Prof. Dr. A. ŞENOL ERTÜRKOĞLU Yük. Lis. Öğr. ZEHRA SEZER Prof. Dr. A. ŞENOL ERTÜRKOĞLU

GİRİŞ ENDOMERİYUM MENSTRUEL DÖNGÜ DESİDUA DESİDUALİZASYON İMPLANTASYON FOXO1

GİRİŞ İnsan endometriyum ; menstruel döngü -yeniden yapılandırma endometriyumun desidualizasyonu embriyo gömülme -yeniden yapılandırma - hücre yenilenmesi Ekstrasellüler matriksin (ECM) yeniden modellenmesi (Nakano M ve ark, 2001; Noguchi Y ve ark, 2003) İnsan endometriyumunda menstruel siklus boyunca yeniden yapılandırma, hücre yenilenmesi ve esm in yeniden modellenmesi görülür. Bu değişimler endometriyum desidualizasyonu ve embriyo implantasyonu için gereklidir. Desidualizasyon ; gebe kalma durumundaki (conception) faktörlere ve ovaryan steroid hormonlarına cevap olarak insan endometriyumunda oluşan bir aşamadır.

insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein GİRİŞ Desidualizasyon endometrial stromanın morfolojik ve biyokimyasal dönüşümünün gerçekleşmesidir. Stromal fibroblast hücreleri faklılaşır ve yuvarlak salgı hücrelerine dönüşür. prolaktin (PRL) insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein (IGFBP-1) Desidualizasyon ; gebe kalma durumundaki (conception) faktörlere ve ovaryan steroid hormonlarına cevap olarak insan endometriyumunda oluşan bir aşamadır.Desidualizasyonda endometrial stromanın morfolojik ve biyokimyasal dönüşümü gerçekleşir. Stromal fibroblast hücreleri faklılaşır ve yuvarlak salgı hücrelerine dönüşür..prolaktin (PRL) ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein (IGFBP-1 )proteinler ifade eder Mikrodizi (microarray) çalışmaları desidualizasyon ve implantasyon aşamaları boyunca düzenlenen (regulated) birkaç gen tespit etmiş olmasına rağmen desidualizasyon ve implantasyon aşamalarında gerekli olan belirli birkaç moleküler yolak (pathway) tanımsız kalmıştır . (Gellersen B ve ark, 2003)

hücresel farklılaşma – gelişme – metabolizma - apoptozis GİRİŞ FOXO (forkhead box O) proteini ; transkripsiyon faktörlerinden ‘forkhead box’ (FOX) ailesinin bir alt sınıfına aittir. (Accili D ve ark, 2004) Görevleri : hücresel farklılaşma – gelişme – metabolizma - apoptozis büyüme faktörlerine, çevresel ve hormonal tetikçilere cevap olarak bağışıklıkta kritik aracı

GİRİŞ Habeş maymunları ile yapılan en son çalışmalara göre endometriyumda FOXO1 mRNA seviyesi ; (Kim ve ark, 2003) menstrüel döngünün geç proliferasyon fazında orta sekresyon faz boyunca gebe endometriyumunda en yüksek Bu sonuçlara rağmen insan desidua ve endometriyumunda FOXO1 ekspresyonu ile ilişkili birkaç data/ sonuç vardır. Ayrıca, (in vitro) labaratuvar şartlarında insanda FOXO1 düzenleyici faktörler hakkında az bilgi vardır. Buna rağmen bu araştırma; erken dönemdeki hamile desidua ’sında ki ve menstrüel siklus boyunca insan endometriyumunda ki FOXO1 ekspresyonu hakkında bilgi vermekle birlikte baştan başa incelenmesinde yol göstermektedir.

AMAÇ II. Ayrıca bu çalışmada endometriyal stromal hücrelerde (ESC) hCG ( insan koryonik gonadotropin ), progesteron ( P; 4-pregnene-3,20-dione ) östrojen ( E; 17 beta-estradiol ), cAMP ( siklik adenozin monofosfat ) etkenlerinin FOXO1 düzeyine etkileri incelenmiştir. İnsan desidua ve endometriyumunda FOXO1 ifadesini araştırmaktır. konuyla ilişkili çok az çalışma vardır. III. İn vitro desidualizasyonda FOXO1 ifadesi araştırılmıştır.

MATERYAL &METOD 1. DOKU ÖRNEKLERİ : 32-45 yaş arasındaki (ort. 36 yaşında) => 39 hasta servikal intraepitelyal neoplazi (CIN) ve uterus miyoması için histerektomi geçiren Noyes ve arkadaşlarının histolojik kriterlerine ( Noyes RW ve ark ,1950 ) ve en son menstruel periyoda göre sınıflandırılmıştır. 4 gruba ayrılmıştır ; Proliferasyon fazında 12 örnek Erken - sekresyon fazında 7 örnek Orta - sekresyon fazında 10 örnek Geç - sekresyon fazında 10 örnek Desidua; gebeliğin ilk trimester döneminin sonlarında bulunan hastalardan elde edildi.

MATERYAL &METOD Doku örnekleri ; İkisi => PCR ve Western blot analizi yapılmak üzere sıvı nitrojende hızlı bir şekilde donduruldu. Birisi => histolojik teşhis ve IHC boyaması için rutin histolojik yöntemlerle takip edilip parafine gömüldü. 2. RNA İZOLASYONU VE RT-qPCR -> FOXO1 mRNA miktarı incelendi. 3. İMMUNOHİSTOKİMYA BOYAMASI - > FOXO1 için 1:50 seyreltide primer antikor kullanıldı. 4. PROTEİN İZOLASYONU ve WESTERN BLOT ANALİZİ GAPDH, Western blot and RT-qPCR analizi için kontrol olarak seçildi. GAPDH geni bir housekeeping gendir. İki örnek sıvı nitrojende hızla (snap) donduruldu, mRNA ve protein testlerine kadar -70 derecede saklandı örnekler için RNA izolasyonu ve RT-qPCR yapıldı Üçüncü örnek ise histolojik teşhis ve IHC boyaması için parafine gömüldü

MATERYAL &METOD 5. İNSAN ENDOMETRİYAL STROMAL HÜCRELERİN PRİMER HÜCRE KÜLTÜRÜ Desidua tepkimesinin düzenleyici mekanizmasını araştırmak için HES hücrelerin primer kültürü yapılmıştır. Her bir biyopsiden alınan HESC kültürleri 6 gruba ayrıldı; cAMP (8-Br-cAMP: 0.5 m M ) P (P: 10 –6 M ) hCG (hCG: 10 IU/ml) cAMP + P (8-Br-cAMP: 0.5 m M , P:10 –6 M ) E + P (E: 10 –8 M , P: 10 –6 M ) Kontrol ( stromal hücreler - rutin mediumda 24 ve 48 saat ) HESCs, normal proliferatif endometriyal dokudan izole edilmiştir.

MATERYAL &METOD 6. İN VİTRO DESİDUA TEPKİMESİ HES hücrelerin in vitro desidua tepkimesini uyarmak için 8-Br-cAMP (0.5 m M ) kullanıldı. Kültür ortamında desidua tepkimesi, farklılaşma işaretleyicisi olarak PRL ifadesi kullanılarak değerlendirildi . PRL kemilüminesans tarafından ölçüldü. 7. İSTATİSTİKSEL ANALİZ YAPILDI p < 0,05 => anlamlı olarak kabul edildi. İstatistik bilim dalında Mann-Whitney U testi niceliksel ölçekli gözlemleri verilen iki örneklemin aynı dağılımdan gelip gelmediğini incelemek için kullanılan bir parametrik olmayan istatistik testdır. Aynı zamanda Wilcoxon sıralama toplamı testi veya Wilcoxon-Mann-Whitney testi) olarak da bilinmektedir. Bu testi ilk defa eşit hacimli iki örneklem verileri için Wilcoxon (1945) ortaya atmıştır. [1]. Sonradan, Mann and Whitney (1947) tarafından [2] değişik büyüklükte iki örneklem problemleri analizleri için uygulanıp geliştirilmiştir.

BULGULAR

İnsan Endometriyum ve Desiduasında FOXO1 İmmunolokalizasyonu b c d Proliferatif faz ( a ), erken - sekretuvar fazı ( b ) , orta – sekretuvar fazı ( c ) , geç – sekretuvar fazı ( d ) , ilk trimesterde desidua ( e , f). İnsan endometriyumu ve desidual dokuda FOXO1 ekspresyonu Proliferatif fazdaki epitel hücrelerin sitoplazması zayıf IHC boyama sekresyon fazında ki epitel hücrelerin çekirdek ve sitoplazması FOXO1 için güçlü IHC boyama Stromadaki FOXO1 ekspresyonu siklusun salgı fazı ile sınırlıdır Sekresyonda epitel hücrenin hem sitop. hemde çekirdeğinde fakat stromal hüc. yalnız sitoplazmasında boyama görülür İlk trimesterde stromal hücrelerin sitoplazması ile epitel hücrelerin çekirdek ve sitoplazması güçlü bir FOXO1 IHC boyaması gösterir. e f a proliferasyon fazı epitel hücrelerin sitoplazmasında zayıf boyama b-c-d sekresyon fazı hücrelerin çekirdek ve sitoplazmasında kuvvetli boyama e-f ilk trimester stromal hücrelerin sitoplazması & epitel hücrelerin sitoplazma + çekirdeğinde kuvvetli FOXO1 boyama

İlk Trimester ve Menstruel Döngü Boyunca İnsan Endometriyumunda FOXO1 İmmunohistokimyasal Yoğunluk İmmunohistokimyasal çalışmada örnekler: ( - ) : boyama yok ( +/- ) : zayıf ama tanımlanabilir ( + ) : boyama var ( ++ ) : güçlü boyama

Menstruel Döngünün Farklı Fazlarındaki İnsan Endometriyumunda ve İlk Trimesterdeki Desiduada FOXO1 mRNA İfadesi P<0.05 MS vs P & ES => anlamlı FT vs P-ES-MS-LS => anlamlı RT-qPCR analizi ile proliferatif fazda endometriyal dokunun FOXO1 mRNA ve proteinleri en düşük seviyede ifade ettiği ortaya konmuştur. Halbu ki, FOXO1 mRNA ve protein ifadesi orta ve geç sekteruvar fazlarında önemli derecede artmıştır. FOXO1 mRNA ve protein ifadesinin miktarı gebeliğin ilk trimesterinden itibaren desiduada artmıştır.

Menstruel Döngünün Farklı Fazlarındaki İnsan Endometriyumunda ve İlk Trimesterdeki Desiduada FOXO1 Protein İfadesi P < 0.05 MS - LS vs P- ES => anlamlı FS vs P-ES-MS-LS => anlamlı

HESC’de cAMP, P, P+E, cAMP+P ve hCG‘nin FOXO1 düzeyine etkileri HESC ‘de FOXO1 mRNA ifadesi kontrol, P , P + E ve hCG grupları arasında benzerlik gösterirken (p> 0,05) cAMP ve P + cAMP gruplarında FOXO1 protein ve mRNA ifadesi kontrol grubu ile karşılaştırılınca önemli derecede artış (p<0,05). P + cAMP grubunda FOXO1 mRNA ve protein ifadesi cAMP şartlarına nazaran önemli derecede artış göstremiştir (p<0,05)

Hücre İçindeki FOXO1 Protein Yerleşiminin cAMP ve P Tarafından Düzenlenmesi cAMP grubunda ki HESC’lerin nükleusunda FOXO1 bulundu ve P’a (progesteron) cevap olarak sitoplazma içine doğru yer değiştirdi.

HESC’de Desidualizasyon Boyunca 8-Br-cAMP FOXO1 Protein İfadesini Düzenlemesi

TARTIŞMA ve SONUÇ Bu çalışma, menstrüel siklus boyunca endometriyum ve erken gebelik desiduasında FOXO1 mRNA – protein ifadesi ile FOXO1 hücresel yerleşiminin ilk detaylı araştırmasıdır. HES hücrelerinin çekirdeğinde FOXO1 in vitro ifadesinin cAMP tarafından düzenlendiğini , cAMP varlığında P’un HES hücrelerinin çekirdek ve sitoplazmasın- da FOXO1 ifadesini uyardığını, cAMP uygulanan in vitro desidualizasyon boyunca FOXO1 ifade edildiğini göstermiştir.

TARTIŞMA ve SONUÇ Sitoplazmik FOXO1 ifadesinin hücre çoğalması ile ilişkili olduğu daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Desidua hücre sitoplazmasında artan FOXO1 ifadesinin gözlenmesi, ilk trimester boyunca stromal hücre çoğalmasında FOXO1‘in potansiyel bir rolü olduğunu destekler. Pankreatik β hücre sitoplazmasındaki FOXO1 ifadesi Pdx1 ifadesinin FOXO1’i engelleme durumunu azalttı ve β – hücre çoğalmasına sebep oldu (Kitamura , 2002) Büyüyen foliküllerin granuloza hücre sitoplazmasında FOXO1 yükselen ifadesi granulosa hücre çoğalması ile bağlantılı (Richards JS ce ark, 2002). Ayrıca, proliferatif faz boyunca östrojenin epitel hücrelerin sitoplazmasında uyarılan FOXO1 ifadesi tarafından endometriyum epitel hücre çoğalmasını uyarılabileceğini destekler. Bununla birlikte,bu çalışma ile erken ve geç sekretuvar faz boyunca progesteronun, stromal hücrelerin sitoplazmasında başlatılan FOXO1 ifadesi tarafından HES hücrelerinin çoğalmasını uyardığı anlaşılmıştır. Örneğin; tümör-nekrozis faktör ailesinden olan Fas ligand promoter FOXO1-bağlanma bölgesi içerir. Çekirdekten FOXO1 dışlanması (exclusion) Fas ligand etkinleştirmek için FOXO1 ‘in yeteneğini bozar (Mazumdar A, 2003) Tümör nekrozis faktör güçlü pro-inflamatuar ve pro-apoptotik arabulucudur. Çekirdekte FOXO1 transkripsiyon faktör aktivasyonunun uyarılması tarafından TNF (tümör nekrozis faktör) hem fizyolojik hem de patolojik aşamalarına katkıda bulunur. TNF fibroblast apoptozunu kontrol eden bir ana düğme (master switch) görevi görür (Alikhani M, 2005 ) ……………. Bu yüzden, erken gebelik dönemindeki desidua hücre sitoplazmasında artan FOXO1 ifadesinin gözlenmesi, ilk trimester boyunca stromal hücre çoğalmasında FOXO1‘in potansiyel bir rolü olduğunu destekler.

TARTIŞMA ve SONUÇ Tümör nekrozis ailesinden olan Fas-ligand promoter FOXO1 bağlanma bölgesine sahiptir. Çekirdekteki FOXO1 ifadesi apoptozis ile ilişkilidir. Endometriyal hücre apoptozun gömülme ile ilişkili olduğu iyi bilinmektedir.

TARTIŞMA ve SONUÇ Desidualizasyon ile ilgili genlerin çoğu geç-sekresyon fazında yüksek derecede ifade edilir. Bu sorumlu genlerden bazıları: urocortin (Torricelli M ve ark , 2007) İnterleukin-15 (IL-15) (Okada S ve ark , 2000 ) HOXA10 (homeobox A10) ( Vitiello D ve ark , 2008 ) Lösemi inhibe edici faktör ( Kimber SJ ve ark , 2005) FOXO1, stromal hücre desidualizasyonun ilerlemesine katkıda bulunması için bu genler ile iş birliğinde olabilir. Desidualizasyon ile ilgili genlerin çoğu geç-sekretuvar fazda yüksek derecede edilir. FOXO1, stromal hücre desidualizasyonun ilerlemesine katkıda bulunması için bu genler ile iş birliğinde olabilir.

TARTIŞMA ve SONUÇ cAMP’nin çekirdekte FOXO1 mRNA ve protein ifadesini tetiklediği görülmüştür. P, E ve hCG hormonlarının FOXO1 ifadesinde uyarıcı olmaması şaşırtıcıdır. 8-Br-cAMP tarafından uyarılan FOXO1 ifadesi P uygulaması ile artmış ve FOXO1’in çekirdekten sitoplazmaya geçişi görülmüştür. FOXO1’in en yüksek ifadesinin ilk trimesterdeki desidual hücre sitoplazmasında olması bu görüşü güçlendirmektedir. Mevcut sonuçlar, endometriyal farklılaşma için kritik değişme faktörü olan cAMP’nin çekirdekte FOXO1 mRNA ve protein ifadesini tetiklediği görülmüş. FOXO1 desidualizasyonda hücresel fonksiyonları düzenlediğini görülmüş. FOXO1 üzerindeki etkilerini tersine, tek başına P cAMP oluşumu üzerinde ölçülebilir bir etkiye sahip değil.