit Transportu Ovülasyon sonrası oosit kümülüs kompleksi 2-3 dk içinde fimbrianın ampuller ucuna ulaşır. Tubal transport düz kas kontraksiyonları ve silier aktiviteye dayanır. Sigara içenlerde silier aktivite bozulur. Kartegener sendromunda cilier aktivite bozuk olabilir. Yüksek doz E2 oositin tubal geçişini bloke eder. Sigara içenlerde occ pick up olumsuz etkilenir ve yine kartegener sendromu olan hastalardacilier aktivite bzk nedeniyle oosit tansportunda sorun olabilir. Yüksek doz östrojneler oositin tubal geçişini bloke ederler ( Tube bloking effect) progesteron bu etkiyi biraz azalatır.

Burada laparoskopi sırasında tespit edilmiş ovulasyon anı görülüyor Oositin tubal ampullaya ulaşabilmesi için tubo ovaryan anatominin de normal olması gerekmektedir.

Sperm Oosit Birleşmesi Tubal ampullada olur Spermin oositi fertilize edebilmesi için 4 tabaka geçmesi gerekir. Nükusunu oplazmaya bırakması gerekir

Sperm Kapasitasyonu Spermin fertilizasyon yeteneği elde etmesi için gereken hücresel değişiklikler Kapasitasyon sonunda sperm Akrozom reaksiyonu Zona pellusidaya bağlanma Hiperaktif motilite özellikleri kazanır. Kapasitasyon büyük olasılıkla serviksde başlar ve tuba da devam eder oositle karşılaşmadan önce tamamlamaları gereken bir süreçtir.

Sperm Kapasitasyonu Vagina, uterus ve tuba uterinadaki sekresyonların stimülasyonu ile olur. Sperm membran yüzeyinden kapasitasyonu engelleyen seminal plazma proteinleri ve glikoproteinler uzaklaştırılır. İntraselüler Ca ve Na seviyeleri yükselir. In vitro ortamda dengeli tuz solüsyonu ile oluşturulabilir.

Akrozom Reaksiyonu Spermin zonayı geçmesi için gereklidir. Zona Pellucida daki sperm bağlayıcı proteinler stimüle olur (ZP3, ZP2 ve ZP1 ligand) Hücre içine Ca geçişi olur Sonuçta akrozomal enzimler (hyalürinidaz) zona pellusidayı eriterek spermin perivitellin aralığa geçmesini sağlar Akrozomal memebran plazma membranı ile birleşir.

Sperm - oosit membranların füzyonu ZP2 + ZP3 + Akrozom reaksiyonu Sperm - oosit membranların füzyonu Zona reaksiyonu 1 zp3 proteini sperme bağlanır akrozom reaksiyonu başlar 2. Dış akrozom membranı parçalanarak hidrolitik enzimler açığa çıkar zonayı eritirler 3. ZP2 proteini iç akrozomal membrna bağlanır ve zona reaksiyonunu oluşturur. 4. Kortikal granüller salınarak sperm oosit membran füzyonu oluşur.

Sperm-oocyte membrane fusion and incorporation of the acrosome-reacted sperm head into an oolemma-derived vesicle in the cortical region of the ooplasm. (A) Fusion occurs between the equatorial segment of the sperm head and oolemma. Inner acrosomal membrane, the limiting membrane of the rostral portion of the acrosome-reacted sperm head, does not participate in the early morphological events of gamete fusion. (B) Oolemma microvilli engulf the sperm head following its adherence and membrane fusion. (C) The rostral portion of the sperm head is completely engulfed in an oolemma-derived vesicle. Hem Sperm başı ve kuyruk hareketlerin aktif olması gerekir Sperm başı ile oolemma füzyonu tam ekvatoryal segmentten olur, ve bu bölgeden salınan sperm proteini oscillin cortikal reaksiyonda ve oosit aktivasyonunda rol oynar.

2. Oositte 2. mayoz bölünme tamamlanır ve 2. polar cisimcik atılır. Ooplazmadan kortikal granüller salınarak zona reaksiyonu oluşur ve diğer spermlerin penetrasyonu engellenir 2. Oositte 2. mayoz bölünme tamamlanır ve 2. polar cisimcik atılır. 3. Dişi pronükleusu oluşur 4. Erkek pronükleusu oluşur Spermin oosite penetrasyonu sonrası Cortikal granüllerin salınması sperm ekvatoryal segmentinde bulunan oscillin adlı protein sorumlu olabilir. Zona reaksiyonuyla sperm bağlanma noktaları bloke olur İimatür oositlerde kortikal granüllerin salınımı erken olursa fertilizasyon başarısızlığı olurken Postmatür oositlerde de geç kortikal reaksiyon polypermiye neden olabilir

IVF sonrası fertlizasyon kontrolü 16-18 saat sonra In vivo ortamda sperm oosit karşılaşmasından 4-6 saat sonra fertilizasyon tamamlanır. IVF sonrası fertlizasyon kontrolü 16-18 saat sonra ICSI sonrası 14-16 saat 2 PN ve 2 polar cisimcik 2 tane pronükleusu olan zigotlar transfer için ayrılırken fetilize olmayanlar ayrılmalıdır, çünkü bunlar spontan olarak klivaja uğrayıp feretilize edilenlerden ayırt edilemezler IVF ve ICSI sonrası genel olarak fertilizasyon oranları %60-70 olarak kabul edilmektedir. Fertilizasyon oranı <%25 ise azalmış fertilizasyondan söz edilir

Total Fertilizasyon Başarısızlığı Elde edilen tüm oositlerin fertilize olmaması IVF sikluslarının: %5-10 ICSI sikluslarının: %2-3 TFF oluşursa rekürrens olasılığı: %30 -50

Klasik IVF’de FF Nedenleri Defektif veya yetersiz sperm Defektif veya yetersiz oosit Sperm/oosit mediumunda yetersizlikler veya toksik maddeler Çoğunluk spermdeki bozukluğa bağlıdır. Çünkü fertilize olmayan oositlerin çoğu donor spermi ile fertilize olur.

Klasik IVF’de FF Nedenleri %60 -%90 oosit içinde sperm yoktur.

IVF’de TFF öngörmede en önemli parametreler: Elde edilen oosit sayısı OPU günü yıkama sonrası total motil sperm sayısıdır Total motil sperm sayısı arttıkça fertilizasyon başarısızlığı düşer.

IVF’de FF Nedenleri Oosite bağlı nedenler %44: %19 PN oluşum / migrasyon problemi %15 oosit aktivasyon başarısızlığı %8 polispermik fertilizasyon Rawe et al. 2000

TFF olan MII oositlerde aneuploidi oranları: %15-%37 arasında değişmektedir. I. mayoz bölünme sırasında kromozomal non-disjunctiondan olur ve maternal yaşla birlikte artar. Mayoz bölünme zamanında DNA hasarlara daha hassastır ve tamir mekanizmaları çalışmayabilir.

ICSI’de FF Nedenleri ICSI de FF oranı %3’dür. ICSI’nin sonucu standart sperm analizi ve kruger morfolojisine bağımlı değildir. ICSI sonrası oositlerin >%80 sperm bulunur. ICSI’de FF’in asıl nedeni oosit aktivasyonunun olmamasıdır. ICSI fertilizasyondaki bir çok basamağı atladığı için daha farklıdır. Özellikle zona sperm ilişkisi ICSI’de olmaz. Oositlerin %80’insden fazlasında sperm bulunur.

ICSI’de FF Nedenleri %40 oosit aktivasyon defekti %23 PN appozisyon defektleri %13 Embriyonun 1. mitotik bölünmede metafaz arresti Oositlerin %50’sinden fazlasında DNA fragmentasyonu bulunur. DNA fragmentasyonu oosit ve sperm arasında eşit oranda bulunur.

FF’yi Öngörmede kullanılabilecek Testler Semen Analizi Kruger’in Strict kriterleri Sperm-zona pellusida bağlanma/penertasyon testleri Akrozom reaksiyonu değerlendirmesi Önceki IVF sikluslarındaki fertilizasyon oranları

Semen Analizi Sperm konsantrasyon, motilite ve morfoloji IVF’de FF ile ilişkilidir. WHO sperm morfoloji değerleri ve fertilizasyon oranları arasında korelasyon vardır ancak %30 cut off değeri FF öngöremez. FF olan hastaların %50’sinde IVF öncesi sperm analizinde normal semen analizi vardır. Bu nedenle çoğu merkez bunlardan biri bozuksa hastalara ICSI öneriyor. Bu nedenle standart semen analizinin bazı eksiklğikleri ve özellikle WHO cut off kriterleri nin yetersizliği sözkonusu

Kruger Kriterleri ZP morfolojik olarak normal sperme bağlanma konusunda son derece selektifdir. Bu nedenle sperm morfolojisi FF’yi öngörmede en iyi test olabilir Prognoz FR >%14; Mükemmel %4-%14; İyi %42-%64 <%4; Kötü %8-%23 Tygerberg kriterleri

Kruger Kriterleri 15 çalışmanın özeti FR TFF <%4 morfoloji: %59 %24 %30-40 kötü prognoz hastada normal fertilizasyon da görülebilir TFF’ye bağlı transfer olamaması %24’e kadar çıkabilmektedir Coetze et al. 1998

Sperm Zona Bağlanma Testleri Sperm motilite ve morfoloji defektlerini gösterir. Fertilize olmamış oositlerden gevşek bağlanan spermler ayrıldığında sağlam bağlanan spermler sayılarak sperm zona ilişkisi gösterilebilir. Sperm zona bağlanması ile FR arasında sıkı bir ilişki var. FF olan vakaların %70’inde ZP’ye 5’den az sperm bağlanmıştır Hasta spermi/ donor spermi zona bağlanma oranı <%25 ise FR:%20 >%50 ise FR:normal

Fertilizasyon Başarısızlığını önlemek için IVF yerine ICSI mi? Erkek faktör içermeyen gruplarda Total fertilizasyon başarısızlığı IVF’de %5; ICSI’de %2 ; Bir tek TFF önlemek için 33 hastaya ekstradan ICSI yapmak gerekir. Bhattacharya et al. Lancet 2001

IVF’e bağlı total fertilizasyon başarısızlığı Tekrar IVF yapıldığında TFF: %6.8 Gebelik oranları : %22 /cycle %25 /ET Kinzer DR et al Fertil Steril 2008

ICSI’ye bağlı total fertilizasyon başarısızlığı Tekrar ICSI yapıldığında TFF: %10.7 Gebelik oranları : %18/cycle %23 /ET Kinser DR et al Fertil Steril 2008

Sonuç IVF veya ICSI sonrası total fertilizasyon başarısızlığı olan hastalarda takip eden sikluslarda ümit verici gebelik oranları elde edilebilir. Fertilizasyon başarısızlığı sperm parametreleriyle birlikte elde edilen oosit sayısı ile de ilgilidir. Fertilizasyon başarısızlığı suboptimal ovaryan cevapla ilgilidir.

TEŞEKKÜRLER…