OKSİDAN-ANTİOKSİDAN KAPASİTESİ Trabzon Akçaabat Fen Lisesi KARALAHANA (BRASSİCA OLERACEA L. VAR. ACEPHALA DC.) NIN FARKLI SICAKLIK VE İNKÜBASYON SÜRELERİNDE OKSİDAN-ANTİOKSİDAN KAPASİTESİ Hazırlayanlar: Salim Emin SARIOĞLU Yılmaz Yücehan YAZICI Danışman : Ali KANDEMİR Trabzon Akçaabat Fen Lisesi 2013

(Brassica oleracea L. var. Acephala DC.) KARALAHANA (Brassica oleracea L. var. Acephala DC.) Brassicaceous ailesi bitkisidir. Özellikle Karadeniz sahilinde yetiştirilmektedir. Karalahana (Brassica oleracea L. var. Acephala DC.), Brassicaceous ailesi bitki türleri arasında yer almaktadır. Ülkemizde özellikle Karadeniz sahilinde yetiştirilmekte olup kış mevsiminde yaprakları besin kaynağı olarak kullanılmaktadır. Geniş ve kalınca koyu yeşil yaprakları ve sarı renkli çiçekleri vardır. Karalahananın yapraklarının besinsel faydasının yanında, tohumdan elde edilen yağı; ekmek, kek vb. besinlerin yapımında kullanılmaktadır

Karalahananın ANTİOKSİDAN özelliği: Glukosinolatların yıkım ürünleri, vitamin A, vitamin C, vitamin E, selenyum, folik asit, polifenoller; flavonoidler ve karotenler, lif, lutein, zeaksantin gibi bitki fitokimyasalları bakımından zengin olmasından ileri gelmektedir ANTİOKSİDANLAR: Serbest radikallerin oluşturacağı hasarı önlemede rol oynarlar. SERBEST RADİKALLER : Protein, lipid, karbohidrat ve DNA gibi canlılarda bulunan tüm bileşiklerle tepkimeye kolayca girebilir ve böylece önemli hasarlara neden olabilirler.

ÇALIŞMANIN AMACI Karalahana yapraklarının Sıcaklığa ve bu sıcaklıklardaki bekletme sürelerine göre antioksidan-oksidan kapasitesindeki, eritrosit membranı lipid peroksidasyonunu inhibisyonundaki serum oksidan kapasitesini inhibisyonundaki değişimi tespit ederek en ideal ısıtma sıcaklığının ve süresinin belirlenmesi.

MATERYAL VE METOD

Lahana Ekstraktlarının Hazırlanması   Lahana ekstraktlarının hazırlanması için sulu ortamda ısıtma yöntemini kullanıldı. Çalışmada 90 oC, 100 oC ve 110 oC’ de 15, 30, 45 ve 60 dakikalık bekletme sürelerinde ekstraktlar elde edildi (n=3). Ekstraktların elde edilme basamakları aşağıda belirtildiği gibidir; 1. Karalahanalar, aynı ilçede özdeş ortamdaki bahçelerden toplandı. Kesildi ve harmanladı. 2. Hassas terazi ile 50 g karalahana ölçüldü. 3. 600 mL doğal kaynak suyu 50 g karalahana bulunan sefer taslarına koyuldu. 4. Fırının sıcaklığı önceden 90oC, 100oC ve 110C’ ye her bir ekstrakt için ayarlandı. Termometre ile sürekli takip edildi. 5. Sefer taslarına alınan lahanalar farklı inkübasyon (15, 30, 45, 60 dakikalık) sürelerine tabi tutuldu. 6. Her bir sıcaklık ve her bir süre için ayrı ayrı toplamda 12 sefer tasında ayrı işlem yapıldı. 7. Homojenize olması için 1 dakika mikser ile karıştırıldı. 8. Homojenize edilen ekstraktlar, 2 dakika buzda bekletildi ve ardından kağıt filtre ile süzüldü. 9. Süzüntüler 1 mL’ lik 6 ayrı ependorfa şırınga yardımıyla aktarıldı. Ependorfa alınan ekstraktlar -20 C’ de bekletildi.

Karalahana Ekstraktlarında Oksidan-Antioksidan Kapasitelerin Belirlenmesi Toplam Polifenol İçerik Tayini Folin-Ciocalteu metoduna göre belirlendi. Metot, fosfotungstik asitin (H3P[W3O10]4) bazik çözeltide fosfotungstik mavisine indirgenmesi esasına dayanır. Standart olarak gallik asit kullanılır.   Kör (μL) Numune (μL) Standart(μL) Su 12.5 - Ekstrakt Standart 1:10 Folin-Ciocalteu Reaktifi 62.5 % 20’ lik Na2CO3 125 Oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. 700 nm’de mikropleyt okuyucuda absorbans ölçüldü.

Toplam Flavonoid İçerik Tayini Alüminyum klorür kolorimetrik metodu ile belirlendi. Metodun prensibi, AlCl3’ ün flavonlar ve flavonollerin C-4 keto grubu ve C-3 veya C-5 hidroksil grupları ile asitte kararlı kompleksler oluşturması esasına dayanmaktadır. Buna ek olarak, AlCl3, flavonoidlerin A- veya B- halkalarının orto-dihidroksil grupları ile kompleks oluşturur. Standart olarak kuersetin kullanıldı.   Kör (μL) Numune (μL) Standart (μL) % 80’ lik Etanol 20 - Ekstrakt Standart 172 % 10’ luk Al(NO3)3 4 1 M KCH3COO Oda sıcaklığında, karanlıkta 40 dakika inkübe edildi. 415 nm’ de mikropleyt okuyucuda absorbans ölçüldü.

Toplam Antioksidan Cevabın Belirlenmesi   Erel’ in oluşturduğu kolorimetrik metod uygulandı. Bu metodun prensibi fenton reaksiyonu sonucu hidroksil (OH·) radikalinin üretimi ile başlatılan etkili serbest radikal reaksiyonlarında oluşan renkli dianizidil radikalinin 444 nm’ de ölçülmesi esasına dayanır. Troloks standardı kullanıldı. Reaktifler Kör (µL) Standart (µL) Numune (µL) Deiyonize su 5 - Standart Numune Reaktif I 200 A1: 444 nm de ilk okuma yapıldı. Reaktif II 10 A2: 444 nm’ de 3. ve 4. dakikalarda ikinci okuma yapıldı. A1 değerleri A2 değerlerinden çıkarılarak bu absorbans değerlerine karşılık gelen konsantrasyon miktarı elde edilen standart grafik yardımıyla sonuçlar hesaplandı.

Karalahana Ekstraklarının Eritrosit Hemolizatlarında Lipid Peroksidasyonu Azaltıcı Etkisinin Belirlenmesi   Eritrosit hemolizatlarının ekstraklı ekstraksız oksidasyona maruz bırakılması Eritrosit hemolizatı hazırlandı 1 mL Hemolizat + 100 µL ekstrakt (kör PBS) 37 °C’ de çalkalayıcıda 2 saat inkübasyon 1 mL Hemolizat + 100 µL ekstrakt (kör PBS) + 25 µL t-BHP 37 °C’ de çalkalayıcıda 2 saat inkübasyon

Lipid Peroksidasyonu Tayini Eritrositlerde lipid peroksidasyon son ürünü olarak malondialdehit seviyesi belirlendi. Numunelerde bulunan bir peroksidasyon ürünü olan malondialdehit (MDA)’ in tiyobarbitürik asit ile ısıtılması sonucu oluşan pembe renkli kompleksin optik dansitesi ölçüldü. Standart olarak 1, 1, 3, 3 tetrametoksipropan kullanıldı. 1 mL muamele edilmiş hemolizata 500 µL PBS tamponu eklendi ve 2 saat 37oC’de inkübasyona bırakıldı. 300 µL alınarak 200 µL TCA-arsenit çözeltisi eklendi ve 10 dakika 3000 rpm’de santrifüj edildi. 300 µL süpernatant başka bir tüpe alındı, numuneler ve standartlar üzerine 100 µL TCA ve 100 µL TBA eklendi. 15 dakika kaynar su banyosunda bekletildi. Soğutulduktan sonra kabarcıklar oluşturmadan mikropleyte aktarıldı. 532 ve 600 nm’de absorbansları okundu. 532 nm’deki değerden 600 nm’deki değer çıkarıldı (∆A). Elde edilen ∆A değerlerine göre standart grafiği çizildikten sonra numunelerin konsantrasyonları nmol TBARS/mL olarak bulundu.  

Karalahana Ekstraktlarının Serumda Toplam Oksidatif Stresi Azaltıcı Etkisinin Belirlenmesi Serum numunelerinin ekstraklı ekstraksız oksidasyona maruz bırakılması Serum 1/20 oranında PBS ile seyreltildi 500 µL numune + 100 µL ekstrakt (kör PBS) 37 °C’ de çalkalayıcıda 2 saat inkübasyon 500 µL numune + 100 µL ekstrakt (kör PBS) + 25 µL t-BHP 37 °C’ de çalkalayıcıda 2 saat inkübasyon

Serumda toplam oksidan durumunun belirlenmesi Toplam oksidan durumu (TOS) belirlemek için Erel’ in kolorimetrik metodu uygulandı. Bu metodun prensibi asidik ortamda farklı oksidan türleriyle Fe+2’ nin Fe+3’ e yükseltgenmesi ve Fe+3’ ün ksilenol oranj ile meydana getirdiği renk değişiminin 560 nm’ de ölçülmesi esasına dayanır. Standart olarak H2O2 kullanıldı. Reaktifler Kör (µL) Standart (µL) Numune (µL) Deiyonize su 35 - Standart Numune Reaktif I 225 A1: 560 nm’ de ilk okuma yapıldı. Reaktif II 11 A2: 560 nm’ de 3. ve 4. dakikalarda ikinci okuma yapıldı.

BULGULAR

Yapılan çalışmada, toplam polifenol miktarının sıcaklığın artmasıyla ve inkübasyon süresinin artmasıyla arttığı görüldü. 110 oC’de 60 dakika inkübasyon ile en yüksek miktar elde edildi. Şekil. Farklı sıcaklıklarda ve farklı inkübasyon sürelerindeki karalahana ekstraktlarının toplam polifenol miktarları.

Toplam flavonoid miktarları 100oC’de en yüksekti Toplam flavonoid miktarları 100oC’de en yüksekti. Ayrıca tüm sıcaklıklarda 60 dakika inkübasyonlardada en yüksek veriler elde edildi. En yüksek toplam flavonoid miktarı, şekilden de görüldüğü gibi 100oC’de 60 dakikalık inkübasyonda belirlendi. Şekil. Farklı sıcaklıklarda ve farklı inkübasyon sürelerindeki karalahana ekstraktlarının toplam flavonoid miktarları.

Toplam antioksidan cevap bakımından sıcaklık ve inkübasyon sürelerine bağlı önemli bir farklılık görülmedi. Bu da muhtemelen içeriğindeki sıcaklıkla azalan ve artan antioksidanların mevcudiyetinden kaynaklanmaktadır. Şekil. Farklı sıcaklıklarda ve farklı inkübasyon sürelerindeki karalahana ekstraktlarının toplam antioksidan cevapları.

Tüm sıcaklık ve bekletme sürelerindeki ekstraktlar lipid peroksidasyonuna karşı koruyucu etki gösterdi (Şekil 9). Ancak tüm sıcaklıklarda 60. dakikada en yüksek inhibisyon gözlendi. Sıcaklık ve bekletme süreleri göz önüne alındığında lipid peroksidasyonu 100 oC’ de 60 dakikada elde edilen ekstraktlarla en fazla oranda engellendi. Bu sonuç ile toplam polifenol miktarının en yüksek olduğu sıcaklık ve dakika ile uyumlu bulundu. Bu da lipid peroksidasyonunun engellenmesinde polifenol miktarının önemli olduğunu göstermektedir. Şekil. Farklı sıcaklıklarda ve farklı inkübasyon sürelerindeki karalahana ekstraktlarının eritrosit hemolizatlarında lipid peroksidasyonunu inhibisyonuna etkileri.

Tüm sıcaklık ve bekletme sürelerindeki ekstraktların serumda toplam oksidatif stresi azaltma da oldukça etkili olduğu görüdü (Şekil 10). En yüksek inhibisyon verileri 100 oC’ de elde edildi. Zamanın ise pek farklı etki göstermediği gözlendi. Ancak 110 oC’de 60 dakikadaki ekstraktın inhibisyon etkisinin azaldığı belirlendi. Bu sonuçlar ekstraktların zamana bağlı toplam antioksidan cevabın değişmemesi ve 100 oC’de en yüksek flavonoid içeriğinin bulunması ile uyumluluk göstermektedir. Şekil. Farklı sıcaklıklarda ve farklı inkübasyon sürelerindeki karalahana ekstraktlarının serumda toplam oksidatif durum inhibisyonuna etkileri.

Benzer çalışmalar 90-150 oC aralıklarında fenolik asitlerin antioksidan etkilerini incelediğinde sıcaklığın artışı ile antioksidan aktivitenin azaldığı gözlenmiştir. Replova Z. : Effect of temperature on the antioxidant activity of phenolic acids. Czech Journal Food Science, 30(2):171-7, 2012. 80-150oC arasındaki sıcaklığı alfa tokoferol üzerine etkisinin incelendiği bir çalışmada, 80 ile 110oC arasında sıcaklıklarda tokoferol bakımından anlamlı bir farklılığın olmadığı, ancak 110oC ’nin üzerindeki sıcaklıklarda tokoferol aktivitesinin azaltığı ifade ifade edilmiştir. Replova, Z. : The effect of temperature on the antioxidant activity of tocopherols. European Journal of Lipid Science and Technology, 108(10):858–863, 2006. Chen ve ark. narenciyenin metanolik ekstraktlarını 50, 60, 70, 80, 90 ve 100 °C’de kuruttuklarında 100 °C’de fenolik madde miktarının en yüksek seviyede olduğunu belirtmişlerdir. Chen, M.L. Yang D.J.,  Liu S.C. : Effects of drying temperature on the flavonoid, phenolic acid and antioxidative capacities of the methanol extract of citrus fruit (Citrus sinensis (L.) Osbeck) peels. International Journal of Food Science & Technology, 46(6):1179-85, 2011.

SONUÇ   Bu çalışma ile elde edilen bulgular göz önüne alındığında karalahanayı 100 oC’ de 60 dakika kaynatmanın antioksidanlar lehine yarar sağladığını söylemek mümkündür. Karadeniz Bölgesi’nde karalahananın (yapısındaki glukosinolatlardan dolayı) acılığının gitmesi için haşlama işleminden sonra suyu sıkılarak atılmaktadır. Oysa bu çalışma göstermiştir ki 15 dakikalık kaynatma işleminde dahi antioksidan etki oluşmuştur. Bu nedenle suyu sıkılmadan yemek yapılması ideal olsa bile, bu hali ile yemeğini yiyemeyenler için düşük sıcaklıklarda kısa süreli bekletme ile acılığının giderilmesi işleminin yapılmasını önermekteyiz. Diğer taraftan karalahana yemekleri genelde uzun süreli kaynatma işlemi ile yapılmaktadır. Ancak yapılan bu çalışma ile 100oC’nin üzerindeki sıcaklıklarda 60 dakikalık sürenin geçilmesinin, antioksidanlar yönünden besin değerinde kayıba yol açabileceğini ileri sürmekteyiz. Oksidan-antioksidan dengeyi antioksidanlar lehine kaydıran karalahana yapraklarının sıcaklığa ve bekletme sürelerine bağlı olarak antikanserojen etkiler gibi sağlığa faydalı diğer etkilerini ortaya koymak için yeni çalışmalar gereklidir. Ayrıca sadece karalahana bitkisinin değil kaynatma usulü ile yemekleri yapılan diğer bitkiler için de ideal ortamlar belirlenmelidir. Çalışmaların çoğu yemek yapılan hali göz önüne alınarak yapılmamaktadır. Oysa doğal ürünleri nasıl tüketiyorsak ona göre sağlığımız için en ideal pişirme şeklini bulmamız gerekmektedir.

Bu çalışmalar sırasında bizden yardımlarını esirgemeyen TEŞEKKÜR Bu çalışmalar sırasında bizden yardımlarını esirgemeyen Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı öğretim Üyesi Doç. Dr. Birgül KURAL’ a ve asistanlarına, Çalışmamızı yapacak araç gereçlerin temininde bize destek olan Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı’na, Okul Müdürümüz Ali Balta’ya ve Psikolojik Danışmanımız Cengiz Aydın’a teşekkürler ederiz.