ANAEROB BAKTERİLER ve ANAEROB BAKTERİ ENFEKSİYONLARI Prof. Dr. Mehmet KIYAN

Bakterilerde solunum tipleri 1: Zorunlu aerop 2: Zorunlu anaerop 3: Fakültatif 4: Mikroaerofil 5: Aerotoleran .

Tıbbi önemi olan bakterilerin solunum tiplerine göre sınıflandırılması Örnek: Mycobacterium Mantarlar Neisseria Campylobacter Enterobacteriaceae Çoğu Staphylococcus ve Streptococcus spp. Propionibacterium Bazı Clostridium spp. Çoğu Bacteroides spp Çoğu Clostridium spp Fusobactwrium spp Peptostreptococcus Porphyromonas spp Veillonella spp Kategori: Açıklama: Zorunlu aerob % 15-21 O2’li ortam ( havalı ortam ve CO2’li inkübatörde) Mikroaerofil O2 konsantrasyonu havadan daha düşük Fakültatif O2 varlığı veya yokluğunda anaerob Aerotoleran Çok düşük O2 konsantrasyon Mikroaerotoleran Zorunlu O2 konsantrasyonu % 0

Tarihçe: Gazlı gangren ve anaerobik infeksiyon insidansı: Pasteur (1863); bütirik asit fermentasyonu Pasteur & Jaubert (1877); C. septicum Arlond (1887); C. chauvoei Achaline (1891); C. perfringens Novy (1894); C. novyi Gazlı gangren ve anaerobik infeksiyon insidansı: I. Dünya Savaşı..... % 5 II. Dünya Savaşı… % 0.7 Kore Savaşı.......... % 0.2

Epidemiyoloji: * Güneş ışınlarından korunmuş ılık ve sığ su (tatlı ve tuzlu) sedimentleri * Toprak * İnsan ve hayvan florası Bölge Diş yüzeyi................................................... Diş-dişeti birleşimi ve çatlakları............... Burun ifrazı................................................. İleum............................................................ Kolon........................................................... Vagen ve endoserviks............................... Anaerop / Aerop 1 / 1 1.000 / 1 3 - 5 / 1

Anaerob bakteri enfeksiyonu: Dokuda oksidasyon redüksiyon potansiyelinin düşmesi sonucu gelişen ve süpürasyon, abse oluşumu ya da doku harabiyeti ile karakterize bir enfeksiyondur. Düşük redoks potansiyeli ile ilgili faktörler: - obstrüksiyon-staz - yabancı cisim varlığı - doku anoksisi - kalsiyum tuzları - doku harabiyeti - vasküler yetmezlik - bakteri enfeksiyonu - yanıklar

Anaerob infeksiyonlara zemin hazırlayan önemli klinik durum ve faktörler: - Diabetes mellitus - Bağışıklığın baskılanması * sitotoksik ilaç kullanımı * kortikosteroid kullanımı * hipogamaglobulinemi * nötropeni - Kollagen vaskuler hastalık - Lösemi ve lenfomalar - Akatalazemi - Travmalar - İnsan ve hayvan ısırıkları - Aspirasyon - Maligniteler * kolon * uterus * GIS - Cerrahi girişimler * oral * pelvik * GIS - Uzun süreli antibiyotik tedavi * trimetoprim-sulfametaksazol * yeni kinolonlar * aminoglikozidler

Anaerobik bakteri enfeksiyonlarının tanısı niçin önemlidir? 1. Anaerob bakteriler doğada ve normal insan florasında yaygın olarak bulunurlar. Bu tip enfeksiyonlara sanılandan daha sık rastlanır. 2. Önemli morbidite ve mortalite ile ilişkilidirler. 3. Yanlış tanı ve tedavisi kötü sonuçlara yol açar. 4. Geniş spektrumlu antimikrobiyal tedavi; * pahalıdır, * her zaman iyi sonuç vermez. * direnç gelişimini hızlandırır. 5. Antibiyotiklere direnç her geçen gün artmaktadır.

Anaerob bakteri enfeksiyonlarının görülme sıklığı Postoperatif baş ve boyun infeksiyonları.......... Ağız, diş ve kök kanalı infeksiyonları.................. Diyabetik ayak ülseri............................................. Beyin abseleri........................................................ Plöropulmener infeksiyonlar................................ İntraabdominal infeksiyonlar.............................. Puerperal olmayan meme abseleri...................... Kadın genital sistemi infeksiyonları.................... Kronik sinüzit ve otitis media.............................. Bakteriyemi............................................................ % 95 - 100 % 90 - 100 % 85 - 95 % 80 - üstü % 75 - üstü % 50 - 90 % 50 - 80 % 50 - 75 % 50 - üstü % 5

Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında anaerop bakterilerin düşük oranlarda saptanmasının nedenleri? 1. Anaerop infeksiyonların akla getirilmemesi 2. Materyalin alınması ve nakli aşamalarında gerekli özenin gösterilmemesi 3. Anaerop bakterilerin yavaş üremesi nedeni ile izolman ve identifikasyonunda karşılaşılan zorluklar 4. Kullanılan yöntemlerin pahalı olması 5. Büyük emek ve zamana ihtiyaç duyma

Tıbbi önemi olan anaerob bakterilerin morfolojik özelliklerine göre sınıflandırılması I - Gram pozitif olanlar BASİL Sporlu: Clostridium Sporsuz: Actinomyces Bifidobacterium Eubacterium Lactobacillus Propionibacterium Arachnia Gardnerella KOK Peptococcus Peptostreptococcus Ruminococcus Sarcina

Tıbbi önemi olan anaerob bakterilerin morfolojik özelliklerine göre sınıflandırılması II - Gram negatif olanlar BASİL: Bacteroides Prevotella Fusobacterium Porphyromonas KOK: Veillonella Megasphaera VİRGÜL: Vibrio Campylobacter SPİRAL: Treponema Borrelia

Bazı bakterilerin niçin anaerop olduğunu açıklamak için ileri sürülen teoriler: a - Oksijen toksisitesi b - Koruyucu enzimlerin yokluğu c - Oksijenin bakteriostatik / bakteriosidal etkisi Oksijen toksisitesi: * moleküler oksijenin bizzat kendisi direkt olarak * oksijenin indirgenmesi ile oluşan serbest radikaller O2- + e- O2 - . (süperoksit anyon) O2 - . + e- + 2H+ H2O2 (hidrojen peroksit ) H2O2 + e- + H+ H2O + OH . (hidroksil anyonu) OH . + e- + H+ H2O

Toksik oksijen radikalleri En dış orbitallerinde çiftlenmemiş elektron bulunan Son derece aktif Membran fosfolipidleri, nükleik asitler ve yapısında sistein,triptofan, methionin, tirozin, histidin ve sistin gibi aminoasitler bulunan proteinler ile hızla kimyasal tepkimeye giren Bunların yapısını değiştirme eğilimindeki moleküllerdir. Süperoksit anyon ve hidrojen peroksit; Sentezlendikleri yerden diffüze olabilirler. Toksik etkilerini hem hücre içinde hem de hücre dışında geniş bir alanda gösterirler. Hidroksil anyonu Yüksek reaktivitesi nedeni ile üretildiği yerden fazla uzaklaşamadan bulunduğu yerde etkili olur.

Koruyucu enzimlerin yokluğu: Aerob bakteriler; serbest oksijen radikallerinin toksik etkilerinden sahip oldukları süperoksit dismutase enzimleri sayesinde korunurlar. O2 - . + O2 - . SODs O2 + H2O2 2H2O2 Katalaz 2H2O + O2 SODs; çoğu anaerob bakterilerde bulunur. Katalaz: zorunlu anaerob bakterilerin bir çoğunda bulunmaz.

Oksijenin bakteriostatik ve/veya bakterisidal etkisi: Faz I Bakteriostatik faz : Zorunlu anaerob bakteriler O2’li ortamlarda bulundukları zaman başlangıçta; metabolik fonksiyonları için gerekli olan elektronları oksijenin indirgenmesinde kullanırlar. Bu nedenle hücresel materyallerin sentezi ve üreme için gerekli olan enerji miktarı azalır. Eğer bu dönem kısa sürecek olursa Ve bakteri anaerob ortama kavuşur ise hayatiyetini devam ettirir. Faz II Bakterisidal faz : Bakteri uzun süre Faz I döneminde kalacak olursa oluşan serbest oksijen radikallerinin toksik etkisi ile ölür.

Anaerob bakteri infeksiyonlarının genel özellikleri Sıklıkla: İnfeksiyona zemin hazırlayan bir durum vardır. Endojen kaynaklıdır. Polimikrobiyaldir. Doku nekrozu ve/veya abse oluşumu vardır. Antibakteriyel tedaviye iyi cevap verir. Nadiren: İnsandan insana bulaş olabilir.

Anaerob bakterilerin virulans faktörleri: A. Gram pozitif 1. Ekzotoksinler tetanospazmin alfa toksin enterotoksin beta toksin 2. Enzimler lesitinaz lipaz Kollejenaz Hiyalüronidaz deoksiribo nükleaz 3. Spor yapımı 4. Oksijen toleransı B. Gram negatif 1. Yapısal komponentler: Yapısal beta laktamazlar Kapsül Dış membran proteinleri Pili Lipopolisakkarit 2. Ekstrasellüler ürünler: Kısa zincirli yağ asitleri (en önemlisi süksinat) Proteazlar (özellikle IgA proteaz) hidrolitik enzimler : hyalüronidaz, lipaz, kondroitin, sülfataz, heparinaz, SODs 3. Diğer virülans faktörleri: B. fragilis: kapsül Hareket enterotoksin salınımı fragilisin salınımı redoks potansiyelini düzenleme mekanizması F.nucleatum fosfolipaz A (invazyon)

Anaerob enfeksiyonlarda sık izole edilen bakteriler: % : 52 35 19 3 13 17 6 11 29 8 5 4 2 Bakteri: Bacteroides spp. ............................................... Bacteroides fragilis grup .............................. B. fragilis ................................................ B. thetaiotaomicron ................................. diğerler .................................................... Bacteroides fragilis dışındaki türler …......... pigmentli ................................................... diğerleri ................................................... Peptostreptococcus .......................................... Fusobacterium spp ............................................ Sporsuz gram pozitif basiller ........................... Gram negatif koklar ........................................... Clostridium spp .................................................

Anaerob infeksiyonların laboratuvar tanısında klinik materyalin miktarı ve nakil süresi önemlidir. Örnek tipi: Uygun süre: 1. Aspirasyon mayinin hacmı: Çok az (< 1.0 ml.) ….. < 10 dk. Az (< 1.0 ml.) ……... < 30 dk. Fazla (< 2.0 ml.) …. < 2-3 saat 2. Anaerob nakil araçları .............. < 2-3 saat 3. Doku veya biyopsi örneği: Steril taşıyıcıda ........... < 30 dk. Anaerob torba veya nakil aracı içinde ... < 2-3 saat Açıklamalar: Küçük hacımlı sıvılar mümkün ise anaerob küçük şişeler içinde büyük hacımlı olan sıvılar, doku, biyopsi örnekleri ve kürete edilmiş materyaller uygun anaerob Transport besiyerleri (Port-A-Cull) içinde gönderilmelidir. Zorunlu hallerde nakil süresi 8-24 saat olabilir.

* Örnek; anaerob inceleme için uygun mu ? * Materyalde ; Anaerob bakteriler ile meydana gelmiş olabileceğinden şüphelenilen enfeksiyonlarda örneklerin incelenmesi I. Makroskobik muayene: * Örnek; anaerob inceleme için uygun mu ? * Materyalde ; * pis koku * nekrotik doku * kan, mukus ve püy * sülfür granülleri var mı? * Preparat hazırlanması ve kültür aşamalarında örnek materyalin hangi bölgesinden alınacak?

Anaerob bakteriler ile meydana gelmiş olabileceğinden şüphelenilen enfeksiyonlarda örneklerin incelenmesi II. Mikrokobik muayene: A- Boyasız preparatlar: Işık mikroskobu Karanlık alan mikroskobu B- Boyalı preparatlar Boyanma özelliği nasıldır? Gram, ARB Morfolojik özelliği nedir? kok, basil, kokobasil, iğ, virgül, flaman, pleomorfik Spor var mı? Şekli oval, yuvarlak bakteri bedeninde yerleşimi terminal subterminal santral bakteri bedenini genişletmiş mi? endospor, ekzospor

Gram boyama Besiyerine ekim işlemlerini geçiktirmemek için kültürden sonra yapılması daha uygundur. Ekimden önce yapılabilirse besiyeri seçimine imkan verir. Gram preparatlarının incelenmesi niçin önemlidir? 1. Örnekte varolan mikroorganizma çeşitleri hakkında bilgi verir. Özel durumlarda bu bilgiler klinisyenlere aktarılır ve tedavide yol gösterici olur. 2. Bazı durumlarda (Clostridial myonekroz) lökositlerin bulunup bulunmaması önemlidir. 3. Boyalı preparatlarda görülen bakteriler ile kültürde üreyen bakterilerin uyumlu olması Etken bakteri subkültür işlemleri hakkında besiyeri seçimi, inkübasyon süresi fikir yürütmemize olanak verir.

Anaerob bakteriler ile meydana gelmiş olabileceğinden şüphelenilen infeksiyonlarda boyalı preparatlarda görülen bakterilerin kültürde ürememe nedenleri Materyal alınması ve nakli uygun değildir. Preparatların hazırlanması, boyanması veya değerlendirilmesi aşamalarında hata yapılmış olabilir. Besiyeri yanlış seçilmiştir. Anaerob inkübasyon sisteminde bir sorun vardır. Bakterinin üremesi bir şekilde inhibe edilmiştir. antibiyotik kullanımı eski besiyeri Subkültürler uygun seçilmemiş ve hazırlanmamıştır.

Gram boyama yöntemi 1. Temiz bir lama klinik örneği ince tabaka halinde yayınız. 2. Havada kurutunuz. (Kurumayı çabuklaştırmak için preparatı ısıtmayınız) 3. Metil alkol ile 1 dakika tespit edilir. (bakteri ve lökositlerin morfolojisinin bozulmaması için etil alkol ve ısı ile muamele etmekten kaçınınız.) 4. Kristal violet (Jansiyen moru)’ de 1 dakika bekletiniz. 5. Boyayı dökünüz, nazikçe su ile sızdırarak yıkayınız. 6. Lugolda 1 dakika bekletiniz. 7. Lugolü akıtınız, aşırı dekolarizasyondan kaçınarak % 95 alkol ile renk gidinceye kadar (yaklaşık 30 saniye) muamele ediniz. 8. Derhal su ile yıkayınız. 9. Bazik fuksin veya sulu karbol fuksin ile 30 saniye boyayınız. 10. Nazikce sudan geçirip hava kurutunuz.

Gram boyamada yorumlama: Özellik: Gram reaksiyonu: Hücre morfolojisi: * Kok * Basil Yorum: Clostridium türleri gram (+) olarak bilinir. C. ramosum ve C. clostriiforme gram (-)’dir. Tekli, diplokok, tetrad, küme, zincir İri kok : Peptostreptococcus magnus Küçük kok: Peptostreptococcus magnus Veillonella Kıvrım, flamentöz, çengelli iğne, şişlik, spor, pleomorfik, bipolar boyanma gibi özellikler Gram (+): difteroid; Propionibacterium dallanmış; Actinomyces, Bifidobacterium kalın; Çoğu Clostridium türleri Gram (-): Kokobasil; Prevotella, Porphyromonas Uzun, ince, sivri uçlu; F. nucleatum

Anaerob bakterilerin izolasyonunda kullanılan besiyerleri Seçici olmayanlar: Beyin-kalp infüzyon agar Brucella kanlı agar Columbia kanlı agar Schaedler kanlı agar CDC anaerob agar Thiogylcollate besiyeri Fastidious anaerob agar Trypticase sodium agar Seçici olanlar: Kanamisin-Vankomisin kanlı agar Feniletil alkol agar Bacteroides bile esculin agar CCFA (Sikloserin-sefoksitin fruktoz agar) Egg yolk agar Mobiluncus agar

Kültür yöntemler: A - Fiziksel yöntemler: B - Kimyasal yöntemler: Kaynatma: sıvı besiyerleri Desikatör Kapalı ortamların havasını boşaltıp tekrar doldurma Ekim yapılmış tüplerin havasının boşaltılmasından sonra ağzınının kapatılması Elektrikli vid pompası B - Kimyasal yöntemler: Pirogallik asit + KOH Sitrik asit + sodyum borohidrid + sodyum bikarbonat C - Biyolojik yöntemler: Besiyerleri içine hayvansal ve bitkisel maddeler konması Katı besiyerlerinin bir bölümüne oksijeni hızla kullanan mikroorganizmaların ekilmesi Saccharomyces cerevesiae Bacillus subtilis Serratia marcescens

Anaerob bakterilerin ilk izolasyonunda dikkat edilmesi gereken konular: Isı: İlk izolasyonda en uygun ısı: 35oC C.perfringens gibi bazı anaeroblar 42-47o C’de daha iyi ürerler. Süre: Genel olarak 48 saattir. * Seçici olmayan besiyerlerinde: Bu süre sonunda üreme olmazsa inkübasyona 5-7 gün daha devam edilmeli * Seçici besiyerlerinde (BBE, PEA, KVLB): B. melaninogenicus ve Bilophila ssp. dışındaki bakteriler 72 saatten uzun inkübasyonlarda oluşan metabolik son ürünlerin etkisi ile ölebilirler. Koloni özellikleri: C. tetani kolonileri: Kısa sürede besiyeri yüzeyini kaplamaya meyilli yayvan, ıslak ve kenarları flamentöz çıkıntılı C. perfringens kolonileri: içiçe iki hemoliz zonu ile çevrili 365 nm dalga boyundaki UV altında: Porphyromonas ve Bacteroides koloniler kiremit kırmızısı renginde floresans Veillonella spp.: açık kırmızı pigmentli koloniler

Antibiyotik duyarlılık testleri: Gelişmiş ülkelerde anaerop bakterilerin duyarlılıkları rutin olarak ARAŞTIRILMAMAKTADIR. Ne zaman yapılmalı? 1. Antibiyotiklere dirençli bir suş izole edildiğinde 2. Ampirik tedaviye yanıtsız anaerob bakteri enfeksiyonları 3. Ampirik tedavi protokolü bulunmayan anaerob bakteri izolmanı 4. Yeni üretilen bir antibiyotiğin denenmesi 5. Antibiyotiklere direnç gelişiminin izlenmesinde 6. Klasik tedavi dışında bir protokol kullanılmak istendiğinde 7. Hastane enfeksiyonlarının kontrolünde

Antibiyotik duyarlılık testleri: Hangi yöntem kullanılmalı? A - Dilüsyon temeline dayalı: Agar dilüsyon: NCCL’e göre referans yöntem Modifiye agar dilüsyon Buyyon mikrodilüsyon Buyyon makrodilüsyon Buyyon disk elüsyon B - Diffüzyon temeline dayalı E testi Spiral ekim Disk diffüzyon: tavsiye edilmez.

Agar dilüsyon ve E test yöntemlerinin avantaj ve dezavantajları yönünden karşılaştırılması Agar dilüsyon yöntemi: E test yöntemi: * Referans yöntemdir * İş yükü azdır * Standarttır * Pratiktir. * Rutin kullanıma uygun * Referans yöntem değildir değildir. * Çok sayıda bakteri * Standart değildir. varlığında uygundur. * Uzun inkübasyon ortamına ihtiyaç duyar.