IR spektroskopisi

Dalga boyu aralığı (mm) Dalga sayısı aralığı (cm-1) Bölge Dalga boyu aralığı (mm) Dalga sayısı aralığı (cm-1) Yakın 0.78 - 2.5 12800 - 4000 Orta 2.5 - 50 4000 - 200 Uzak 50 -1000 200 - 10

Kırmızı ötesi bölgesinde soğurma, moleküllerin titreşme ve dönme düzeylerini uyarır. Kırmızı ötesi ışımanın enerjisi moleküldeki bağları bozmaya yetmez, elektronik uyarma da yapamaz; fakat atomların kütlelerine, bağların gücüne ve molekül geometrisine bağlı olarak bağların titreşme genliklerini arttırır.

Titreşme hareketleri: 1) Gerilme 2) Eğilme (düzlem içi ve dışı) Simetrik ve asimetrik gerilme Düzlem içi yana sallanma Düzlem içi makaslama Düzlem dışı sallanma Düzlem dışı bükülme

Titreşim frekansı İki atomlu(mA ve mB) bir sistemin gerilme ve eğilme frekansının hesabı için basit titreşme hareketi yaptığı kabul edilmiştir. k:bağın kuvvet sabiti (Nm-1), mind:indirgenmiş kütle, m-1 olarak bulunur. .k; atomların kütlesine, elektronegatifliğine, bağın uzunluğuna ve bağın gücüne bağlı olarak değişir.

SOĞURMA PİKLERİNİN SAYISI Çok atomlu bir molekül için soğurma piklerinin sayısı serbestlik derecesinden hesaplanabilir. N atomlu çizgisel bir molekül için 3N-5 N atomlu çizgisel olamayan için 3N-6 H2O için 3 band beklenir.

CO2 için 3x3-5=4 (2 gerilme, 2 eğilme) 2 pik gözlenir neden? Asimetrik gerilme 2350 cm-1 Simetrik gerilme 1349 cm-1 Eğilme 671 cm-1 Eğilme 671 cm-1

Işıma, sistemde dipol moment değişimine yol açmazsa soğurulmaz Bir molekülde simetri merkezi varsa, bu merkeze göre simetrik bağlara ait gerilme titreşimleri gözlenmez. Ö: H2C=CH2, CH3HC=CHCH3 * Sistemde dipol moment değişikliği ne kadar fazlaysa, yani sistem ne kadar polarsa, kırmızı ötesi soğurma bandı o kadar şiddetlidir.

Çift ışıma demetli IR spektrometresi

Işık kaynakları İnfared spektrofotometresinde kullanılan  ışık kaynağı infrared ışıması yayan ve elektrikle 1600-200 K kadar ısınabilen sert katı maddelerdir. Nerst çubuğu: Uzunluğu 20mm, çapı 1-2 mm olan nadir toprak metali oksitlerinden yapılmıştır. Globar çubuğu: 5 mm çapında, 500 mm uzunluğunda silisyum karbürden oluşmuş bir silindirdir. Tungsten-Flaman Lambası:  Dalga boyu 0.78-2.5µm (yakın infrared)  arasındaki bölgesde ışıma yapan bir ışık kaynağıdır. Civa-ark lambası: Uzak infrared (50µm den büyük) bölgesi için kullanılan bir ışık kaynağıdır. Nikrom Teli: Bu ışık kaynağı uzun ömürlüdür.

Dedektörler Piroelektrik Dedektörler: Yalıtkan Piroelektrik malzemelerin kristalinden yapılmıştır. En çok kullanışan trigilisin sülfattır. Dielektrik malzemeler boyunca bir elektriksel alan uygulandığında, malzemenin dielektrik sabitine bağlı olarak bir elektriksel polarlanma gözlenir. Elektriksel alan ortadan kaldırılınca bu polarlanma kaybolur. Trigilisin sülfat kullanıldığında bu elektriksel alan ortadan kalktığında bile polarlanma devam eder.  Fotoiletken Dedektörler: Kurşun sülfür, indiyum antimonürgibi yarı iletken maddelerden yapılmıştır. Bu maddelerin IR ışımasını absorplaması sonucunda iletken olmayan değerlik elektronları iletkenlik bandına uyarırlar ve yarıiletkenin elektriksel direncinin azalmasına neden olur.  Termal Dedektörler: Üzerine düşen ışımayı absorplaması sonucunda sıcaklık yükselmesinin ölçülmesi ilkesine dayanır

IR spektrumlarının alınması için yöntemler Gaz ise: İçi boş ölçme kabında, spektrum bitene kadar basınç sabit kalmalı.

Sıvı ise:

Katı ise: 1-KBr peleti hazırlanması 2-Pasta hazırlanması 3-NaCl diski üzerinde katı film oluşturulması Eğer örnek katı ise spektroskopik potasyum bromür (KBr) yardımı ile birkaç tonluk basınç altında ince şeffaf  bir tablet oluşturularak spektrum alınır. KBr’ün infrared bölgesinde  absorpsiyonu olmadığı için kullanılması uygundur. Kullanılan KBr nem içermemelidir. Çünkü içerdiği nemin IR spektrumnda hatalı bantların gozlenmesine neden olur.

Çözelti ise: Çözeltilerin spektrumunun alınması sırasında dikkat edilmesi gereken en öenmli şey, şeçilen çözücünün IR bölgesinin her yerinde ışığı geçirebilmesi gerekmektedir. Bu nedenle en fazla tercih edilen çözücüler karbontetraklorür, kloroform, karbondisülfür, siklohekzan, benzen, tetrakloroetilendir. Bu çözücülerden uygun olanı  herhangi biri ile örneğin %0.1-10 ‘lük bir çözeltisi hazırlanır. Hazırlanan bu çözelti infrared sellerine koyulur. Ayrıca kullanılan çözücünün hücreninn yapıldığı maddeyi çözmemesine de dikkat edilmelidir.

Fonksiyonlu grup bölgesi: 4000-1500 cm-1 Parmak izi bölgesi: 1500-400 cm-1

Deneysel parametre maksimum dalga sayısıdır ve maksimum soğurma bandının yerini gösterir.

IR spektrumları ne tür bilgi verir? Nitel analiz: organik bileşiklerin yapısındaki fonksiyonel grupların belirlenmesi İki organik bileşiğin aynı olup olmadığının anlaşılması Nicel analiz: Çok az kullanılır

Biyokimya için IR Makromoleküllere ligand bağlanmasını, moleküler konformasyonları, peptit ve membran yapıları ile lipit-protein veya lipit-ilaç etkileşimlerini Karbonhidrat, fosfolipit, aminoasit, polipeptit ve proteinlerin yapısını Related polisakkaritlerin yapılarındaki farklılıkları Oksihemoglobin’de demir ile oksijenin bağlanmasını Peptit azotundaki proton ile peptit karbonili arasındaki hidrojen bağını Proteinler üzerinde hidrojen-döteryum değiştirme çalışmalarıyla çözücü ile peptid bağlarının maruz kalma olasılığının ve proteinin ikincil yapısının incelenmesi Proteinlerdeki karboksil grubunun iyonlaşmasını

Alınan spektrumun değerlendirilmesi   3500 cm-1 de gözlenen geniş pik, yapıda alkol veya fenol olduğunun bir göstergesidir. 3000 cm-1 de gözlenen çoklu pik, aromatik bir halkadaki C-H bağlarını; 1600-1400 cm-1 de gözlenen çoklu pikler ise aromatik yapıdaki C=C bağlarını göstermektedir. 1200-1000 cm-1 deki pikler, yapıdaki eter varlığı (R-O-R) gösterir.1000-750 cm-1 deki pikler, p bağlı karbonlara bağlı hidrojenler(=C-H) nedeniyle gözlenmiştir.

IR’de nicel analiz En iyi sıvı örnekle yapılır. Kalibrasyon eğrisinin çizimi özellikle katı örneklerde güçtür ve yüksek oranda hata içerir.

IR’ deki sorunlar Kayıt hızının düşüklüğü Dalga boyunun kalibrasyonu Duyarlılığın azlığı

Fourier Transformu Kırmızı Ötesi Spektroskopisi (FTIR) Işık kaynağından gelen tüm frekansların örnek ile aynı anda etkileşmesi sağlanır. Işık kaynağından yayılan IR ışıması bir dalgaboyu ayırıcısından geçmeden örnek ile etkileşir.. Fourier transformlu spektrofotometrelerde aşağıda gösterilen Michelson interferometresi kullanılır.

FTIR’nin üstünlükleri Her dalga boyunu tek tek taramak gerekmediği için spektrum birkaç saniyede kaydedilir ve yarık veya prizma kullanılmadığı için duyarlık değişmeden yüksek ayırmalı spektrum elde edilir. Birkaç pg örneğin analizi yapılır, bu nedenle bir kromatograf çıkışında rahatlıkla kullanılabilir. Spektrum dijital şekilde de kaydedildiğinden bir karışımın analizinde bileşenlerden birinin spektrum verileri karışımın spektrum verilerinden çıkılarak diğer bileşenlerin spektrum verileri elde edilebilir.

FT IR’nın dezavantajı Ortamdaki suyun soğurulması ile protein amid I bandları ve membranda C=O titreşim bandlarının üst üste çakışmasıdır.

FTIR spektroskopisi proteinlerin ikincil yapılarını bulmak için kullanılan en popüler metodlardan biridir.

α-heliks β-sheet

Amid I bandındaki 1657 cm-1, 1634 cm-1 ve 1676 cm-1 PCS için ikincil yapının içeriği FTIR spektroskopisiyle kalibrasyon metodu kullanılarak % 61 α-heliks, % 12 β-sheet, % 13 dönüşler ve % 14 düzensiz yapı olarak bulunmuştur. Amid I bandındaki 1657 cm-1, 1634 cm-1 ve 1676 cm-1 sırasıyla α-heliks, β-sheet ve dönüşlere karşılık gelmektedir. Conformation H2O solution D2O solution alpha-helix 1653 (s) 1650 (s) antiparallel beta-sheet 1632 (s) 1690 (w) 1675 (w) parallel beta-sheet 1630 (s) 1645 (w) 1648 (w) disordered 1656 (m, br) 1643 (m, br) Table 5.1: Structure specific amide I frequencies α-heliks 1650-1658, β-sheet 1620-1640, ve dönüşlere

Protein-kofaktör etkileşimleri

Protein-ligant etkileşimi Antibiyotiklerle proteinlerin nasıl etkileştiğinin incelenmesinde

KAYNAKLAR www.kimyaevi.com Takumi Noguchi, Detection of protein-cofactor interactions by means of Fourier transform infrared spectroscopy, RIKEN Review No. 41 (November, 2001): Focused on Bioarchitect Research. www.sanger.ac.uk/Users/thesis/html/node62.html www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section8/ss-960531_23.html Mckee, T. Ve Mckee J.R., Biochemistry tha molecular basis of life, International edition, McGrawhill, s:131-132 Tural, H., Enstrümental analiz-II Spektroskopik Yöntemler Biyokimyada Lisansüstü Yazokulu, Telefoncu A. Ve diğerleri (editörler) Biyokimyada temel ve modern teknikler.s 311-313 http://www.wag.caltech.edu/home/jang/genchem/infrared.htm http://www.phoenixtechnology.freeserve.co.uk/irbasics.htm http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/molspec/irspec1.htm