Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı GEN SUSTURMA Prof. Dr. Salih Kuk Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı

Gen Susturma Sunu Akışı Tanımı, Gen Susturma nedir? Tarihçe Önemi Genetik, Epigenetik

Gene Silencing Gen susturma Gen sessizleştirme Gen baskılama

Gene ve Protein Transkripsiyon; DNA'dan RNA'ya genetik bilginin aktarımıdır Transkripsiyon (veya yazılma veya yazılım), DNA'dan RNA'ya genetik bilginin aktarımıdır. Protein kodlayan DNA durumunda, transkripsiyon, DNA'da bulunan genetik bilginin (bir mesajcı RNA aracılığıyla) bir protein veya peptit dizisine çevirisinin ilk aşamasıdır. DNA'yı oluşturan nükleotit dizisinin RNA polimeraz enzimi tarafından bir RNA dizisi olarak kopyalanması sürecidir.

Gene ve Protein Translasyon mRNA’lardaki koda uygun polipeptit sentezi Translasyon, transkripsiyon sonucu oluşan mRNA'lardaki koda uygun olarak ribozomlarda geçrekleştirilen amino asit zinciri veya polipeptit sentezi sürecidir, daha sonra üretilen amino asit zinciri veya polipeptit uygun bir şekilde katlanarak etkin bir protein haline gelir. Translasyon, (gen ekspresyonu sürecinin bir parçası olan) protein biyosentezinin ilk aşamasıdır.

Gen ifadesinin düzenleme basamakları Kromatin bölgeleri Transkripsiyon Transkripsiyon sonrası değişimler RNA taşınımı Translasyon mRNA bozulumu Translasyon sonrası değişimler

post-transkripsiyonel olarak düzenlenir Gen ve Protein Genler; transkripsiyonel ve post-transkripsiyonel olarak düzenlenir

Gen regülasyonun epigenetik düzeyde düzenlenmesi Gen Susturma Nedir? Gen regülasyonun epigenetik düzeyde düzenlenmesi

Tarihçe DNA, Gen, Gen ekspresyonu, Genetik, Nobel Ödülleri

Tarihçe 1962 Nobel Ödülü Çift zincirli DNA James Watson, Francis Crick, ve Maurice Wilkins

Tarihçe 1965 Nobel Ödülü Genin mRNA’ya transkripsiyonu Francois Jacob ve Jasques Monod Transcription of a gene into a specific RNA species, messenger RNA (mRNA) envisioned by Francois Jacob and Jaques Monod (Nobel Prize 1965)

Tarihçe 1968 Nobel Ödülü 20 amino asit için üçlü kod Marshall Nirenberg ve Hargobind Khorana Triplets of nucleotides as the genetic code for twenty aminoacids, revealed by Marshall Nirenberg and Hargobind Khorana (Nobel Prize 1968);

Tarihçe 1993 Nobel Ödülü Uzun RNA molekülleri Philip Sharp ve Richard Roberts – 1977 Long RNA molecules (pre-mRNA consisting of expressed mRNA sequences – exons, and intervening sequences-introns which are degraded, revealed by Philip Sharp and Richard Roberts in 1977 (Nobel Prize 1993).

Tarihçe 1989 Nobel Ödülü RNA’nın katalizör rolü Sidney Altman ve Thomas Cech The discovery that RNA can act as a Catalyst by Sydney Altman and Thomas Cech (Nobel Prize 1989) and the revealation that RNA is able to catalyze its own replication and the synthesis of other RNA molecules (the ribozyme concept) led to the idea that RNA was the first genetic material on earth – an “RNA World” existed before DNA took over as the key genetic material.

Tarihçe 2006 Nobel Kimya Ödülü Ökaryotik transkripsiyon mekanizması Roger Kornberg RNA polimerazın in vitro olarak RNA sentezlediği çeşitli laboratuvarlarda 1965'te gösterilmiştir. Roger Kornberg ökaryotik transkripsiyon mekanizmasının moleküler ayrıntıları üzerinde yaptığı çalışmalardan dolayı 2006 Nobel Kimya Ödülü'nü kazanmıştır.

2006 Tıp ve Fizyoloji Nobel Ödülü Tarihçe 2006 Tıp ve Fizyoloji Nobel Ödülü RNA interferens Andrew Fire ve Craig C. Mello -1998 RNA interferansı ile ilgili çalışmalar ilk kez 1998 yılında Andrew Fire ve Craig C. Mello tarafından yapılmıştır. 2006 yılında kendilerine Tıp ve fizyoloji alanında Nobel ödülünü kazandıran RNA interferansı konusundaki keşiflerini C. elegans üzerinde göstermişlerdir.

Gene Susturmanın Keşfi Wingard Tütün bitkisindeki bir infeksiyonu “Journal of Agriculture Research” -1928 Üst yapraklarında gözlenen infeksiyonun alt yapraklara direnç kazandırdığını söylemiş Bu durumun ancak bu infekte yapraklardan aşağıya bilgi aktaran bir madde sayesinde olabileceği Wingard SA. Hosts and symptoms of ring spot, a virus disease of plants. J Agric Res 1928; 37:127. Wingard’ın, tütün bitkisinde gözlemlediği bir infeksiyonu “Journal of Agriculture Research” dergisinde tanımladığı 1928 yılında henüz genetik materyalin özü belirlenmemişti [1].   Makalesinde bitkinin üst yapraklarında gözlenen infeksiyonun alt yapraklara direnç kazandırdığını söylemiş ve bu durumun ancak bu infekte yapraklardan aşağıya bilgi aktaran bir madde sayesinde olabileceği fikrini yürütmüştü.

Gene Susturmanın Keşfi Bitkilerdeki bazı renk pigmentlerinin ifadesinde gözlenen bu olgu Transpozon adı verilen bazı hareketli genetik elemanların hem kendilerini hem de homolog kromozom odağını susturma Mantarlarda da gözlenen bu durum Kalıp DNA’dan üretilen mRNA ürününün baskılanması Bitkilerdeki bazı renk pigmentlerinin ifadesinde gözlenen bu olgu, transpozon adı verilen bazı hareketli genetik elemanların hem kendilerini hem de homolog kromozom odağını susturmaları olarak tanımlanır. Mantarlarda da gözlenen bu durum kalıp DNA’dan üretilen mRNA ürününün baskılanması şeklinde nitelendirilmektedir [2].

Bitkilerde Gen Susturma Çalışmaları Jorgensen ve arkadaşları Amaç; Chalcone syntase (chs)’ın ekspresyonundan sorumlu olan bir genin aktivitesini düzenleyerek daha mor petunyalar elde etmek Sonuç: Alacalı pigmentasyon ile daha beyaz petunyaların elde edildi Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R., Introduction of A Chimeric Chalcone Synthase Gene Into Petunia Result in Supression of homologous Revesible Co-supression of Homologous Genes in Trans, The Plant Cell, 1990; 2, 279-289. Jorgensen ve arkadaşları genetik transformasyon çalışmaları ile petunyada pigmentasyonu katalizleyen bir enzim olan chalcone syntase (chs)’ın ekspresyonundan sorumlu olan bir genin aktivitesini düzenleyerek daha mor petunyalar elde etmeye çalışmışlardır. Ancak petunya bitkisine ekzojenik transgenin aktarılması, beklenildiği gibi çiçek rengini daha koyulaştırmak yerine alacalı pigmentasyon ile daha beyaz petunyaların elde edilmesine neden olmuştur. Petunya bitkisine chs geninin ekstra kopyasının aktarılması, onun ekspresyonunda beklenilen artışın aksine azalmaya neden olmuştur [13, 15].

Bitkilerde Gen Susturma Çalışmaları Sitozolik chs mRNA’sının transkripsiyonunun azalması ile ilgili olmadığını Nukleusda transkripsiyonun devam ediyor Transkripsiyon sonrası RNA parçalanmasını ifade eden transkripsiyon sonrası gen baskılama (post-transcriptional gene silencing, PTGS) olarak tanımlanmıştır Jorgensen ve arkadaşlarının yaptığı çalışmalar bu azalmanın sitozolik chs mRNA’sının transkripsiyonunun azalması ile ilgili olmadığını ve izole edilen nukleusda transkripsiyonun devam ettiğini göstermiştir [16]. Dolayısıyla bu durum transkripsiyon sonrası RNA parçalanmasını ifade eden transkripsiyon sonrası gen baskılama (post-transcriptional gene silencing, PTGS) olarak tanımlanmıştır.

Bitkilerde Gen Susturma Çalışmaları Jorgensen ve ark., co-supresyon Petunyaya aktarılan transgenin sadece kendi kendisini değil aynı zamanda her nasılsa endojenik chs geninin ekspresyonunu da etkileyen bu olay sonrası hem endojenik ve hem de transgenik mRNA’nın kaybını tanımlamak için Sonraki çalışmalar;Transgenin ekspresyonunun, çift zincirli RNA (dsRNA) oluşumuna yol açtığını ve böylece PTGS’yi /cosupresyon’ u başlatmakta Jorgensen ve arkadaşları petunyaya aktarılan transgenin sadece kendi kendisini değil aynı zamanda her nasılsa endojenik chs geninin ekspresyonunu da etkileyen bu olay sonrası hem endojenik ve hem de transgenik mRNA’nın kaybını tanımlamak için co-supresyon terimini kullanmışlardır Daha sonra yapılan çalışmalar transgenin ekspresyonunun çift zincirli RNA (dsRNA) oluşumuna yol açtığını ve böylece PTGS’yi /cosupresyon’ u başlattığını göstermiştir [17].

Bitkilerde Gen Susturma Çalışmaları Bitkilerde ekzojen kaynaklı dsRNA’lar gen baskılamanın potansiyel indükleyicileridirler. Bu mekanizmanın biyolojik fonksiyonunun bitkilerin hedef viral RNA’nın parçalanmasını gerçekleştirerek RNA tarafından infeksiyona karşı verdikleri bir cevap Transkripsiyon sonrası gen baskılama (post-transcriptional gene silencing, PTGS)/co-supresyon ya da viral-indükleyici gen baskılama (viral-induced gene silencing, VIGS) olarak tanımlanmaktadır Bitki sistemlerinde ekzojenik kaynaklardan gelen dsRNA’lar (bitkilerde eksprese edilen transgenlerin geniş bir kısmı, bakteriyal ya da viral diziler) gen baskılamanın potansiyel indükleyicileridirler. Bazı bitki laboratuarlarında yapılan çalışmalar bu mekanizmanın biyolojik fonksiyonunun bitkilerin hedef viral RNA’nın parçalanmasını gerçekleştirerek RNA tarafından infeksiyona karşı verdikleri bir cevap olduğunu göstermişlerdir [18,) Bitkilerdeki bu fenomen transkripsiyon sonrası gen baskılama (post-transcriptional gene silencing, PTGS)/co-supresyon ya da viral-indükleyici gen baskılama (viral-induced gene silencing, VIGS) olarak tanımlanmaktadır [22, 23].

Mantarlarda Gen Susturma Quelling Fungal sistemde bağımsız olarak homolojiye göre gen baskılama fenomeni gözlenmiştir. Neurospora crassa ,turuncu renkli pigmentasyonunu sağlayan karotenoidlerin biyosentezi için gerekli albino1 (al1) geninin ekpresyonunu desteklemeye çalışma sırasında Bitkilerde PTGS raporları birikirken, fungal sistemde bağımsız olarak homolojiye göre gen baskılama fenomeni gözlenmiştir. Bu olay “Quelling” olarak adlandırılmıştır. Quelling, Neurospora crassa fungusunun turuncu renkli pigmentasyonunu sağlayan karotenoidlerin biyosentezi için gerekli albino1 (al1) geninin ekpresyonunu desteklemeye çalışma sırasında meydana gelmiştir. Yabanil tip al1+ geni içeren N. crassa soyuna al1 geni içeren bir plazmid aktarılmıştır. Birkaç transformant sabit olarak baskılanmıştır ve albino fenotipler gözlenmiştir. al1 baskılanmış soylarda, eklenmiş al1 mRNA düzeyi yabanil tip soyunkine benzerken doğal al1 mRNA’nın yüksek derecede azalmasının transkripsiyon oranının homoloji bağlı durumda olgun mRNA düzeyini etkilemesi ile ilgili değil quelling ile ilgili olduğu gösterilmiştir

Mantarlarda Gen Susturma Quelling Yabanil tip al1+ geni içeren N. crassa soyuna al1 geni içeren bir plazmid aktarılmıştır. Birkaç transformant sabit olarak baskılanmıştır ve albino fenotipler gözlenmiştir. al1 baskılanmış soylarda, eklenmiş al1 mRNA düzeyi yabanil tip soyunkine benzerken doğal al1 mRNA’nın yüksek derecede azalmış transkripsiyon oranının homoloji bağlı durumda olgun mRNA düzeyini etkilemesi ile ilgili değil quelling ile ilgili olduğu gösterilmiştir Yabanil tip al1+ geni içeren N. crassa soyuna al1 geni içeren bir plazmid aktarılmıştır. Birkaç transformant sabit olarak baskılanmıştır ve albino fenotipler gözlenmiştir. al1 baskılanmış soylarda, eklenmiş al1 mRNA düzeyi yabanil tip soyunkine benzerken doğal al1 mRNA’nın yüksek derecede azalmasının transkripsiyon oranının homoloji bağlı durumda olgun mRNA düzeyini etkilemesi ile ilgili değil quelling ile ilgili olduğu gösterilmiştir

Antisens/sens yaklaşımı Oligonükleotid kullanımı ile gen ürünlerinin düzenlenmesi fikri ilk olarak antisens/sens yaklaşımı ile başlamıştır Antisens oligonükleotidler 15-25 baz lık yapay DNA zincirleri, hedef DNA Watson-Crick baz eşleşmesi kurallarına göre bağlanmak üzere tasarlanmışlardır Gen işlevi aydınlatılmış Oligonükleotid kullanımı ile gen ürünlerinin düzenlenmesi fikri ilk olarak antisens/sens yaklaşımı ile başlamıştır [4]. Antisens oligonükleotidler 15-25 baz uzunluğunda yapay DNA zincirleri olup, hedef DNA veya RNA’ya Watson-Crick baz eşleşmesi kurallarına göre bağlanmak üzere tasarlanmışlardır. Canlıya geçişlerinde etkilerini kalıcı olarak gösteren bu oligonükleotidlerin uygulanmasıyla bugüne kadar birçok genin işlevi çözülmüştür.

RNA interferens Bitki ve mantar çalışmaları sonrası RNAi 1995- Guo ve Kempheus,-C.elegans’da gen ekspresyonunu baskılamak için sense RNA’nın da antisense RNA kadar etkili olduğunu tespit etmişlerdir RNAi’nin keşfedilmesi ile ilgili en büyük bilimsel hamle olan Fire, Mello ve arkadaşlarının Nobel ödüllü çalışmalarına öncülük etti Bitki ve funguslarda RNA baskılama mekanizmasının bulunmasının ardından RNA interferans’ın keşfedilme süreci başlamıştır. Bununla beraber 1995’de Guo ve Kempheus, Nematod türü bir solucan olan Caenorhabtidis elegans’da gen ekspresyonunu baskılamak için sense RNA’nın da antisense RNA kadar etkili olduğunu tespit etmişlerdir [26]. Bu çalışma, RNAi’nin keşfedilmesi ile ilgili en büyük bilimsel hamle olan Fire, Mello ve arkadaşlarının Nobel ödüllü çalışmalarına öncülük etmiştir.

RNA interferens 1998- Fire , Mello; sense ve antisense RNA’nın sinerjisini test etmek için: C. elegans’a bir kas proteinini kodlayan genin belli bir segmentine ait dsRNA enjekte edildi dsRNA karışımı, gen ekspresyonunu baskılamada 10 kat fazla/sense ve antisense RNA’ların tek başına 1998’de bu araştırıcılar sense ve antisense RNA’nın sinerjisini test etmek için yaptıkları çalışmada C. elegans’a enjekte ettikleri dsRNA karışımının gen ekspresyonunu baskılamada sense ve antisense RNA’ların tek başına gösterdikleri etkinin on katından daha fazla bir potansiyel etkiye sahip olduğunu göstermişlerdir [10]. Araştırıcılar, C. elegans’a bir kas proteinini kodlayan genin belli bir segmentine ait çift zincirli RNA enjekte etmişlerdir. Bu kas proteininden yoksun C. elegans’da görülen fenotipik dsRNA enjekte edilen C.elegans’da da da gözlenmiştir [10].

RNA interferens fenomeni Protozoa, Nematod, Artropodlarda Meyve sineği, Bitki, insan ve fareleri de içeren hemen hemen bütün ökaryotlarda Böylece araştırıcılar protozoa, meyve sineği, nematod, böcek, parazit, bitki, insan ve fare hücre soylarını içeren hemen hemen bütün ökaryotlarda gözlenen RNA interferans fenomenini göstermişlerdir

RNA interferens C. elegans’da gözlenen RNA interferens Bitkilerde transkripsiyon sonrası gen baskılama (PTGS) Mantarlarda “Quelling” Antisense RNA ile gen baskılama Bu keşifden sonra daha önce bitkilerde transkripsiyon sonrası gen baskılama (PTGS) [13], funguslarda gen “quelling” [24] ve antisense RNA ile gen baskılama [25] olarak rapor edilen mekanizmaların C. elegans’da gözlenen RNAi’nin farklı şekilleri olduğu anlaşılmıştır [10, 27].

RNA interferens RNAi, Science dergisi tarafından 2001’de “yılın molekülü” “2002 yılının en önemli bilimsel hamlesi” seçilmiştir.

RNA interferens (RNAi) Gen ifadesinin düzenlenmesinde etkili bir mekanizmadır “small interfering RNA (siRNA)” ve mikro RNA(miRNA) Küçük, Protein kodlamayan , Gen ifadesinin negatif düzenleyicisi Artık bugün biliyoruz ki; RNA interferansı (RNAi) gen ifadesinin düzenlenmesi üzerine etkili bir mekanizmadır. Gen ifadesinin susturulmasını sağlayan RNAi yolakları, “small interfering RNA (siRNA)” ve mikro RNA(miRNA) adı verilen küçük, protein kodlamayan ve gen ifadesinin negatif düzenleyicisi olan RNA parçacıklarının aracılığıyla gerçekleşmektedir.

Kodlamayan RNA’lar (non coding RNA) Gelişim, Farklılaşma, Hücre çoğalması ve Apopitoz gibi önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol alır. Kodlamayan RNA’lar gelişim, farklılaşma, hücre çoğalması ve apopitoz gibi önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol alır.

Kodlamayan RNA’lar siRNA miRNA Ekzojen veya endojen kökenli Endojen kökenlidir mRNA’ya yüksek özgüllükte bağlanır Bağlanma özgüllüğü daha az Bunlardan siRNA’lar ekzojen veya endojen kökenli olabilecekleri halde, miRNA’lar endojen kökenlidir ve hedef mRNA’lara bağlanma özgüllükleri siRNA’lar kadar yüksek değildir.

Gen Susturmanın Önemi RNA interferens doğal bir işlem İn vitro siRNA kullanımıyla endojenik genlerin ekspresyonunu baskılanabilir Fonksiyonel genomik araştırmalar İnsan ve diğer genom çalışmaları RNAi diğer tekniklere göre daha hızlı ve ucuz bir metod olarak fonksiyonel genomik araştırmalarında çok ideal bir teknik RNA interferans canlı organizmada mevcut olan doğal bir işlem olmakla birlikte aynı zamanda in vitro olarak sentezlenen siRNA’lar kullanılarak endojenik genlerin ekspresyonunu baskılamak için kullanılmaktadır. Endojenik genlerin ekspresyonlarının baskılanması fonksiyonel genomik alanında gen fonksiyonunu araştırmada önemlidir İnsan genomunun ve yaygın olarak çalışılan birçok model organizmanın genomlarının belirlenmesi, fonksiyonu henüz bilinmeyen çok sayıda geni açığa çıkarmakla beraber RNAi diğer tekniklere göre daha hızlı ve ucuz bir metod olarak fonksiyonel genomik araştırmalarında çok ideal bir teknik olarak etkin bir şekilde kullanılmaktadır

Gen Susturmanın Önemi Gen terapisinde önemlidir Bir hastalık normal bir proteinin fazla miktarda ekspresyonundan ya da mutant bir proteinin ekspresyonundan kaynaklanıyorsa RNAi tekniği kullanılarak gen ekspresyonunun baskılanması sadece gen fonksiyonunu araştırmada değil aynı zamanda gen terapisinde de önemlidir Örneğin; eğer bir hastalık normal bir proteinin fazla miktarda ekspresyonundan ya da mutant bir proteinin ekspresyonundan kaynaklanıyorsa RNAi spesifik proteinin düzeyini azaltmak veya onun zararlı etkile ini düzeltmek için kullanılabilmektedir

Gen Susturmanın Önemi Kanser tanı ve tedavisinde önemlidir Onkogenler ve viral infeksiyonlarda Kanser hücrelerindeki hücre döngüsü için önemli olan genlerin ve/veya anti-apoptotik genlerin ekspresyonlarını baskılayarak kanserin tedavisinde ve tanısında İlk uygulamalar onkogenler ve viral infeksiyonlarda rol oynayan hedef viral genler üzerinde yapılmıştır. RNAi’nin tedavi alanındaki değeri yapılan çok sayıda in vitro çalışma ile gösterilmiştir. Özellikle RNAi’nin, kanser hücrelerindeki hücre döngüsü için önemli olan genlerin ve/veya anti-apoptotik genlerin ekspresyonlarını baskılayarak kanserin tedavisinde ve tanısında kullanılması için çalışmalar yapılmaktadır [8].

Gen Susturmanın Önemi Pek çok hastalığın etyopatogenezinde miRNA’larla ilgili işlev bozukluklarının yer aldığı gösterilmiştir. miRNA’ların kanserli dokudaki ifade düzeylerinin ölçülmesiyle kanser prognozu ile ilgili bilgi sağlanabilmektedir miRNA’lar bu şekilde tümör belirteci olarak kullanılabilmektedir. Son yıllarda yoğunlaşan çalışmalarda, başta kanser olmak üzere pek çok hastalığın etyopatogenezinde miRNA’larla ilgili işlev bozukluklarının yer aldığı gösterilmiştir. Bazı kanser türleriyle ilişkilendirilen miRNA’ların kanserli dokudaki ifade düzeylerinin ölçülmesiyle kanser prognozu ile ilgili bilgi sağlanabilmekte ve miRNA’lar bu şekilde tümör belirteci olarak kullanılabilmektedir

Gen Susturmanın Önemi Viral hastalıklar Nörodejeneratif hastalıklar HIV/AIDS, hepatit, SARS, influenza, insan papillomavirus infeksiyonu gibi Nörodejeneratif hastalıklar Parkinson ve Alzheimer gibi Metabolik hastalıklar, Diyabet ve obezite gibi Romatizmal hastalıklar Romatoid artrit Bununla birlikte HIV/AIDS, hepatit, SARS, influenza, insan papillomavirus infeksiyonu gibi viral hastalıklar, Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklar, diyabet ve obezite gibi metabolik hastalıklar, malaria ve romatoid arthritis üzerinde araştırmalar ve uygulamalar vardır [8, 9]. Yine mevcut antimalarialların tedavide yetersiz olduğu malaria için yeni antimalarial ilaç tasarım çalışmaları yapılmakla [43] birlikte RNAi tekniğinin de vektör parazit arasındaki ilişkinin genetik faktörlerini belirlemede etkili olabileceği ve böylece yeni ilaç geliştirilmesinde önemli rol oynayabileceği düşünülmektedir [8].

Gen Susturmanın Önemi Parazit Parazit hastalıklarında

Genetik Genetik HER ŞEY, Her şeyin üstesinden gelir Herşeyin genetiğe dayandırıldığı veya genetikle açıklanmaya çalışıldığı dönemler geçirdik ve geçirmeye devam ediyoruz. Bu dönemlerde genetik her şey

Genetik Genetik bir şey Fakat her şey değil

Epigenetik Bitkisel ürünler Et ve et ürünleri Müzik Mikro organizmalar, makroarganizmalar Parazitler

SONUÇ Yapmış olmak Hobi Ülke kaynakları Biz ne yapıyoruz.

TEŞEKKÜRLER http//parazitoloji. erciyes. edu TEŞEKKÜRLER http//parazitoloji.erciyes.edu.tr Twitter: @eruparazitoloji