OMEED A. ALI Tıbbi Biyokimya Bölümü Ders: Kilinik Biyokimya Prof.Dr. Mehmet Tarakçio ğ lu 1

  Metabolizmanın Tanımı  Kalıtsal Metabolizma Hastalıklarının Tanımı  Metabolizma Testleri  Metabolizma Testlerini Etkileyen Faktölar  GAÜN Merkez Laboratuvarımızda yapılan testler  Metabolik Hastalıklar 2 Sunum akışı

  Metabolizma Nedir? Metabolizma, vücutta enerji üretimi ve harcanmasının gerçekleşmesi için gerekli sistemdir. Beslenme, üreme, büyüme, solunum, sindirim gibi sistemlerin vücuda enerji sağlamak amacıyla yapmış olduğu faaliyetler metabolizmanın şekillenmesinde rol oynar. 3 Metabolimanın Tanımı

  Kalıtsal metabolik hastalıklar ise özellikle protein, karbohidrat, yağların sentez ve katabolizmasında meydana gelen kalıtsal bozukluklardır. 4 Kalıtsal Metabolik Hastalıklar

  Belirti 1  Kilo alamama  Persistan kusma  Konvülsiyon  Tonus  /   Kardiyomiyopati  Renal kistler  ishal  Sarılık  Hepatomegali (karaciger buyume)  Vücutta değişik koku  Kaba yüz görünümü  Katarakt 5 Kalıtsal Metabolik Hastalıklarda Belirtiler  Belirti 2  Saç değişiklikleri  Hipoglisemi  Metabolik asidoz  idrarda redüktan madde  idrar ve serumda aminoasit veya amonyağın artması

  Herhangi bir metabolik hastalığın henüz belirtileri ortaya çıkmadan saptayan yöntemlere metabolik tarama testleri adı verilir.  1:20,000' den daha sık görülen ve tedavisi olan her hastalık, tarama programına alınmalıdır.  Tarama testleri basit, ucuz ve güvenilirolmalıdır. Günümüzde tarama programında yer alan başlıca üç hastalık  1. Fenilketonüri (Türkiyede’ki sıklığı 1:4000)  2. Konjenital hipotiroidi (Türkiyede’ki sıklığı 1:3000)  3. Biotinidaz yetersizliği:(Türkiyede’ki sıklığı 1:10,000) 6 Metabolik tarama testleri

  Numune Toplanma Zamanı  Numunenin Saklanması  Açlık Durumu  Hangi Örneğin Alınacağı  Kontaminasyon  İlaç Kullanımı  Diyet  Hastanın Egzersiz Durumu  Laboratuvar Güvenilirliği 7 Metabolizma Testlerini Etkileyen Faktörler

 Örnek türüMiktar/ortam İdrar Plazma Tam kan BOS Deri Diğer dokular Guthrie kartı 5-10 mL ( -20 C ) 5 mL (- 20 C ) (heparinli tüp) 5 mL (- 20 C ) (EDTA'lı tüp) 1 mL (- 20 C ) 2-4 mm3 (+ 4 C ) 2-4 mm3 (- 70 C ) yada sıvı nitrogende dondurulacak 4-6 damla filtre kağıdına emdirilecek Örneklerin Alınması ve Saklanması

  İdrar rengi  Homogentisik asidüri (alkaptonüri) ( siyah )  Triptofan malabsorpsiyonu ( mavi )  Miyoglobinüri ( pembe - kırmızı )  Porfiri ( morumsu renk )  Ürik asidopati ( sarı - portakal ) 9 Metabolizma Bozukluklarında Sık Görülen Klinik ve Laboratuvar Bulguları

  İdrar kokusu Glütarik asidemi tip II (terli ayak) Fenilketonüri (küf yada ölü fare) Akçaağaç şurubu kokulu idrar hastalığı (MSUD) (yanmış şeker, çemen) İzovalerik asidemi (terli ayak) Beta metil-glisinüri (kedi sidiği) Metionin malab-sorpsiyonu (bira) Trimetil-aminüri (kokmuş balık) Tirozinemi (küf) Hiperamonemiler (amonyak) 10

  Aminoasit kromotografisi (idrar, kan)  Şeker kromotografisi (idrar, kan)  Muko-polisakkarid elektroforezi (idrar)  Kantitatif amino asit tayini (Kan, İdrar, BOS)  Organik asitler (GC-MS)  Amino asitler/ organik asitler (Lc ve Tandem MS)  Karnitin (plazma, idrar, total ve serbest)  Çok uzun zincirli yağ asitleri, serbest yağ asitleri  Orotik asit (idrar)  Enzim çalışmaları  DNA çalışmaları 11 Kalıtsal metabolizma hastalıklarının tanısında kompleks testler I

  Genellikle metabolizma laboratuvarına gelen örneklerden (idrar organik asit analizi, idrar amino asit) ön tarama testi olarak çalışılır.  Metabolit pozitifliğinde idrar renginde değişiklik oluşumunun gözlenmesine dayanan testlerdir.  Kesin tanı için (kantitatif plazma ve idrar amino asit analizi, idrar organik asit analizi) acil kapsamına alınarak hemen çalışılır. Selektif Metabolik Tarama Testleri 1.Birinci Basamak Metabolik İncelemeler  Spot metabolik testler

 Selektif Metabolik Tarama Testleri 1.Birinci Basamak Metabolik İncelemeler  Spot metabolik testler  Siyanid-nitroprussid testi : Sülfitler Tanım: İdrarda sistin ve homosistein atılımına bakılır. Taranan hastalıklar: Homosistinüri, sistinüri. Yanlış pozitiflik: Asetoasetat, penisilinamin, kaptopril ve penisilin kullanılıyorsa. Yanlış negatiflik: Bakteriyel kontaminasyon. Örnek alınması: Sabahki taze idrar kullanılmalıdır. Örneğin çalışılması: 5 mL idrara birkaç damla konsantre amonyak ve 2 mL %5’lik sodyum siyanidin taze çözeltisinden konur dk. reaksiyonun tamamlanması beklenir. Daha sonra karışıma 5 damla %5’lik taze hazırlanmış Na nitroprussid eklenir ve çözelti karıştırılır. Normal idrar sabit bir sarı renk veya soluk kahverengi bir reaksiyon verirken idrar kükürt içeriyorsa erguvani kırmızı sabit bir renk oluşması pozitif reaksiyonu gösterir.

 Selektif Metabolik Tarama Testleri 1.Birinci Basamak Metabolik İncelemeler  Spot metabolik testler  Siyanid-nitroprussid testi : Sülfitler  Dinitrofenilhidrazin (DNPH) testi : Ketoasitler  Tanım: İdrarda alfa ketoasit atılımına bakılır.  Taranan hastalıklar: Klasik Fenilketonüri, Akçaağaç şurubu hastalığı (MSUD), Tirozinemi Tip1 ve 2.  Yanlış pozitiflik: Ketozisi olan hastalarda.  İnterferans: Radyoopak maddeler, bazı antibakteriyel ilaçlar (yüksek doz ampisilin).  Örneğin çalışılması: 1 mL süzülmüş idrara 10 damla DNPH ayıracı (100 mg dinitrofenilhidrazin 100 mL HCl içinde çözülür. Kahverengi şişelerde ve buzdolabında saklanmalıdır) konur. 10 dk. içinde sarı yada beyazı çökelek oluşması pozitif reaksiyonu gösterir

 Selektif Metabolik Tarama Testleri 1.Birinci Basamak Metabolik İncelemeler  Spot metabolik testler  Siyanid-nitroprussid testi : Sülfitler  Dinitro-fenilhidrazin (DNPH) testi : Ketoasitler  Sülfit testi  Yenidoğan döneminde tedaviye dirençli konvülziyonlarla karakterize molibden kofaktör eksikliği ve izole sülfit oksidaz eksikliklerinde, metabolik blok nedeniyle sülfata dönüşemediği için artmış olan sülfitin idrarda artışını göstermeye yarayan bir dipstik testidir.  İdrarda sülfit varlığında stripte pembe renk oluşur. Reaksiyon yüksek miktarlardaki askorbik asitle inhibe olur.  Pozitifliğinde plazma ve idrar kantitatif amino asit analizi ile ileri inceleme gerekir.

 Selektif Metabolik Tarama Testleri 1.Birinci Basamak Metabolik İncelemeler  Spot metabolik testler  Siyanid-nitroprussid testi : Sülfitler  Dinitrofenilhidrazin (DNPH) testi : Ketoasitler  Sülfit testi  Demir-3- klorür testi  İdrarda redüktan madde aranması (Benedict Testi)  Tanım: İdrarda indirgen şeker (glukoz, galaktoz, fruktoz, laktoz, mannoz, ksiloz fakat sukrozda değil) atılımı araştırılır. Bazik bir çözeltide aldehit veya keton oluşturan şekerler indirgeyicidir.  Taranan hastalıklar: Galaktozemi, tirozinemi tip 1 ve 2.  Yanlış pozitiflik: Homogentisik asit (Alkaptonüri) homogentisik asidin kendisi idrardaki redüktan maddelerden birisidir.  İnterferans: Kontrast madde, askorbik asit ve ampisilin kullanımı.  Örneğin çalışılması: Benedict, Fehling ayıraçları dışında sıklıkla Clini-test tablet ile gerçekleştirilmektedir. Bir test tüpüne 5 damla idrar ve 10 mL su konur ve karıştırılır. Üzerine 1 adet clini-test tablet konur ve 15 saniye sonra tüp karıştırılır. Mavi renk reaksiyonun negatif olduğunu, sarı-yeşil-kiremit kırmızısı renk ise pozitif reaksiyonu gösterir. Bazı durumlarda idrarda şeker miktarı az olursa 15 dakika daha beklenip kırmızı çökelek aranmalıdır.

 Selektif Metabolik Tarama Testleri 1.Birinci Basamak Metabolik İncelemeler  Spot metabolik testler  Siyanid-nitroprussid testi : Sülfitler  Dinitrofenilhidrazin (DNPH) testi : Ketoasitler  Sülfit testi  Demir-3- klorür testi  İdrarda redüktan madde aranması (Benedict Testi)  Amonyak (Kan)  Laktik Asit (Kan ve BOS )  Pirüvik Asit (Kan ve BOS )  İdrar Şeker Kromatografisi  İdrar Total Glukozaminoglikan Düzeyi

  Yenidoğan Taraması Testi  İdrar Organik Asit Analizi  Gas kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS)  Karnitin açil karnitin analizi Tandem MS  Tandem (ardışık) kütle spektrometrisi (aminoasitler, açilkarnitinler)  Kantitatif Amino Asit Analizi ( Plazma, idrar ve beyin omurilik sıvısında )  Aminoasit kromotografisi (kan, idrar)  Aminoasit miktar tayini (kan, idrar, BOS) 18 Laboratuvarda yapılan metabolik testler II 2. İkinci Basamak : Ilri Metabolik Testler

 19

  Her yenidoğandan (yaşına, beslenme durumuna ve beslenme şekline bakılmaksızın) hastaneden taburcu olmadan hemen önce kan örneği alınmalıdır.  Metabolik tarama amaçlı kan örneği almak için en ideal zaman bebek proteinli besinler almaya başladıktan sonraki saatlik süredir.  İlk 24 saat içinde örnek alındıysa bebek 1-2 haftalık olunca test tekrarlanmalı (metabolit birikimi). (en geç 2 hafta)  Özel filtre kağıdına kan alınıyor olmalı.  Örnekleme hızlı iletilmeli. 20 Tarama Testi İçin Numune Alma

 Ayağın plantar yüzü, lateral kısımları en uygun bölgedir. Kan alınacak bölge hafifçe ısıtılmalıdır. Topuk lanset ile 2-2,4 mm derinlikte delinmelidir. 21 Örneğin alınma tekniği

 22

 23 Uygun Örnek Alma

  Örnek alındıktan sonra kartlar yatay pozisyonda en az 3 saat kurutulmalıdır. Örnekler zarfa, birbirine temas etmeyecek şekilde zarfa yerleştirilmelidir. Örnekler en kısa zaman içinde tarama merkezlerine gönderilir. 24

 25 Dikkat Edilecek Diğer Noktalar Eksitus olan bebeklerden de tarama için kan alınmalı. Antibiyotik tedavisi alanlarda ilaç kesildikten sonra test tekrarlanmalı. Total parenteral beslenme, FK ve bazı aminoasit metabolizma bozuklukları için yalancı pozitiflik oluşturulabilir. Proteinsiz beslenme de yalancı negatiflik yapar.

  Organik asitler, çeşitli metabolik yolaklarda ortaya çıkan fizyolojik ara ürünlerdir.  Biriken organik asitler idrarla atılır.  İdrar organik asit incelemesi ile en az 45 metabolik hastalık spesifik olarak tanımlanabilir 26 İdrar Organik Asit Analizi

  Organik asidemiler Serebral organik asidemiler Yağ asidi oksidasyon bozuklukları Karnitin metabolizma bozuklukları Amino asit metabolizma bozuklukları Üre siklus enzim bozuklukları 27 İdrar Organik Asit Analizi İle Saptanabilen Hastalık Grupları

 Kan örneklerinde iki grup tarama ile otuzun üzerinde kalıtsal metabolik hastalık taranır. 1- Amino asitler: Amino asitlerden birinin yükselmesi aminoasit veya üre siklus defektini gösterir. (Amino asit metabolizma bozuklukları) 2- Açil karnitinler: Yirmiden fazla kalıtsal hastalığı gösterir. (Karnitin metabolizma bozuklukları) Karnitin profili (plazma, total/serbest) Çok uzun zincirli yağ asitleri (C22, C24, C26) analizi Serbest yağ asitleri (plazma) Orotik asit (idrar) Enzim çalışmaları DNA çalışmaları 28 Tandem MS

  Fenilketonüri Tirozinemi Homosistinüri Hipermetioninemi Akçaağaç şurubu kokulu idrar hastalığı (MSUD) Noketotik hiperglisinemi 29 Tandem-MS ile taraması yapılabilen amino asit hastalıkları

  Primer amino asit metabolizma bozukluklarının teşhisi, izlemi ve diğer bazı metabolik hastalıklara ikincil amino asit değişikliklerinin saptanması için kullanılan bir testtir. Plazma, idrar ve beyin omurilik sıvısında yapılabilmektedir. Amino asit metabolizma bozuklukları, bir veya birkaç amino asitin sentezi veya yıkımındaki kalıtsal bozukluklardır.  Amino asit metabolizma bozukluklarının bulguları yenidoğan, infant, adölesan ve yetişkin yaşlarda ortaya çıkabilmesine karşın özellikle yenidoğan ve infant döneminde başlangıç gösterir. 30 Kantitatif Amino Asit Analizi

 31 GUAN Metabolizma Laboratuvarı

 GAÜN Merkez Laboratuvarında Yapılan Metabolizma Testleri 32 Kan Alma Tüpü İdrar beyin omurilik sıvısı tüpü Aminoasit metabolizmasıyla ilişkili ürünlerden oluşan yaklaşık 43 parametrelik analiz sistemimiz var, buradaki amacımız aminoasit düzeylerini ölçmek tam kan, idrar, ve BOS da yapılabilmektedir.

 33 Numune Hazırlamak I 400 µL Numune 100 µL Çökeltme Çözeltisi 1 Saat\ 4+

 34 Numune Hazırlamak II 8000 rpm/4 dk 240 µL SDB 10 µL Internal standart 250 µL

 35 HPLS Metabolizma Test Cihazi

 36

 37

 38

 39

  Dallı zincirli amino asitler olan lösin, izolösin, Valin ’in dekarboksilasyonu bir kompleks enzim sistemi ve tiamin ile sağlanır.  E1 , E1 , E2, E3, Bu enzim sisteminin eksikliği MSUD’ a neden olur. Bütün formları otozomal resesif geçişlidir. 40 Maple Syrup Urine Disease (MSUD)

 41

 42

  Tirozin metabolizma bozuklukları: ◦ Tirozinemi tip 1,2,3 ◦ Yenidoğanın geçici tirozinemisi ◦ Hawkinsüri ◦ Alkaptonüri ◦ Albinizm  Tirozin, protein, dopamin, norepinefrin, epinefrin, melanin ve tiroksin sentezinde rol oynar. 43

 44

  Tip I:  Fumaril asetoasetaz enziminin aktivitesi eksiktir. Fumarilasetoasetat ve muhtemelen de maleilasetoasetat birikir. Bu maddeler süksinil asetona dönüşür ve idrar ile çok miktarda atılır. İdrar lahana gibi kokar.  Akut dönemde KCFT hızla bozulur. Hipoproteinemi, hipoglisemi ve koagulasyon bozukluğuna bağlı olarak ödem, asit ve kanamalar gelişir. Böbreklerde tübüler AA reabsorpsiyonunun bozulması Fankoni sendromu ve riketse yol açar.  Genetik geçiş otozomal resesiftir. 45 Herediter Tirozinemi

  Tip II: Tirozin aminotransferaz eksikliğine bağlı olarak gelişir. Genetik geçiş otozomal resesiftir. Karakteristik lezyonlar gözde ve avuç içi, ayak tabanı derisinde bulunur. Hayatın ilk ayında lakrimasyon ve fotofobi dikkati çeker. Daha sonra keratit ve konjunktival plaklar görülür. Geç bulgular korneal bulanıklık ve glokomdur. Vakaların yarısında mental retardasyon gözlenmiştir. 46

 47 Sağlıklı

 48

49