MYCOBACTERIACEAE Prof. Dr. Mehmet KIYAN

Mycobacterium cinsi Takım: Actinomycetales Aile : Mycobacteriaceae Mikobakteri cinsindeki bir türde bulunması gereken minimal standartlar: Aside dirençlilik Hücre duvar yapısında mikolik asit bulunması G+C / DNA oranının % 61-71 mol olması Tip tür: Mycobacterium tuberculosis

Jenerasyon süresi diğer bakterilerden daha uzun Üreme özellikleri Aside dirençlilik İntrasellüler Jenerasyon süresi diğer bakterilerden daha uzun Üreme özellikleri Isı Pigment Süre Yavaş ilerleyen granülomatöz inflamasyon

Granulomatous inflamasyon Kronik inflamasyonun subtipidir Granulom formasyonu ile karakterizedir İnfeksiyöz Tüberküloz Lepra Sifiliz Brusellozis Kedi tırmığı hastalığı Granuloma inguinale Schistosomiasis Cryptococcus neoformans Non-infeksiyöz İnorganik materyaller Silica Berylium Asbestozis Pneumoconiosis Talk Zirconium Sistemik hastalıklar: Sarcoidozis Romatoid artrit, romatoid nodüle sebep olan Wegener hastalığı Chron hastalığı

Mikobakteriler neden yavaş ürer? Hücre duvar yapıları kalındır ve bol lipid içerir Besin maddelerinin hücre içine taşınması güç Lipid üretimi için besin ve enerji ihtiyaçları fazla Solunum enzimleri, enerji üretimlerinde önemli farklılıklar DNA dependent RNA polimeraz enzim defekti Nükleik asit sentez oranları az Ribozomal RNA genleri az

Mikobakteriler intrasellüler bakterilerdir Mikobakteriler intrasellüler bakterilerdir. İntrasellüler yaşam mekanizmaları Fagositer hücrelerin oksidatif fosforilazyonunun engellenmesi Fagozom-lizozom füzyonunun inhibisyonu Lizozomal enzimlere direnç Peroksit veya oksijen radikalleri gibi bakterisidal madde inaktivatörleri veya inhibitörlerinin salınımı Bakterisidal ajanların hedefe ulaşmasının engellenmesi Fagozomdan sitoplazmaya kaçış

Mycobacterium cinsi 80’den fazla tür 30 tür insan infeksiyonlarında rol oynar M. tuberculosis ve M. lepra’da tek kaynak insan Diğer türler doğada (toprak, su, hayvan) yaygın

Mycobacterium türleri Patojen türler Non-patojen türler Yavaş üreyen Hızlı üreyen Yavaş üreyen Hızlı üreyen (n:25) (n:6) (n:7) (n:33) M.africanum M. abcessus M.cooki M.agri M.avium M. chelonae M.gastrii M.alvei M.bovis M. fortuitum M.gordonae M.fallax M.kansasii M. peregrinum M.hiberniae M. phlei M.leprae M. porcinum* M. terrae M. smegmatis M.marinum M. senegalense* M. triviale M.tokaiensis M.microti* M. vaccae M.tuberculosis M. yunnamense M.xenopi .......

Tüberküloz bakterilerinin tarihçesi: Vesalius (1478): İlk klinik ve patolojik gözlemler Sylvius: Tüberküllerin tanımı Marton (1689): Bitme, tükenme (verem) tabiri Fracastorius: Bulaşıcı özellik Willemin (1865): İnsandan hayvana geçiş deneyleri

Lehmann-Newmann (1886): M. tuberculosis Robert Koch: (1882): Bakterinin mikroskopta gösterilmesi (1884): Koch postulasının tarifi (1890): Old tüberkülin Lehmann-Newmann (1886): M. tuberculosis Calmette-Guerin (1921): BCG aşısı Siebert-Glenn (1939): PPD Waksman (1944): Streptomisin

M. tuberculosis complex M. bovis: Sıklıkla akciğer dışı organ tüberkülozu M. africanum: Batı Afrika’da nadiren *M. microti: Kemirici hayvanlar için patojen Bu bakteriler arasında DNA homolojisi % 85-100 M. tuberculosis ile M. bovis arasında % 100 benzerlik

M. tuberculosis genom yapısı Tek, geniş ve sirküler bir DNA Genomunda 4.411.527 baz çift nükleotid G+C / DNA oranı % 65.6 Tekrarlayan DNA elementleri Tek kopya rRNA genine sahip Yeryüzünün değişik bölgelerinden izole edilen suşlar sürpriz biçimde çok az varyasyon gösterir.

Morfolojik özellikler Alışılmış bakteriyolojik boyalarla zor boyanan Aside dirençli boyanma özelliğine sahip Uçları yuvarlak Düz veya hafifçe kıvrık Hareketsiz Sporsuz Kapsülsüz basil şeklindeki bakteriler

Aside dirençli boyanan mikroorganizmalar Nocardia spp (N. asteroides, N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum) Legionela micdadei, Rhodococcus aurantiaca, Isospora spp., Microsporidia spp., Cryptosporidium ookistleri, Echinococcus granulosus protoskolekslerinin dikenleri Bakteri sporları

Üreme Şartları İlk izolasyonda * M. tuberculosis; zorunlu aerob * M. bovis; mikroaerofil % 5 - 10 CO2 üremeyi arttırır. Bazı özel şartların yerine getirilmesi halinde oksidatif metabolizmalarını minimal düzeye indirip, düşük O2 konsantrasyonlarında ve anaerob şartlarda üremeden yaşamlarını devam ettirirler.

Metabolizma Öncelikli olarak EMP yolunu Gerekli olduğu zaman Pentoz fosfat Trikarboksilik asit (TCA)

Karbon kaynağı Gliserol organik asitler - kısa zincirli: piruvik asit, sitrik asit, asetik asit - uzun zincirli: palmitik asit, oleik asit karbonhidratlar: glikoz, fruktoz, sukroz, mannoz trehaloz, inositol, mannitol gerekirse CO2 içeren basit karbon kaynakları

Nitrojen kaynağı Asparajin* Glutamin* Amonyum tuzları Amidler Aminler Aminoasitler Nükleozid

Elementler ☻ Eser Elementler * Demir, * Çinko, * Manganez ☻ İnorganik Elementler * Sodyum, * Potasyum, * Sülfür, * Fosfor

Demir nakli * Demir; üreme için esansiyel elementtir. * Mikobakteriler gelişmiş demir yakalama, bağlama ve taşıma sistemlerine sahiptirler. 1. Ekzoşelin - ferrik iyon - ferriekzoşelin - reseptör 2. Mikobaktin - ferriekzoşelin & serbest ferrik iyon * Ferriekzoşelin veya ferrimikobaktine bağlanan ferrik iyonlar NADH-bağımlı redüktaz enzimi ile ferröz iyonuna redüklenir, hücre içine taşınır ve serbest hale geçer.

Mikobakterilerin üretilmesinde kullanılan besiyerleri

Mikobakterilerin üretilmesinde kullanılan besiyerleri 1. Organik maddeler içeren besiyerleri: Lowenstein- Jansen besiyeri (LJ) Modifiye OGAWA besiyeri Petregnani besiyeri Trudeau besiyeri: Besiyerlerinin karışımı, tüplere dağılımı, koagulasyon işlemleri özellik isteyen işlemlerdir. 3. Sentetik besiyerleri: PPD ve BCG hazırlanmasında kullanılır. 3. Yarı sentetik besiyerleri: - Lowenstein- Jansen besiyeri (LJ) - Middlebrook besiyeri - Youmans besiyeri - Dubos besiyeri - Kischner besiyeri 4. Yumurtasız besiyerleri: Middlebrook 7H9 besiyeri (Sıvı) Middlebrook 7H10 -7H11-7H12 (Katı)

Besiyerleri İlk izolmanda kompleks besiyerleri İnhibitör ajan olarak Malaşit yeşili Rutin uygulamalarda: ilk izolman, koloni morfolojisi, biyokimyasal özellikler, antitüberküloz ajanlara duyarlılığın belirlenmesinde: * Lowenstein-Jensen * Middlebrook 7H 9 * Middlebrook 7H 10 ve 7H 11

M. tuberculosis M. bovis İlk izolmanda: M. tuberculosis : mecburi aerob M. bovis : mikroaerofil M. tuberculosis : ögonik M. bovis : disgonik

Bazı özelliklerine göre tüberküloz basillerinin ayrımı Özellik M.tbc M.bovis BCG M. africanum Koloni morfolojisi L-J R S R R Middlebrook R R R R Niasin + - - - Nitrat redüksiyonu + - - - Tween 80 hidrolizi + / - - + / - - Ureaz + / - + + + TCH üreme + - - V PZA üreme - + + -

Nonkromojen mikobakteriler M. avium - intracellulare M. xenopi M. ulcerans M. gastri M. terrae M. malmoense

Fotokromojen mikobakteriler Işıklı ortamda sarı-portakal renkli pigment oluşturan karanlıkta oluşan kolonileri renksiz mikobakteriler: M. kansasii M. marinum M. simiae

Skotokromojen mikobakteriler Hem karanlık hemde ışıklı ortamda pigment oluştururlar. Karanlıkta sarı veya açık turuncu renkteki koloniler ışığa maruz kalınca koyulaşır. M. scrofulaceum M. szulgai M. gordonae M. flavescens

Dirençlilik M. tuberculosis complex üyeleri kuruluğa ve kimyasal dezenfektanlara çoğu sporsuz bakteriden daha dirençlidir: * Kültür ortamında besiyeri içinde...... 12 yıl * Kurutulmuş halde...............................6-8 ay * Toprak ve suda................................... 5 ay * Balgam içinde.....................................20-30 saat * Tozların içinde....................................10 gün

Duyarlılık Pastörizasyon (Isı ve neme çok hassastır.) *** % 70-95’lik alkol ile 5-10 dakika *** Aseton ve tentürdiyot ile derhal ölürler % 3-8 formaldehit ile 10-25 dakika % 5 NaOH ile 10-25 dakika

Her bulaş infeksiyon ve hastalık ile sonuçlanır mı? Virulans, infeksiyon, infeksiyon hastalığı Basillerin ilk yerleştikleri doku ve organlar farklı da olsa meydana gelen patolojik olaylar aynıdır. Bulaş sonrası infeksiyon oluşup oluşmaması veya hastalık meydana gelip gelmemesi konağın direnci ile virulans arasındaki dengeye bağlıdır.

Hücresel immünite daha baskın Fagozom - lizozim füzyonu Proteolitik enzimler Radyolojik bulgu yok (PPD -) Basil öldürülür İnfeksiyon oluşmaz

Bakterinin virulansı daha baskın Fagozom-lizozom füzyonunun inhibisyonu, Basilden yüksek konsantasyonda NH4 & cAMP salınımı Fagozomun tahrip olması Vücuda yayılım Sitoplazmaya kaçış (Simon, Rich, Weigert odakları) Kana geçiş Makrofaj içinde yavaş üreme (İnfeksiyon) Hiler lefadenopati (Radyoloji +) (PPD +) A.C’de vazodilatasyon, ödem, PNL ve fibrinöz eksuda Lenf yolu

Sitoplazmik membran Asimetrik yapıda İki elektron yoğun tabaka, arada transparan bölüm * Fosfatidil inositol mannosid (PIM) * Lipoarabinomannan (LAM) * Diğer (kardiolipin, fosfotidil etanolamin, monofosfoinositol)

Fosfatidil inositol mannosid (PIM) Sitoplazmik zar ile hücre duvarı arasındaki bağlantıyı sağlar. Hapten özelliğine sahiptir. Çapraz koruyucu immünitede rolü ? Peptidoglikan ve polisakkarid sentezinde rol oynar. Arabinogalaktan ve lipoarabinogalaktan yapımında lipidlerin taşınmasına yardımcı olur.

Lipoarabinomannan (LAM) İnterferon gama aracılı makrofaj aktivasyonunu inhibe eder. T hücre proliferasyonunu engeller. Toksik oksijen radikallerinin temizlenmesinde rol oynar.

Hücre duvarı İçten dışa doğru: Elektron yoğun tabaka Elektron transparan tabaka Elektron opak tabaka

* N asetil - glukozamin Peptidoglikan tabaka * N glikolil - muramik asit (Lizozomal enzimlere direnç) asetil

Yağ asitleri * Duvar ağırlığının % 60 * Hidrofobisite * Hücre içi canlılığın sürdürülmesi * Lizis işlemlerine karşı direnç * Bakteriye granüler veya kord formunda üreme özelliği kazandırır.

Kord faktör (Trehaloz dimikolat : TDM) Konak hücre oksidatif fosforilasyonunda hasar oluşumu Sistemik toksisite (farelerde) Antitümör aktivite Granülom oluşumu Sitokin indüksiyonu Kemotaktik faktörlerin salınımı PNL göçünün engellenmesi Alternatif yoldan kompleman aktivasyonu

Fenolik glikolipidler: Sulfolipidler: Fagozom-lizozom füzyonunu engeller. Fenolik glikolipidler: Fagolizozom içinde oluşan toksik oksijen metabolitlerini detoksifiye eder.

Mikolipenik asit: Wax D: Lökositlerin göçünü engeller. Freund’s adjuvanının etkisini arttırır. BCG’nin belli tümörlerdeki immünoteropatik etkisinden sorumlu yapıdır.

Protein ve Antijenler Tüberkülinler * Old tüberkülin (32 kda.) * Saflaştırılmış protein derivesi (2 ve 9 kD.) Lipoproteinler Isı şoku proteinleri Salgısal proteinler Enzimler

Tüberkülin Deri Testi Tüberkülin testi PPD solüsyonuyla sol önkolun 2/3 üst iç kısmına, mümkün olduğunca kılsız ve venlerden uzak bir bölgeye yapılmalıdır. Solüsyondan 5 TÜ eşdeğer olan 0.1 ml'si insülin enjektörüyle (27 gauge iğne) deri içine (intrakutan) olarak verilmelidir. Bu yönteme Mantoux yöntemi denir. Enjeksiyon yapılırken iğnenin kesik ucunun yukarı gelmesine özen gösterilmelidir.

Tüberkülin Deri Testi Enjeksiyondan sonra test deri içine yapıldıysa 6-10 mm'lik beyaz renkli bir kabarcık oluşur. Bu oluşmadıysa hemen ikinci test dozu birkaç cm uzak bir yere yapılmalıdır. Test yapıldıktan sonra gecikmiş tip hücresel yanıtın tetiği çekilmiş olur. Tüberküloz basilleri ile daha önce karşılaşan kişide bellek T hücreleri oluşmuştur. PPD solüsyonunun enjekte edilmesiyle bellek hücreleri ortama gelir. Ortama lenfokinler salgılanmaya başlar. Bu lenfokinler o bölgede vazodilatasyona, ödeme, fibrin birikimine ve diğer inflamatuar hücrelerin toplanmasına yol açar, Bu olaylar deride kendini endürasyon olarak gösterir.

Tüberkülin Deri Testi Reaksiyon ortalama 5-6 saatte başlar ve 48-72 saatte maksimuma ulaşır. Kaybolması günler alır. İlk 24 saatte ortaya çıkan reaksiyonlar aşırı duyarlılık reaksiyonu olarak algılanmalı geç tip yanıtla karıştırılmamalıdır. İlk 24 saat içinde ortaya çıkan aşırı duyarlılık reaksiyonu kendini deride kızarıklık olarak gösterir.

Tüberkülin Deri Testi TDT, okunurken oluşan kızarıklık dikkate alınmamalı sertlik (endürasyon) incelenmelidir. Endürasyonun varlığı inspeksiyon ve palpasyonla saptanabilirse de kalem ucuyla endürasyonun sınırlarının belirlenmesi daha duyarlı bir yöntemdir. Kalem deriye 45 derece açıyla test yapılan bölgeye doğru ilerletilir. Endürasyon sınırına gelindiğinde kalem ucu deriye takılır. Bu nokta endürasyon sınırı olarak kabul edilir. Test çevresinde bu işlem tekrarlanır. Şeffaf bir cetvelle kalemin takıldığı noktalar ölçülerek TDT sonucu milimetre cinsinden rapor edilir.

Tüberkülin Deri Testi Endürasyon çevresinde ölçülen kola göre dikey ve yatay çapların rapor edilmesi önerilmektedir. Testin ideal olarak 48 - 72 saatte değerlendirilmesi önerilmektedir. Eğer bu süre içinde ölçülemediyse 96 saate kadar ölçüm yapılabilir. Endürasyon oluşmadıysa "negatif" yerine " sıfır mm" olarak rapor edilmesi daha doğrudur.

Tüberkülin Deri Testi Test yerinde bül, vezikül vb lezyonlar oluşabilir. Bunların klinik önemi yoktur. Lokal tedavi gerektirmez. Ağrı olursa oral yoldan antiinflamatuar ilaçlar önerilir.

Tüberkülin Deri Testi BCG aşısı yapılanlarda pozitif PPD deri testinin aşıya mı yoksa Mikobakteriyel infeksiyonuna mı bağlı olduğunu tam olarak söylemek mümkün değildir. Tüberküloz ile enfekte şahıslarda BCG aşısının cevabı da farklıdır. Bu kişilerde genelde 1-2 gün içinde 5 mm’nin üstünde endürasyon, 5-7 gün içinde püstül ve 10-15 gün içinde de skar ve iyileşme görülür. Normal şahıslarda bu cevap 2-3 hafta içinde skar, 3 ay içinde de iyileşme şeklinde oluşmaktadır.

TBC düşündüren durumlar: tüberküloz ile uyumlu şikayet ve bulgular TBC hastası ile yakın temas öyküsünün varlığı, daha önceden yapılmış BCG aşısının üzerinden uzun bir süre geçmiş olması deri testinin endürasyon yanıtının beklenenden fazla olması sayılabilir.

Ülkemizde TDT Reaksiyonunu Değerlendirme Kriterleri BCG'lilerde 0 - 5 mm Negatif 6 - 14 mm Şüpheli BCG pozitifliği 15 mm ve üzeri Pozitif, infeksiyon (+) ***Bağışıklığı baskılanmış kişilerde 5 mm ve üzeri pozitif kabul edilir BCG' sizlerde 0 - 5 mm Negatif 6-9 mm Şüpheli reaksiyon; 1 hafta sonra test tekrarı, Test tekrarında: 6-9 mm Negatif >10 mm Booster fenomeni 10 mm ve üzeri Pozitif

Booster Fenomeni (Hatırlatma fenomeni): Uzun süre tüberküloz antijeni ile karşılaşmayan bellek hücreleri antijeni unutur. Yapılan ilk TDT antijeni hatırlatır. Bir hafta sonra yapılan TDT gerçek reaksiyonun oluşmasına neden olur. Konversiyon olarak kabul EDİLMEMELİDİR.

Tüberkülin Deri Testi PPD testinin en büyük dezavantajı PPD antijenlerinin M. tuberculosis, M. bovis BCG ve MOTT bakterileri ile ortak antijenler içermesi ve BCG aşı uygulamasının ve tüberküloz dışı mikobakteri infeksiyonlarının yaygın olduğu yerlerde özgüllüğünün azalmasıdır. PPD testi epidemiyolojik olarak latent M. tuberculosis infeksiyonunun taranması ve kliniklerde aktif tuberküloz infeksiyonunun tanısında yardımcı olarak kullanılmaktadır.

Tüberkülin Deri Testi Aktif tüberkülozlu hastalarda PPD duyarlılığı %75- 90 iken yaygın hastalıkta bu oran %50’ ye kadar düşmektedir. Dünya nüfusunun çoğu BCG ile aşılıdır ve BCG aşısının etkisi uygulama yapılmasından 15 yıl sonrasına kadar devam edebilmektedir. Bu nedenlerle BCG ile çapraz reaksiyon vermeyecek antijenlerin arayışına gidilmiştir. Latent M. tuberculosis infeksiyonunda humoral immun cevap genellikle zayıf olduğundan, hüresel immun cevabın hedefi olabilecek antijenler araştıurılmıştır.

İnterferon Gamma Salınım Testleri (IGST) ESAT-6 (Eary Secretory Antigenic Target) M. tuberculosis H37Rv , M. bovis ve BCG suşlarının genomlarının kıyaslanması ile RD (region of difference) şeklinde tanımlanan 16 farklı bölge belirlenmiştir . M. bovis’deki RD1 bölgesi 1921 tarihindeki in vitro kültürlerde kaybolmuştur. RD1 bölgesi BCG aşı suşu ve çoğu çevresel mikobakterilerde bulunmazken M. tuberculosis kompleks bakterilerinde bulunmaktadır. Andersen ve ark. 1995 yılında M. tuberculosis kompleks bakterilerinin RD1 bölgesinde kodlanan düşük molekül ağırlıklı iki antijen tanımlamışlardır. ESAT-6 (Eary Secretory Antigenic Target) CFP-10 (Culture Filtrate Protein).

ESAT-6 (Eary Secretory Antigenic Target) Bu antijenler M. tuberculosis kültür filtratlarından saflaştırılmış olup M. tuberculosis kompleks bakterileri M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum bazı atipik mikobakteri M. kansasii, M. marinum, M. szulgai, M. flavescens, suşlarında eksprese edilmekte, ancak M. bovis’in BCG suşlarında ve çevreden izole edilen mikobakterilerin çoğunda bulunmamaktadır. Tüberküloz oluşturulmuş hayvan modellerinde interferon gamma salgılayan CD4+ T hücrelerinin hedefinin ESAT-6 proteini olduğu gösterilmiştit. Tüberkülozlu hastaların periferik kandaki mononükleer hücrelerinin ESAT-6 ile uyarılması sonucunda ELISA testi ile saptanabilen interferon gamma düzeyleri tespit edilmiştir.

ESAT-6 (Eary Secretory Antigenic Target) Dr. Lalvani ve ark. (2001) ELISPOT testi ile aktif tüberkülozlu hastaların % 96’sının pozitif, kontrol grubunun % 92’sinin negatif BCG ile aşılanmış kontrol grubunun tümünün negatif olduğunu göstererek ELISPOT testinin BCG aşılaması ile M. tuberculosis infeksiyonunun ayırt edilmesinde kullanılabilecek bir yöntem olduğunu ileri sürmüştür. Bu veriler kanda dolaşan ESAT-6’ ya özgü T hücrelerinin M. tuberculosis infeksiyonunu işaret edebileceğini düşündürmüştür. ELISPOT (enzim-bağlı immunospot) yöntemi ile periferik kanda interferon gamma salgılayan T hücre sayısının belirlenmesinin tuberkülozda tanı koydurucu olabileceği hipotezini akla getirmiştir.

ESAT-6 ve CFP-10 antijen testleri Yeni kuşak Quantiferon-TB gold testi ile tam kanda ESAT-6 ve CFP-10 antijenleri kullanılarak interferon gamma yanıtı gösterilmekte, ELISPOT testinde de aynı antijenler kullanılmakta, ancak test için tam kan değil periferik kan mononükleer hücreleri gerekmekte ve interferon gamma üreten T hücre sayısı belirlenmektedir. Ticari olarak iki interferon gamma testi bulunmaktadır; Quantiferon-TB testi (Cellestis Limited, Victoria, Avusturalya) T SPOT-TB testi (Oxford Immunotec, Oxford, İngiltere) Bu yöntemlerde ELISA ve ELISPOT teknikleriyle T hücrelerinden salınan interferon gamma gösterilerek hücresel bağışıklık değerlendirilmektedir.

ESAT-6 ve CFP-10 antijen testlerinin Avantajları Testin referans laboratuvarlarında yapılması durumunda daha hızlı ve güvenilir sonuçlar alınması mümkün olduğu gibi, yanlış pozitif veya negatiflikleri ortadan kaldıran bir test tüberküloz gibi çok önemli bir sağlık sorunun tanısına büyük katkıda bulunacaktır. PPD deri testinde sonuç 2-3 gün iken IGST’ de bir gün Dezavantajlar İmmün sistemi baskılanmış hastalarda, çocuklarda, akciğer dışı ve çoklu ilaca dirençli tüberkülozlu hastalarda, sağlık personeli gibi sık temas öyküsü olanlarda testin kullanılabilirliğinin detayları ile tanımlanması gerekmektedir. PPD deri testine göre ELISPOT testinin maliyeti yüksektir laboratuvar deneyimi gerektirmektedir.

TEST SEÇİMİNDE CDC ÖNERİLERİ BCG’li kişiler veya bir günde sonuç alınması gerekenler IGST tercih edilmeli TDT’de kabul edilebilir 5 yaş altı çocuklar TDT tercih edilmeli IGST de kabul edilebilir Yeni temaslılar ve Yüksek mesleki risk taşıyanlar Her ikisi de (TDT ve IGST) kabul edilebilir Hem IGST hemde TDT birlikte yapılması gerekenler İlk test negatif ise Aktif Tb şüphesi olanlar TB enfeksiyon riski artarsa İlk testi pozitif ise: Sağlık ve enfeksiyon riski düşük olanlar Enfekte olduğuna dair ek delil gerekenler (BCG’li IGST tekrarı yada TDT yapılması gerekenler Belirsiz, sınırda geçersiz veya sıra dışı değerler,

Polisakkaritler Deney hayvanlarında anaflaksi Konak hücre makrofajlarında TNF-a salınımı Damardan dokulara nötrofil geçişi İltihabi reaksiyon oluşumu Lipopolisakkarite karşı antikor oluşumu

Salgısal proteinler Antijen 85 kompleksi *Fibronektine bağlanma özelliğindedir. *Konak hücre içine giriş hızlanır böylece bakteri ekstrasellüler savunma mekanizmalarından kaçar. * T hücre ve makrofaj aktivasyonunu engeller.

Fagosite edilen antijenin sindirilmesi sırasında rol oynayan faktörler Reaktif oksijen metabolitleri Peroksidaz ve katalaz etkisi ile hidrojen peroksit’ten oluşan toksik halit’ler Nitrik oksit Nötral pH’da aktif katyonik proteinler ve defensinler Asit pH’da aktif lizozomal enzimler Laktoferin ve arginaz gibi büyüme inhibitörleri

Antijen Sunumu Dışarıdan alınarak sindirilen veya aslında küçük bir molekül olduğu için işlenmesine gerek olmayan yabancı antijenlerin lenfositlere sunulmasıdır. Bu sunuşta rol oynayan en önemli yüzey molekülü HLA antijenidir. Yüzeyinde HLA antijeni taşıyan tüm hücreler antijen sunabilirler.

Hücresel İmmün Yanıtta Antijenin Tanınması Antijenin lenfositler tarafından özgül olarak tanınması hücre membranında bulunan reseptörlerle (TCR) sağlanır. Antijen sunan hücrelerce işlenmiş antijenlerden * 8-12 aa. içeren epitoplar Class I * 12-24 aa. içeren epitoplar Class II bağlanır.

Antijen Sunan Hücreler Profesyonel Antijen Sunucu hücreler: MHC class II antijenleri: * monosit / makrofaj yüzeyinde, * dendritik hücrelerde ve * uyarılmış B hücrelerinin yüzeyinde bulunur. Antijeni CD4 T lenfositlerine sunarlar. MHC Class I antijenleri çekirdekli tüm hücrelerde (eritrosit) bulunur. Antijeni CD8 T lenfositlerine sunarlar.

GENEL BİLGİ TH Lenfositleri üç farklı immün yanıt mekanizmasını etkinleştirir Makrofaj aktivasyonu ve geçikmiş tip aşırı duyarlılık reaksiyonu Antikor salgılanması, mast hücresi ve eosinofil aktivasyonunun olduğu immün yanıt CD8 sitotoksik T (Tc) lenfosit ağırlıklı immün yanıt

Antijene Karşı TH lenfosit Yanıtı Antijen üzerindeki epitoplardan hangisini tanıyacağını ayırt eder (özgül yanıt) Seçilen hedef epitopa karşı oluşacak immün yanıt mekanizmasını belirler Seçilen hedef epitopa karşı oluşacak immün yanıtta rol oynayacak olan diğer hücreleri uyarır Fagositik hücrelerin ve diğer effektör hücrelerin fonksiyonel kapasitesini arttırır.

TH lenfositleri antijenik uyarım sonucu TH1 ve TH2 lenfositlerine dönüşürler - TH1 lenfositlerinden IFNγ - TH2 lenfositlerinden ise daha çok IL - 4 ve IL - 10 salgılanır. Genel olarak IL-2 salgılanması; * IFNγ salgılayan hücrelerde devam etmekte * IL - 4 oluşturanlarda ise engellenmektedir.

Tüberküloz basilleri insan vücuduna: Solunum (Pflugge damlacıkları) Sindirim Deri Konjunktiva *** Her bulaş sonucu infeksiyon oluşur mu? *** İnfeksiyon nedir? *** İnfeksiyon hastalığı nedir?

Pflugge damlacıklarının sağlıklı kişiler tarafından solunması Büyük partiküller burun ve bronş siliaları Küçük partiküller alveoler makrofajlar

Hücresel immünite baskın Fagozom lizozim füzyonu Proteolitik enzimler Radyolojik bulgu yok Basil öldürülür İnfeksiyon oluşmaz

Bakterinin virulansı daha baskın Fagozom-lizozom füzyonunun inhibisyonu, Basilden yüksek konsantasyonda NH4 & cAMP salınımı Fagozomun tahrip olması Vücuda yayılım Sitoplazmaya kaçış (Simon, Rich, Weigert odakları) Kana geçiş Makrofaj içinde yavaş üreme (İnfeksiyon) Hiler lefadenopati (Radyoloji +) (PPD +) A.C’de vazodilatasyon, ödem, PNL ve fibrinöz eksuda Lenf yolu

Tüberküloz İnfeksiyonu ve Hastalığın Gelişimi Ekzojen yeni infeksiyon İnf. Yok Primer veya Progresif HASTALIK Primer hastalık % 5 % 5 Reaktivasyon Bulaştırıcı % 95 % 95 Hastalık TB hastası İnf. Latent inf. gelişmez

Primer ve Reinfeksiyon tüberkülozu arasındaki farklar

Tanı DSÖ tanımlamasına göre; (şüpheli tüberküloz enfeksiyonunun tanı kriterleri) 1- Akc. Tbc.li biri ile temas öyküsü olan 2- Kızamık ya da boğmaca sonrası normal sağlığına dönemeyen 3- Antibiyotik tedavisine yanıt vermeyen öksürük, kilo kaybı, hırıltı ya da yüzeyel lenf nodlarında ağrısız büyüme olan her çocukta tbc den şüphelenilmeli Günümüzde çocuklarda Tbc tanısını mikrobiyolojik olarak doğrulamada hala sorunlar vardır. Tbc hastalığı olan çocukların % 50’sinden az bir kısmında alınan örneklerden basil izole edilebilir. Çocuk Tbc’unda tanı epidemiyolojik, klinik ve radyolojik verilere göre yapılır. Hastalığın tanısında en önemli kanıtlar; Enfekte olgu ile temas öyküsünün varlığı PPD pozitifliği Pozitif radyolojik bulgular

Radyolojik tanı Akciğer tüberkülozunun oluşum yeri % 95 akciğer parankimidir. Tüberkülozdan şüphelenilen çocuklara mutlaka ön-arka ve yan akciğer grafileri çekilip primer odak veya lenfadenopati açısından incelenmelidir. Çocuklarda bronşlar daha küçük çaplı olduğundan büyümüş lenf nodlarıyla daha kolay basıya uğrar. Lokalize havalanma fazlalıkları, atelektaziler görülebilir

Tanı Ayrıca kalsifikasyonlar, alveolar konsalidasyon, interstisiyel dansite artışı, miliyer opasifikasyon nadiren fokal kitle izlenebilir. Tüberkülin reaksiyonu geliştikten sonra; GHON kompleksi küçük parankimal infiltratlar hiler lenfadenopati görülür hale gelmektedir. Bazen bilgisayarlı tomografi, düz grafilerde görülemeyen parankimal nodülleri ve lenfadenopatileri yakalamada kullanılabilmektedir. Tanıda; basilin gösterilmesi en önemli bulgudur. Balgam çıkaramayan çocuklarda yayma ve kültür için en iyi örnek gastrik aspirattır. Örnekler yaymada görülme ve kültürde üreme olasılığını artırmak için en az 3 kez gönderilmelidir Gastrik aspirat için sabah, 8-10 saatlik açlıktan sonra, çocuk hareketlenmeden ve gece boyunca yutulan akciğer sekresyonlarını mideden boşaltan hareketler başlamadan önce örnek alınması gerekir.

Tanıda; basilin gösterilmesi en önemli bulgudur. Çocuklarda gastrik lavajla alınan aspiratta basil gösterilme oranı % 28-40 arasındadır. 1 yaş altı çocuklarda yapılan bir çalışmada; bu yaş grubundaki çocuklarda basil görülme oranının daha yüksek olduğu (% 75) gösterilmiştir. Son yıllarda; balgam indüksiyonu ve nazofarengeal aspirasyon yöntemiyle alınan örneklerin basil saptanmasında, gastrik aspirata göre daha etkili olduğu gösterilmiştir.

Homojenizasyon-Dekontaminasyon-Konsantrasyon Homojenizasyon-dekontaminasyon-konsantrasyon işleminde en sık N-Asetil L-Sistein (NALC) + Sodyum hidroksit (NaOH) ve NaOH (%3-4) gibi yöntemler kullanılmakla birlikte; zefiran-trisodyum fosfat, oksalik asit, setilpridinyum klorid -sodyum klorid gibi farklı yöntemlerden de yararlanılabilir. Tüberküloz etkeni bakterilerin izolasyonu için klinik örneklere lökosit, eritrosit, vücut sıvıları ve doku gibi organik kalıntılardan arındırmak amacı ile homojenizasyon dekontaminasyon ve örnekteki bakteri yoğunluğunu artırmak için konsantrasyon işlemi uygulanır.

N-Asetil L – Sistein (NALC) + Sodyum hidroksit (NaOH) yöntemi NALC mukolitik, NaOH dekontaminan ve sodyum sitrat klinik örnekte bulunabilecek ağır metal iyonlarını bağlayarak NALC’ın inaktive olmasını önlemek amacıyla kullanılır. NALC oksijene duyarlı olduğu için bu karışım hazırlandıktan sonra 24 saat içinde kullanılmalıdır.

N-Asetil L – Sistein (NALC) + Sodyum hidroksit (NaOH) yöntemi Klinik örnek 50 ml’lik polipropilen, dibi konik, burgulu kapaklı steril tüplere (Falkon tüpü) aktarılır ve üzerine klinik örneğin miktarı kadar NALC-NaOH solüsyonu ilave edilir. Örnek 10 ml’den fazla ise en pürülan, mukoid ve kanlı kısmından 10 ml alınmalıdır. Mukoid olmayan örnekler santrifüjde çevrildikten sonra elde edilen sediment dekontamine edilir. Örnek + NALC-NaOH karışımını içeren tüpler 30 saniyeyi geçmeyecek şekilde vortekslenir. Tüpler oda ısısında ara sıra elle çalkanarak 15 dakika bekletilir. Bu süre aşılmamalıdır. Dekontaminasyon işlemini takiben yapılacak her işlemde asepsi-antisepsi kurallarına uyulmalıdır.

N-Asetil L – Sistein (NALC) + Sodyum hidroksit (NaOH) yöntemi Süre tamamlandığında nötralizasyon amacı ile Falkon tüpünün 50 ml işaretine kadar 0,067 M fosfat tamponu (pH 6.8) ilave edilip, karışım el yardımı ile alt-üst edilir ve dekontaminasyon işlemi durdurulur. Fosfat tamponu ilave edilmiş tüpler, bakteri yoğunluğunu artırmak için 3000 x g’de 15-20 dakika santrifüj edilir. Süpernatant, içinde 1/10-1/50 dilüe edilmiş NaOH bulunan bir kaba boşaltılır. Sedimente 1-2 ml steril fosfat tamponu (pH 6.8) veya % 0.2’lik sığır albumin fraksiyon V ilave edilir. Re-süspanse işlemi uygulanır ve kullanılan kültür yöntemine uygun olarak besiyerine ekilir.

N-Asetil L - Sistein(NALC)+Sodyum hidroksit (NaOH) yöntemi Ayrıca direkt mikroskopik inceleme için lam üzerine yayma işlemi yapılır. Normalde steril olduğu düşünülen BOS, vücut sıvıları ve kan gibi örneklere dekontaminasyon işlemi uygulanmaz. Bu örnekler santrifüj edildikten sonra besiyerlerine ekimleri yapılır. Ancak örnek alımı ve transportu esnasında asepsi antisepsi kurallarına uyulmamış ise bu örneklere de dekontaminasyon işlemi uygulanır.

Tanı 1. Kültür : 2. BACTEC Loewenstein-Jensen besiyerinde mikobakterilerin üremesi 6-8 haftayı bazen 10 haftayı bulabilmektedir. Radyometrik teknoloji aisteminde 14C işaretli palmitik asit içeren ortamda mikobakteriler, palmitik asidi metabolize edip 14CO2 oluştururlar ve bu da şişenin üstünde birikir. Radyoaktivitenin ölçümüyle tanı konur. Bu yöntemle üreme olursa ortalama 2 haftada saptanır

Tanı 3. Mikobakteriyofajlar Lusiferaz enzim geni taşıyan mikobakteriyofajlarla enfekte mikobakteriler ortama lusiferin eklenince görülür hale gelmektedirler. 4. PCR: Klinik örneklerden mikobakterileri direkt olarak belirleyen DNA amplifikasyon yöntemidir. Bu teknikte pozitif sonuç için örnek en az 10 mikobakteri içermeli Pahalıdır Kontaminasyona bağlı yanlış pozitif sonuç riski yüksek Klinik veya epidemiyolojik olarak kolay tanı konamayan belirgin akciğer hastalığı olan çocuklarda, immun yetmezlikli hastalarda ve ekstrapulmoner tüberkülozda faydalı

BCG Aşısı 1908 yılında Pasteur Enstitüsünde (Lille) Calmette ve Guerin isimli araştırıcılar M. bovis ile infekte mastitli bir sığırdan aldıkları örneği gliserinli sığır eti, safra sıvısı ve patatesten oluşturdukları besiyerine ekip Bacille-Calmette Guérin (BCG) adını verdikleri basili üretmişler Daha sonraki 13 yıl boyunca, üç haftalık periyotlarla toplam 230 kez seri pasajlarını yapmışlar ve virulansı zayıflatılan bu bakteriyi 1921 yılında insanlarda tüberküloza karşı aşı olarak kullanılmaya başlamışlardır.

BCG Aşısı BCG ile ilgili uluslararası kontrollü çalışmaların ilki 1935 yılında Phipps (ABD’nde) tarafından yapılmış ve çok iyi sonuçlar alınmış: Aşının etkinliği % 75 Mortalitede azalma % 82 Aşı ile ilgili bu iyi sonuçlar 1952’de İngiltere’deki okul çocuklarında yapılan araştırmalar la da desteklenmiş Aşının etkinliği % 77-84 olarak bulunmuş BCG aşısının ülke çapında yaygın şekilde kullanıma girmesi kararlaştırılmıştır.

BCG Aşısı Bu umut verici sonuçlar Porto Rico, Hindistan ve ABD’nin Illinois eyaletindeki çalışmalardan gelen sonuçlar ile yerini karamsarlığa bırakmıştır. 1969 yılında Hindistan’ın güneyinde 265.172 kişi ile yapılan ünlü Madras (Chingleput) çalışmasında BCG aşının çocukluk çağı TBC menenjit ve milier TBC gibi ağır formları dışında koruyuculuğunun olmadığı görüşü ortaya atılmıştır.

BCG Aşısı ANCAK BCG aşısının çocuk ve erişkinlerde akciğer TB’na karşı etkinliğinin olmadığını gösteren bu çalışmaların aksine 1995 yılında bir çok çalışmalar dikkate alınarak sunulan iki adet meta-analiz raporu yayınlanmış BCG’nin Erişkinlerde TB’a yakalanma riskini % 50, ölüm riskini % 71, menenjite yakalanma riskini % 64 oranında azalttığını, Yenidoğan ve bebeklik döneminde % 52-74 oranında hastalıktan, % 65 oranında ölümden, % 64 oranında ise menenjitten koruduğu belirtilmiştir.

BCG Aşısı Hastalığın en yaygın formu olan erişkin akciğer TB’da BCG aşısının koruyuculuğunun İngiltere’de ~ % 80 Hindistan’da ise % 0 olmasının teorik olarak nedeni: 1. Ilıman ve tropikal iklim altında çevresel mikobakterilere yoğun şekilde maruz kalan insanlarda BCG aşısının koruyuculuğunun azalması 2. Helmintik enfeksiyonlar gibi diğer patojenler ile ko-enfeksiyonların varlığı 3. Aşının genetik değişikliğinden kaynaklanabileceği sanılmaktadır.

BCG Aşısı İlginç olan diğer bir konu aşıya bağlı oluşan deri testi reaktivitesinin derecesi ile hastalığa karşı aşının koruyuculuğu arasında korelasyonun olmadığıdır. Bu sonuçlar yeni, etkili, ucuz ve uzun süre koruyuculuğu olan yeni bir aşının ne kadar gerekli olduğunu göstermektedir. Etkinliği % 50 oranlarında bile olsa bugün için TB’a karşı yeni bulunacak bir aşının 2030’larda beklenen yaklaşık 9 milyon insanın hastalığa bağlı ölümünü önleyeceği tahmin edilmektedir. Sağlık çalışanlarına eskiden olduğu gibi artık BCG aşısı önerilmemekte onun yerine PPD deri testi ile ara ara kontrol edilmelerini, deri testinin pozitif olduğu ve TB hastalığı ile yakın teması olan veya diabet, dializ ve immün yetmezlikli hastalarla ilgilenen yüksek riskli sağlık çalışanlarına izoniazid proflaksisi önerilmektedir.

BCG Aşısının Yan Etkileri Aşının ciddi komplikasyonları oldukça nadirdir. Farklı aşı suşuna bağlı yan etkiler değişmekte hatta aynı suşa bağlı yan etkiler zamanla yapılan pasajlardan sonra farklı olabilmektedir. En sık görülen yan etki % 1-10 oranında aşı yerinde görülen ve uzun süren ülserasyon, lenfadenit lupus vulgaris Yan etki riski, diğerlerine göre daha güçlü olan aşı suşlarında daha fazla görülmektedir. Daha çok immün yetmezliği olan hastalarda görülmesine rağmen aşıya bağlı osteomyelit yaklaşık 1 milyonda bir, ölümcül dissemine TB 10 milyonda bir vakada görülmektedir.

BCG Aşısının Kontrendikasyonları Konjenital immün yetmezliği olanlar Semptomatik HIV enfeksiyonlular Lösemi ve lenfomalı hastalar Bazı özel durumlar: Steroid tedavisi gören Antineoplastik ilaç kullanan Radyasyon tedavisi alan hastalar Hamileler Fetus üzerinde olumsuz bir yan etki gösterilmemekle beraber BCG aşısının hamilelere yapılması tavsiye edilmemektedir

Klinik önemi olan Mikobakteriler Patojen Sıklıkla patojen Potansiyel patojen Saprofit (nadiren patojen) M. tuberculosis, M. bovis, M. ulcerans M. kansasii, M. marinum M. avium-intracellulare, M. fortuitum, M.chelonea, M. simiae, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. malmoense, M. asiaticum, M. abscesus, M. haemophilum, M. genavense, M. gordonae, M. flavescens, M. vaccae, M. terrae, M. trivale, M. phlei, M.gastri , M. smegmatis, M. thermoresistigle

MOTT ile oluşan bazı infeksiyonlar

Klinik örneklerden izole edilen MOTT türleri hastalık etkeni midir? 1. Hastada MOTT ile ilgili bir veya daha fazla hastalık bulunmalı 2. Diğer hastalık etkenleri (M. tuberculosis, mantar vb.) ekarte edilmeli 3. İzole edilen MOTT türlerinin hangi hastalıkta hangi sıklıkta infeksiyona sebep oldukları iyi bilinmeli 4. Materyalin alındığı yer dikkate alınmalı 5. Balgam, idrar, dışkı gibi kontamine örneklerde koloni sayısı önemlidir. 6. Vücut sekresyonlarının en az 3 kez tekrarlanan kültürlerinde aynı tür bakteri üremelidir.