KBUD Preanalitik Evre 2014 Sempozyumu BİYOLOJİK VARYASYONLAR Prof. Dr. Goncagül Haklar, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Ab.D. Marmara Üniversitesi Pendik Eğitim Araştırma Hastanesi Biyokimya Laboratuvarı KBUD Preanalitik Evre 2014 Sempozyumu 21-22 Mart 2014, Abant

KAPSAM Biyolojik varyasyon tanımlarının ve kaynaklarının incelenmesi, Biyolojik varyasyonun referans aralığına etkileri ve referans değişim değeri hesaplanması, Biyolojik varyasyonun analitik kalite gereksinimlerindeki rolünün tartışılması,

Laboratuvar Hekimlere Nasıl Yardımcı Olur? Doğru zamanda, Doğru örnekten, Doğru testi çalışıp, Sonucu doğru ileterek.

İstem Yorum Hastalar Analiz Örnek alımı  Taşıma  İşlem  Saklama

Süreç Analiz öncesi Hastanın belirlenmesi Örneğin alınacağı kapların hazırlanması Örneğin alınması Örneğin labotaruvara taşınması Analiz için hazırlık Analiz Analiz sonrası Sonucun kontrolü Sonucun iletilmesi

Sürecin her aşamasında hata olabilir, doğru sonuç için süreç hatasız işlemelidir!

%7-13 Post Analitik % 18 – 18.8 Pre Analitik % 32 - 75 Cihaz hatası İnterferans Post Analitik % 18 – 18.8 Raporlama Hatalı veri girişi Onaylama hatası Pre Analitik % 32 - 75 Uygunsuz taşıma ve işlem Hatalı kimlik Yanlış örnek Yetersiz Örnek durumu

53 yaşında erkek hasta Test (birim) Sonuç Referans intervali 1 ay sonra Sodyum (mEq/L) 139 (135-147) Potasyum (mEq/L) 4.3 (3.5-5.0) 4.1 Kreatinin (mg/dL) 0.99 (0.72-1.35) 1.09 ALT (U/L) 40 (12-40) 28 Billirubin (mg/dL) 1.11 (0-0.99) 1.22 ALP (U/L) 49 (30-105) 46 GGT (U/L) 57 (11-82) Kalsiyum (mg/dL) 9.56 (8.4-10.2) 9.32 Albümin (g/dL) 4.4 4.8 Kolesterol (mg/dL) 176 (<200) 185 Trigliserit (mg/dL) 45 (<150) 47 TSH (mIU/mL) 2.03 0.4-4 2.19 Billirubin yüksek-Gilbert sendromu Diğerleri referans limitinin içinde ama farklı 1. Neden laboratuvar tarafından farklı zamnlarda rapor edilen rakamlar değişir? 2. Bu yükseliş veya düşüşler anlamlı mıdır? 3. Bu değişiklikler bir patolojinin habercisi olabilir mi?

LABORATUVAR TESTLERİNDE VARYASYON KAYNAKLARI Pre-analitik varyasyon Analitik varyasyon Kişisel varyasyon Kişilerarası varyasyon Total-analitik varyasyon Biyolojik varyasyon Between subject variation is the basis for the reference interval, whereas within-subject variation (CVws) permits calculation of the reference change value (RCV) to assess the minimum change from the previous lab- oratory result that is considered statistically significant. The within-subject BV is defined as being random around a homeostatic set point. The individual homeostatic set points also vary, and the differences among these set points are the between-subject variations Interindividual var refers to the diff in the true level of an analyte among indiv. This var occurs asa a result of diffe in age, sex, race, genetics and long term health status Intraindiv var refers to differe in the true level of an analyte within an indiv over time. Temporal intra indiv var occurs because of diff in season, activity, emotional state, short term health. Intraindiv var also occurs because of pat preparation with respect to diet, exercise, drugs, sleep, posture, time of venipuncture, length of tourniquet Total-gözlenen varyasyon

Laboratuvar verilerinde biyolojik varyasyon homeostatik ayar noktasında izlenen rastgele dalgalanmalar olarak tanımlanabilir. Kişisel varyasyon analitin gerçek degerinden kişisel ölçümlerin zaman içinde farklılaşmasıdır Kişilerarası varyasyon analitin gerçek değerinden kişilerin ölçümlerinin farklılığıdır The within-subject BV is defined as being random around a homeostatic set point. The individual homeostatic set points also vary, and the differences among these set points are the between-subject variations Interindividual var refers to the diff in the true level of an analyte among indiv. This var occurs asa a result of diffe in age, sex, race, genetics and long term health status Intraindiv var refers to differe in the true level of an analyte within an indiv over time.

10 sağlıklı erkekte 2 hafta arayla ölçülen serum kreatinin değerleri (mg/dL) Sağlıklı kişi 1. sonuç 2. sonuç 3.sonuç 4. sonuç 1 0.67 0.71 0.74 0.70 2 1.16 1.11 1.24 1.21 3 0.99 0.96 1.05 0.97 4 1.41 1.35 1.30 1.33 5 0.84 0.93 0.88 6 1.01 1.10 1.02 1.08 7 0.79 0.77 0.80 8 1.18 9 0.81 0.90 10 0.76 0.87

Popülasyon Kişisel Konsantrasyon

BİYOLOJİK VARYASYON Yaş Vücut kitlesi İlaçlar Cinsiyet Genetik İmmobilizasyon Laktasyon Menopoz Obezite Organ büyüklüğü Stres Gebelik Ritim (günlük, aylık, mevsimsel) Tütün Pozisyon* Fiziksel aktivite* ... Yaş:yenidoğan, bebeklik, çocukluk,ergenlik,erişkinlik ve yaşlılık Ritim: Knowledge of these cycles is vital for good patient care. Since developing good reference values is complex and time consuming it is important to generate these values correctly, particularly at clinically important decision-making points. Moreover, the absence of an expected rhythm or cycle can give important clues about the presence of disease and is the simplest of dynamic function tests cortizol ve growth hormone sirkadyen ritime örnek olarak verilebilir. Menstruel hormonlar aylık ritim.mevsimsel LDH-yazın yüksek (fiziksel aktivitaya bağlı), kolesterol kışın yüksek ( az egzersiz, çok yemek ve az gün ışığı), kan hacmi yazın artar, protein kışın %10 yüksek, HbA1c yazın yüksek There are many publications that describe alleged daily rhythms. It should be realised that many of these rhythms are not truly biological but are simply related to other relatively regular daily activities such as intake of food, differences in pos- ture, undertaking exercise, and the like, that is, pre- analytical influences rather than true biological variation. In addition to these daily and monthly cycles, some quantities have seasonal rhythms. Hardly surprising- ly, the concentrations of serum vitamin D metabolites have marked seasonal rhythms in individuals who live far from the equator since these quantities are sunlight dependent. There are other supposed sea- sonal rhythms, for example, serum cholesterol rises in the late autumn and falls in spring, and blood gly- cated haemoglobin rises in the summer. However, these again may not be truly biological but are likely related to other relatively regular daily events such as intake of food, differences in posture, and partaking of exercise. Thus, again, changes are pre-analytical rather than biological. After checking for sex-related differences in BV results, stratification by sex was justified for only five quantities (androstendione, estradiol, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone and prolactin,). Two quantities (glucose and cholesterol) had to be stratified according to fasting or non-fasting state.

PRE-ANALİTİK VARYASYON Hasta Hazırlığı Hazırlık diyeti Açlık - tokluk Ksenobiyotikler İlaçlar Biyolojik ritimler Fiziksel aktivite Örnek alımı öncesi dinlenme Stres Pozisyon Yükseklik Tokluk-trg, ast,bil,gluc,fosfat,K, ve alt %5den fazla artar Açlık-prot,kol,trig ve bun azalır, ürik asit ve krnn artar Egzersiz-ck, ldh ve ast artar Yükseklik-yüksekliğe adaptasyon crp,ürik asit, Hb ve Htc yi arttırır. Uyarıcılar-kafein alkol, nikotin ve uyarıcı ilaçlar pek çok sık kullanılan testi etkiler Pozisyon-poziyon değişikliği total protein ve enzimler gibi büyük molekülleri etkiler. Ayakta alınan örnek yatan dan %10 fazla, oturarak alınan değerler ikisinin prtası

Callum G. Fraser: Biological variation AACC Press 2001 S-Kreatinin S-Demir

Oral Glukoz Tolerans Testi Kapilary plazma-glukoz konsantrasyonu Bireysel 0 dak 60 dak 120 dak Callum Fraser et al.

http://www.westgard.com/biodatabase1.htm Note on abbreviations: 
CVw = within-subject biologic variation
CVg = between-subject biologic variation
I = desirable specification for imprecision
B = desirable specification for inaccuracy
TE = desirable specification for allowable total error This most recent and extensive listing of biologic goals has been provided by Ricos C, Alvarez V, Cava F, Garcia-Lario JV, Hernandez A, Jimenez CV, Minchinela J, Perich C, Simon M. "Current databases on biologic variation: pros, cons and progress." Scand J Clin Lab Invest 1999;59:491-500. This database was most recently updated in 2014.

Sağlıkta-Hastalıkta Biyolojik Varyasyon Farklılıkları Hemoglobin CVkişisel CVkisilerarası Sağlıklı erişkin 1.9-2.8 6.8 DM 1.8 18.3 Demir eksikliği anemisi 3.2 4.0 RA 4.3 19.5 Sol kalp yetmezliği 6.9 12.8 MM 9.1 22.1 % olarak ifade ediliyor. Patient-specific measures of a biomarker for the generation of individual reference intervals: hemoglobin as example. Sottas et.al. Translational Research 158: 360-368, 2011.

S S S Hasta güvenliği L Although several areas of healthcare are still struggling with the concept of patient safety, laboratory diagnostics has been a forerunner in pursuing this issue, and the practice of total quality management (TQM) has now become common- place throughout most clinical laboratories worldwide

Post-analitik RDD Biyolojik varyasyon Pre-analitik Analitik The assessment of biological variation, the natural fluctuation of body fluid constituents around the homeostatic setting point, is pivotal in clinical laboratories to set analytical quality specifications, as well as for evaluating the significance of changes in serial results (i.e., the reference change value, RCV) Laboratory diagnostics (i.e., the total testing process) develops conventionally through a virtual loop, originally referred to as ‘‘the brain to brain cycle’’ by George Lundberg. The RCV for interpreting a measured difference is based on the analytical imprecision as well as the CVwithinsubject estimated from healthy (or diseased) individuals during the steady state, assuming a gaussian distributions and homogeneity. For bio- logical data, inter-individual coefficient of variation (CVi) is often calculated after a log-normal transformation. It is important to emphasize that the RCV provides only a meas- ure for judging the probability that a difference in consecu- tive results can be explained by the analytical and CVws seen in patients in a stable situation. It does not provide a measure for judging the probability that a true change has occurred. Pre-analitik Analitik

63 yaşında, erkek hasta Bu değişim anlamlı mı? Serum kolesterol 254 mg/dL 1 ay sonra tekrarlandığında 223 mg/dL Yaşam tarzı değişiklikleri Bu değişim anlamlı mı?

LABORATUVAR TESTLERİNDE VARYASYON KAYNAKLARI Pre-analitik varyasyon Analitik varyasyon Kişisel varyasyon Kişilerarası varyasyon Total-analitik varyasyon Biyolojik varyasyon 2150 Total-gözlenen varyasyon

Total varyasyon: pre-analitik varyasyon (SDP) + analitik varyasyon (SDA) + kişisel biyolojik varyasyon (SDI) SDT2 = SDP2 + SDA2 + SDI2 SDT = (SDP2 + SDA2 + SDI2)½ CVT = (CVP2 + CVA2 + CVI2)½ Preanalitik hatalar eğitim ile ortadan kaldırılabilir ve formül son şeklini alır. CVT = (CVA2 + CVI2)½

Varyasyonun Gaussian bir dağılımı vardır ve değerler ± 1, ± 2 veya ± 3 SD aralığında bulunabilir. 1, 2 ve 3 çarpanlarına Z-skoru adı da verilir. Ölçülen değer ± Z x (CVA2 + CVI2)½ Z x (CVA2 + CVI2)½

2 ayrı ölçüm varsa total varyasyon = (ilk testin varyasyonu)2 + (ikinci testin varyasyonu)2 1/2 = {Z x (CVA2 + CVI2)½2 + Z x (CVA2 + CVI2)½2 }1/2 2 ½ x Z x (CVA2 + CVI2)½ Seri ölçümlerde sonuçların farklı olabilmesi için sonuçların nümerik farklılığının total varyasyondan büyük olması gereklidir. Bu değere kritik fark veya referans değişim değeri (RDD) denir. This concept, originally proposed by Harris [9], provides an indisputable argument for a more appropriate use of population-based reference intervals, especially when monitoring individuals over time [10]. When the index is <0.6 (marked individual- ity), reference limits will be of limited use in evaluating a significant change. When the II is >1.4 (little individuality) it is accepted that the reference intervals will be satisfac- tory for monitoring for a significant change [7–12]. The ref- erence change value (RCV) takes analytical and BV into account and defines the percentage of change that should be exceeded, excluding the intrinsic variations that affect laboratory assays, in order to obtain a significant difference between two consecutive results [13, 14]. According to Ricós et al. [7], in most of the cases (except for the organ specific diseases markers), the RCVs in diseased individuals were of the same order as those in healthy individuals; small differences would have no effect on clinical applications. Our data indicated that for the investigated analytes, the RCVs of elderly people fall within the RCV ranges derived from the younger within-subject coefficients of BV, and they are similar to those observed in most clinical states. This fact suggests that the age-associated vulnerability and the changes in organ structure and function present in the elderly may be given the same consideration for dis- eases, and the use of specific RCVs is unnecessary.

İki değer birbirinden farklı değil ! Referans değişim değeri (RDD)= 2 ½ x Z x (CVA2 + CVI2)½ Hastamızda kolesterol 254  223 mg/dL Fark 31 mg/dL Yüzde olarak ifade edersek (31/254) x 100= %12 Z = 1.96 (P<0.05 için) ve 2.58 (P<0.01 için) CVA %1.6 ve CVI %6 Z=1.96 için RDD %17.2 Z=2.58 için RDD %22.6 CVa internal kalite kontrol programından bulunur CVi literatürden bulunur İki değer birbirinden farklı değil !

D Vitamini Eksikliğinde CVA= %6.7, CVİ=%12.1, CVG=%40.3 RDD=38.4%(Z=1.96, P<0.05 için) Hastanın D vitamini düzeyi 69 nmol/L ise, 50 nmol/L  42 nmol/L

RDD=2 ½ x Z x (CVA2/nA + CVI2/nS)½ nA=tekrararlanan ölçüm sayısı Normal RDD=2 ½ x Z x (CVA2/nA + CVI2/nS)½ nA=tekrararlanan ölçüm sayısı nS=tekrarlanan örnek sayısı Lognormal σ=[ln(CVt2 + 1)]½ RCVpozitif= [exp(1.96 x 2½ x σ)-1] x 100 RCVnegatif= [exp(-1.96 x 2½ x σ)-1] x 100 With the lognormal approach, the median normal deviation of the lognormal distribution () was calculated from the median CVt (as a decimal value), as described by Fokkema et al. (12): The lognormal RCVs possess bet- ter biological plausibility.

Bireylik Endeksi CVW-S/CVB-S (CVW-S2 + CVA2)½/CVB-S Harris. Clin Chem 1974;20:1535-42

Bireylik Endeksi (Index of Individuality, IoI) CVkişisel / CVkişilerarası IoI < 0.6  referans aralığı ✗ IoI > 1.4  referans aralığı ✓ If IOI is < 0.6, it is considered that population-based reference val- ues are of limited value in detecting onset of renal function impairment for a particular individual. In contrast, if IOI is > 1.4, observed values should be suitable for comparison to the population-based limits [10]. In this situation the index of individuality (II) becomes important. The II was defined by Harris in 1974 (3) as IIs(sI2+sA2)1/2/sG, where sI is the within- subject biological variation and sG is the between- subject biological variation. Although Harris included the day-to-day imprecision (sA), the II has often been simplified by later authors to sI/sG (4, 5). For a detailed

Callum G. Fraser: Biological variation AACC Press 2001 S-Kreatinin S-Demir

Bireylik endeksi ve Değişim İlk İkinci 20 U/L artış Toplum bazlı referans aralığı Petersen et al. Clin Chem Lab Med 1999;37:655-61

Bireylik endeksi ve Değişim Toplum bazlı referans aralığı İlk İkinci 20 U/L artış Toplum bazlı referans aralığı Petersen et al. Clin Chem Lab Med 1999;37:655-61

Analitik Kalite Hedeflerinde Biyolojik Varyasyonun Kullanımı CVanalitik < 0.25CVkişisel  optimum performans CVanalitik < 0.5CVkişisel  istenen performans CVanalitik < 0.75CVkişisel  minimum performans BA < 0.125(CVkişisel2 + CVkişilerarası2)½  optimum performans BA < 0.250(CVkişisel2 + CVkişilerarası2)½  istenen performans BA < 0.375(CVkişisel2 + CVkişilerarası2)½  minimum performans B=bias

Biyolojik varyasyon verileri ile Analitik kalite hedefleri belirlenebilir. Seri ölçümlerdeki farkların anlamlılığı değerlendirilir (RDD). Popülasyon tabanlı referans arlıklarının kullanılırlığı değerlendirilir. Homeostatik karar noktasının belirlenmesi için gereken örnek sayısı belirlenir. Sonuçlarin en iyi raporlanma tarzı belrlenir. En iyi örnek seçilir (en düşük değişkenliği olan). Mevcut testler arası karşılaştırma yapılır. Testlerin klinik kullanılırlığı değerlendirilir. It is clear that clinical laboratory performance should satisfy medical needs (2), which include monitoring, screening, diagnosis and case finding. For monitoring a patient's condition, analytical variation has to be maintained below half the within-subject component of biological variation. This same specification has to be maintained for screening, diagnosis and case finding when a fixed cut-off point is used to define a pathological or healthy condition (3). To determine patient status for these three purposes according to population-based reference intervals, analytical bias must be maintained below a quarter of the within- plus between- subject components (4). Biological variation is a good basis for deriving analytical quality specifications that satisfy general medical needs.

En Uygun Test Seçimi The test with high sensitivity for diagnosis is serum urea because of the highest II. In the case of the follow up of patients with a renal disorder, serum cystatin C has the maximum sensitivity to detect a change in health status because of its low RCV.

En Uygun Örnek Türü ve Birim Seçimi Examples for calcium and creatinine illustrate that 24 hour urine is the sample with lower within-subject variation and is even better if expressed in output units. This is valid for all urine analytes compiled in our database

TE < k. 0.5 CVw+ 0.25(CVw2 + CVg2)1/2, k= 1.65, a=0.05 I < 0.5 CVw B < 0.25 (CVw2 + CVg2)1/2 TE < k. 0.5 CVw+ 0.25(CVw2 + CVg2)1/2, k= 1.65, a=0.05 The within- and between-subject components of variation, expressed in coefficients of variation (CVw and CVg, respectively) and the corresponding quality specifications for analytical imprecision (I), bias (B) and total error (TE), expressed in percentages, were calculated according the following formulas:

While it is clear to everyone working in the field of labo- ratory medicine that most efforts have been focused on improving the quality in the analytical phase of testing, the high burden of errors still occurring within the preanalytical processes calls for a further broadening of the concept of TQM, to also embrace the processes external to the labora- tory, in an enterprise which would enable establishment of a governance of this often mistreated phase of the total testing process (8–10). ‘‘specimencare.com’’, is an online resource designed to identify, evaluate and promote the application of best practices in all aspects of the preanalytical phase of laboratory testing in clinical medicine.

Additional problems include inappropriate storage conditions during transportation and inappropriate proce- dures for sample preparation before analysis (e.g., refriger- ation, time delay before analysis, centrifuging conditions). In agreement with the foremost model of human errors of the Swiss cheese model, where defensive layers (slice of cheese) have a number of vulnerabilities (holes) that are continually opening, shutting and shifting their location, leaving the opportunity for a trajectory of accident opportunity that may irreversibly penetrate the barrier, the most reliable and effec-

Laboratuvar testlerini etkileyebilecek faktörleri en aza indirmek amacıyla oluşturulacak bir kalite sistemi personelin (laboratuvar teknisyeni ve örnek alımından sorumlu kişiler) eğitimi, standart operasyon prosedürlerinin kullanımı, hata alarm sistemlerinin kurulmasını, farklı sonuçların incelenmesini kapsar.