ANAEROBİOZİS

Oksijensiz ortamda üreyen bakterilere ANAEROBİK BAKTERİ denir. Anaerobik bakteriler düşük oksidasyon-redüksiyon potansiyeline sahip besiyerlerinde ürerler. Oksijenle ilgili herhangi bir mekanizmaları da yoktur (sitokrom oksidaz, katalaz gibi) Bu nedenle O2 toksik etki yaratır Serbest O2’ in bulunduğu durumlarda H2O2 oluşur. H2O2 Aerobik bakteriler yapılarında Anaerobik bakterilerde Bulunan KATALAZ enzimi KATALAZ enzimi yok. İle ayrıştırırlar. H2O2’ yi ayrıştırmazlar ve toksik etki yapar

Anaerobik bakterileri üretmek için çeşitli yöntemler vardır : A-BESİYERİNDEKİ OKSİJENİN GİDERİLMESİ 1-Isı ile O2 in çıkarılması: Anaerobik koşullarda üretilmesi istenilen bir bakteri ya da inceleme örneği, A- Sıvı besiyerinde üretileceği zaman tüplerdeki sıvı besiyerleri 10-15 dakika kaynatılarak, içinde erimiş bulunan O2 dışarı çıkarılır, tüpler hemen soğuk suya daldırılarak tüp içindeki havada bulunan O2 en az düzeye indirilir hemen ekim yapılır. Besiyerinin üstüne sıvı parafin dökülerek kapatılır inkubasyona bırakılır.

B- Katı besiyerlerinde anaerobik ortam sağlamak için, tüplere dökülmüş katı besiyerleri ısıtılır 45°C’e ılıtılır. Ekim yapılır, Tüp hafifçe döndürülerek karıştırılır ve inkubasyona bırakılır. C - Yarı-katı agar; bu besiyeri iyicene kaynatılarak eritildikten sonra 45°C’e ılıtılır ve hemen agarın dip kısmına ekim yapılarak ve optimal ısıda inkubasyona bırakılır. Fakat bu besiyerinin üst kısmında tam bir anaerobiyosis oluşmaz.

D - Katı besiyerleri için uygulanan diğer yöntem ROUX yöntemidir. Isıtılıan ve 45 °C’e kadar ılıklaştırılan katı besiyerlerine ekim yapılır. besiyerleri küçük dar tüplere çekilir iki ucu alevle kapatılır inkubasyona bırakılır üreme varsa tüpler steril koşullarda kırılarak içindeki besiyeri dışarı alınır içinde bulunan kolonilerden istenilenler seçilerek ayrı bir besiyerine pasajı yapılır.

2- Reduksiyon Şiddetinin Artırılması Besiyerlerine redüktan maddeler katılarak ortamın redüksiyon şiddeti artırılırması amaçlanır. A- Sıvı besiyerlerine – beyin, böbrek, karaciğer, et gibi steril taze doku parçacıkları katılması ortamın redüksiyon şiddetini artırır. B- Sıvı besiyerlerine glukoz, sistein(%0.05), sodyum thioglikolat (%0.01-0.5) vb. kimyasal maddeler katılarak anaerobik ortamlar hazırlanır.

C- İçinde glukoz bulunan katı besiyeri eritildikten sonra 45°C’e ılıtılır. Ekim yapılır, inkubasyona bırakılır. Tam anaeroblar agarın dibinde, fakültatifler ise besiyerin hertarafında bir üreme gösterirler. D- İndirgen(reduktan) madde katılmış yarı katı besiyeri için Brewer’in özel petri kutusu kullanılır. İçinde sodyum tioglikolat ve metil mavisi bulunan agar döküldükten sonra ağarın yüzeyine ekim yapılır. Besiyeri ile kapak arasında kalan hava thioglikolat yardımı ile indirgenerek anaerobik bir duruma gelir. Mutlaka petri kutuları parafilmle hava almayacak şekilde kapatılmalıdır.

B- HAVADAKİ OKSİJENİN GİDERİLMESİ A-Kimyasal yöntemler Havadaki oksijenin tüketilmesini sağlayan kimyasal maddeler yoluyla anaerobik ortam sağlanır. Oksijen tüketici olarak en çok PİROGALLiK ASİT + NaOH Tepkimesi sonucu oluşan PİROGALLOL ‘den yararlanılarak uygulanan yöntemler kullanılır.

1- Buchner Yöntemi 2- Spray Yöntemi Geniş bir tüpün dibine pirogallik asid konulur Üstüne %30 oranında NaOH eklenir. Bu tüpün içine Ekim yapılmış tüpler yerleştirilerek, ağzı iyice kapatılır ve etüve kaldırılır. 2- Spray Yöntemi Özel hazırlanmış, dibinde bölmeler bulunan alet kullnılır. Alttaki bölmelerden birine pirogallik asit, diğerine NaOH konur. Aletin kapağına ekim yapılmış tüp ya da petri kutusu yerleştirildikten sonra, kapak sıkıca kapatılır, kapağın kenarları parafinlenir. Alet eğilerek NaOH’in pirogallik asid ile teması sağlanır ve etüve kaldırılır.

4- Wilson Anaerobik Petri Kutusu 3- Lochkart tüp yöntemi Tüpteki besiyerine ekim yapılır Ortasında küçük presipitasyon tüpü bulunan pamuk içeri itilir. İçinde (2 cc %40’lık NaOH ve 2 cc %20’lik pirogallik asid vardır ) tüpün ağzı kapatılarak İnkubasyona bırakılır. 4- Wilson Anaerobik Petri Kutusu Spray yöntemine benzer İki petri kutusu kapağı karşılıklı yerleştirilmiştir. Kapakların arasında, ortasında 4 cm çapında delik olan metal levha bulunur. Kapakların birine besiyeri, Diğerine pirogallik asid + NaOH karışımı konur. Ekim yapıldıktan sonra, iki kapağın arası parafinle kapatılır. Etüve kaldırılır.

5- Mc Instoch- Fieldes anaerob kavanozu Kavanoz içine ısıtılmış hidrojen gazı verilir. Hidrojen kavanozda bulunan platin katalizatör yardımıyla kavanozda bulunan oksijenle birleşerek su meydana getirir. Ayrıca kavonoz dibine CaCl2 konularak biriken suyu çekmesi sağlanır. 6- Gaz pack’li kavanoz Saydam plastikten yapılmış özel kavanozun içine ekim yapılmış sıvı ve katı besiyerleri konur. Kavanozun bir tarafına da Sodyum Borohydride (hidrojen oluşturucu) ve Sodyum Bikarbonat (karbondioksit oluşturucu) İçeren hazır paketler yerleştirilir. Paketin bir ucu yırtılarak içine bir miktar su eklenir.

7- Novyi Yöntemi Musluklu bir kavanozun içine ekim yapılmış tüp ya da petri kutuları yerleştirilir ve ayrıca kavanozun dibine bir miktar NaOH ve Pirogallik asit konularak havası vakumla çekilerek anaerobik şartlar sağlanır. İnkubasyona bırakılır.

8- Aerobik Mikroorganizmalarla (Biyolojik Yöntemler) Sınırlı bir atmosfer ortamında aerobik bakterilerle anaerobik bakterilerin birarada üretilmesi temeline dayanır. Aerobik bakteriler oksijeni tüketince, anaerobik ortam oluşur ve anaerobik bakteriler ürer. Oksijen tüketici bakteriler olarak Serratia marcescens B.subtilis kullanılabilir.

BAKTERİ ENZİMLERİ ENZİM canlı hücreler tarafından sentezlenen ve hücre içindeki biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran organik ve katalitik bileşiklerdir. Bunlar hücre içindeki biyokimyasal reaksiyonları hızlandırırlar ve reaksiyona giren maddelerle (substrat) geçici kimyasal birleşmeler yaparlar. Çok az miktarlarda etkinlik gösterirler. Tepkime sonunda aynı yapıda ve aynı miktarda ortamında kalırlar. PROTEİN yapısındadırlar. Metabolizma sırasında reaksiyonlara katılırlar fakat harcanmazlar. Her enzim özgül bir kimyasal tepkimeyi katalize eder ve yalnız bir madde (substrat) üzerine etkili olarak onunla birleşir. Örn : proteinlere etki edenler, karbonhidrat ve lipidlere etki etmezler Etkileme şekli, enzim molekülü ile substrat molekülü arasındaki özel kimyasal ilişkiye bağlı !!!

Bakteri metabolizmasında işlev yapan enzimler iki türlüdür ; 1- EKZOENZİMLER : (EKSTRACELLULER ENZİMLER) Dış ortama salgılanarak,üreme ortamındaki büyük moleküllü maddelerin (protein, lipid, kh.) ayrışmasını ve hücre içine girebilmesini sağlarlar. 2- ENDOENZİMLER (İNTRASELLULER ENZİMLER) Hücre içinde kalarak, hücre içine alınan gıda maddelerini daha küçük moleküllere (monosakkarit, aminoasit gibi) ayrıştırırlar. Hücre içindeki metabolizma olaylarını katalize ederler. Genellikle hücre zarı çevresinde ya da sitoplazma içinde etkinlik gösterirler.

Enzimler 2 kısımdan oluşur APOENZİM KOENZİM Enzimlerin bazı enzimlerin işlevleri sırasında protein (inaktif) gereksinim duydukları,enzimleri kısmı aktive eden non-proteik kısım(inaktif) Tek başlarına aktif değillerdir Apoenzim+Koenzim Haloenzim (aktif) Bazı enzimler aktif hale gelebilmek için, koenzimlerin dışında KOFAKTÖRLERE gereksinim duyarlar. Örn: tripsinojen barsakta enterokinaz tripsin pepsinojen midede HCl pepsin Bazı enzimler de aktivasyonları için ORGANİK OLMAYAN kofaktörlere gereksinim duyarlar. Kofaktörler: Fe, Mn, Zn, Co, Mo, Cu

ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİ Gerek Substrat gerekse reaksiyonların sonuna “az” veya ‘‘ase’’ getirilerek enzimler adlandırılır. Örn: proteinleri ayrıştıran enzim – proteinaz Bazıları katalize ettikleri reaksiyonu gösteren sözcüğün sonuna “az” takısı getirilerek isimlendirilir. Örn : oksidasyon olayını katalize eden enzimler - oksidaz

Enzimler sentezlenmelerindeki süreklilik yönünden 2 türlüdür ; 1-Yapısal enzimler : Bakterinin kimyasal yapısı ve metabolizmasının bir kısmını oluştururlar. Her zaman kullanıldıkları için SÜREKLİ SENTEZLENİRLER. Endo ve ekzoenzimlerin büyük kısmı bu özelliktedir. 2-İndüklenebilen enzimler : Sürekli sentezlenemezler !!! Ortamda indükleyecek bir substratın bulunması gereklidir. Örn : E.coli ‘nin – ß-galaktasidaz ve permeaz enzimleri (ortamda Laktoz enzimi bulunduğu sürece sentezlenirler) ß-galaktasidaz - laktozu ayrıştırır. Permeaz - laktozun hücre içine girmesini sağlar Bu enzimler laktozu ayrıştırdıktan sonra sentezleri durur.

Enzim aktivitesini etkileyen faktörler ; 1-Kimyasal mad. ; Ağır metaller, asidler, alkaliler, deterjanlar, boyalar Enzimlerin yapısını bozarak etkinliklerini durdururlar. Bazı kimyasal maddelerin yapısı ise substratların yapısına benzerdir. Bu durumda biyokimyasal reaksiyonlarda esas substratın yerini alarak ezimlerle birleşirler. Esas substrat ezimle birleşemediği için reaksiyon bozulur. 2-Isı ; Her enzimin aktif olduğu optimal ısı vardır. Optimal ısıdan uzaklaştkça enzim aktivitesi yavaşlar, durur. Yüksek ısı protein yapısındaki enzimleri koagule eder. Düşük ısı enzim aktivitesini azaltır ve durdurur. 3-pH ; Optimal pH’dan uzaklaştıkça enzim aktivitesi durur. 4-Substrat yoğunluğu ; Fazlalığı enzim aktivitesini yavaşlatır. 5-Enzim yoğunluğu ; azlığı reaksiyonların bozulmasına yol açar. 6- Tuz yoğunluğu ;ortamda fazla tuz bulunması aktiviteyi olumsuz etkiler. 7- Diğer faktörler; Ultraviole ışınları, proteinlere etkiyen diğer fiziksel ve kimyasal faktörler enzimlerin fonksiyonunu olumsuz etkiler.

BAKTERİ METABOLİZMASI

Bakteriler beslenmeleri için gerekli gıda maddelerini bulundukları ortamdan alırlar. Ortamdaki gıda maddeleri BÜYÜK MOLEKÜLLÜ Olduklarından, Hücre zarından geçişleri zordur. Bakteri EKZOENZİMLERİ aracılığıyla büyük moleküllü maddeleri parçalar ve hücre zarından geçebilecek büyüklüğe ayrıştırır!!! Gıda maddeleri hücre zarından geçer ve sitoplazmaya ulaşır. Sitoplazmaya ulaşan gıda maddeleri burada ENDOENZİMLER aracılığıyla ayrıştırılır, daha küçük moleküller haline getirilir. Bu olaya DİSSİMİLASYON (KATABOLİZMA)denir. Bakteriler daha sonra bu küçük moleküllü gıda maddelerinden yeniden büyük molekülleri sentezlerler) ASSİMİLASYON (ANABOLİZMA) Hücrenin yapıları özel mekanizma ile oluşturulur. KATABOLİZMA + ANABOLİZMA METABOLİZMA

Katabolizma sırasında GIDA MADDELERİNİN AYRIŞMASI sonucu önemli oranda ENERJİ açığa çıkar. Saklanması ve gerektiğinde yeniden kullanılabilmesi için ATP’ ye gereksinim var. Enerjiyi depolama ve aktarabilme özelliğinde Metabolizma sırasında ADP ve ATP özel enzimler aracılığıyla birbirine çevrilir. ENERJİ VERİCİ reaksiyonlarda ADP ATP’e çevrilir, yüksek enerjili fosfat bağı oluşur, enerji burada depolanır. HÜCRE İÇİNDE ENERJİNİN gerektiği sentezler sırasında ATP ADP’e çevrilir, yüksek enerjili fosfat bağı çözülür. Açığa çıkan enerji sentez için kullanılır.

KARBONHİDRAT METABOLİZMASI A-KARBONHİDRAT PARÇALANMASI 1-Polisakkaritlerin ayrışması Hidrolizasyon ve fosforilasyon ile monosakkaritlere kadar ayrıştırır. Karbohidraz Polisakkarit-fosforilaz Enzimleri aracılığıyla olur

2-Monosakkaritlerin ayrışması Monosakkaritler arasında GLUKOZ önemli Glukoz birçok mikroorganizma tarafından karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılır. GLUKOZ Aerobik bakteriler Anaerobik bakteriler Değişik şekillerde ayrıştırırlar ara ürün Pürivik asit Aerobik ayrışma Anaerobik ayrışma (Krebs ya da sitrik (fermentasyon yoluyla) Asid siklusu ile) son ürün son ürün CO2 ve H2O organik madeler Enerji açığa çıkar enerji bunlara bağlı kalır açığa çıkan enerji miktarı az.

B-KARBONHİDRATLARIN SENTEZİ Monosakkaritler arasında glikozid bağları kurularak polisakkaritler sentezlenir. Glikozid bağları Fosforilasyon ve transglikolizasyon ile oluşur. Monosakkaritler disakkaritlerdeki Fosforilaz enzimleriyle glikozid bağları birinden Bağlanır diğerine aktarılarak yeni bağlar oluşur ve polisakkaritler sentezlenir.

LİPİD METABOLİZMASI A-LİPİDLERİN AYRIŞMASI B-LİPİDLERİN SENTEZİ Mikroorganizmalarda bulunan hidrolitik enzimlerden, lipaselar yağları esas komponentlerine ayrıştırır. Lipidler, hidrolize olunca, yağ asitleri ve gliserin meydana gelir. lipase Lipid + H2O---------------yağ asitleri + gliserin B-LİPİDLERİN SENTEZİ Bakteriler de lipid sentezi, üredikleri ortamdaki karbon bileşiklerinin karakterine bağlıdır. Asetat, laktat ve glukoz içeren ortamlarda bir dizi kimyasal reaksiyonlar sonucu palmitik asit sentezlenir. Birçok bakteri de asetatları poli-beta hidroksibutirik asite çevirerek hücre içinde muhafaza ederler.

PROTEİN METABOLİZMASI Proteinler yapılarına göre başlıca iki kısma ayrılabilirler. 1- Basit proteinler: Bu tür proteinlerden hidrolizasyon sonunda sadece amino asitler meydana gelir, diğer organik veya inorganik ürünler oluşmazlar. Proteinlerin bileşiminde, genellikle, karbon (C) %50, oksijen (O) %25 nitrogen (N) %16 ve hidrojen (H) %7 bulunur. 2- Konjuge proteinler: Bunların hidrolizasyonu sonunda yalnız amino asitler değil, aynı zamanda organik ve inorganik komponentler de teşekkül eder. (nukleoprotein, lipoprotein, fosfoprotein, flavoprotein, glikoprotein, v.s.).

A-PROTEİNLERİN AYRIŞMASI Protein proteinaz Polipeptid peptidaz Aminoasit Ya sitoplazmada tutulurlar ya da ayrışmaya devam ederler Aminoasitlerin ayrışması 3 şekilde olur ; 1-deaminasyon : Oksidatif ya da redüktif deaminasyon ile amin (NH2) grubunun çıkması sonucu AMONYAK oluşur. 2-dekarboksilasyon : Karboksilaz enzimlerinin etkisiyle karboksil (CO-OH) grubunun çıkması sonucu CO2 ve AMİN oluşur. 3-transaminasyon : Bu reaksiyonda, alfa-amino asitlerdeki amin grubu, alfa keto asite transfer edilir. Olay, transaminazlar tarafından katalize edilir.

B-PROTEİNLERİN SENTEZİ 1- Deaminasyon: Amino asitlerin bu tarzdaki sentezinde amonyak (HN3) önemli görev yapar ve sentez için NH2 ‘ye çevrilir. Sonra, amin grubu, organik asitin hidrojeni yerine geçerek, amino asit oluşturulur. amonyak + fumarik asit «aspartik asit 2- Transaminasyon: Bir amino asitteki amino grubu, diğer keto asitine nakledilerek yeni amino asitler sentezlenirler. alanin -- NH2 + alfa-ketoglutarik asit ® glutamik asit + pirüvik asit 3- Basamaklı sentez: Bazı amino asitler de küçük moleküllerden kademeli olarak sentez edilirler. antranilik asit ®indol + serine ® triptofan