Mikrodizin Teknolojisi ve Mikrodizin Veri Analizi

Mikrodizin Nedir ?

Mikrodizin Nedir ? Binlerce gen/transkript ifadesini aynı anda belirleyebilen yüksek işlem kapasiteli bir teknoloji Cam, slikon gibi bir desteğin üzerine belirli bir düzen ile yerleştirilmiş DNA dizileri Kullanım Alanları gen ifade profilleme hastalıkların tanısı SNP deteksiyonu gen tanımlama (gıdalardaki mikroorganizmaların tayini, GDO tayini, vs.) farmakogenetik çalışmalar (ilaç keşfi)

Böyle de bilinir... DNA chips biochips gene chips gene arrays genome chips genome arrays

Mikrodizin deneylerinin avantajları Hızlı Data on >50,000 transcripts within days Kapsamlı Bütün bir organizmanın genomu çipin üzerinde Esnek Kullanıcı tarafından tasarlanabilen çipler (Custom arrays) Kolay Bir merkezden hizmet alınabilir Ucuz? 55.000 transkript için ortalama 1300 TL 5

Mikrodizin deneylerinin dezavantajları Maliyet ■ Some researchers can’t afford to do appropriate numbers of controls, replicates RNA ■ The final product of gene expression is protein significance ■ “Pervasive transcription” of the genome is poorly understood (ENCODE project) ■ There are many noncoding RNAs not yet represented on microarrays Kalite kontrol ■ Artifacts with image analysis ■ Artifacts with data analysis ■ Not enough attention to experimental design ■ Not enough collaboration with statisticians 6

Mikrodizin deneylerinin dezavantajları mRNA düzeyinde ölçüm var, protein düzeyinde değil Sonucu etkileyebilecek çok değişken mevcut Çip ve prob tasarımı Deney tasarımı Örnek hazırlığı Görüntü elde etme Veri normalizasyonu Veri analizi

Hangi sorulara cevap verir? Farklı zaman, farklı doku ve hastalık durumlarında değişiklik gösteren genlerin belirlenmesi Kompleks genetik hastalıkların belirlenmesi İlaç bulma ve toksikoloji çalışmalarında Mutasyon ve polimorfizm belirlemede (SNP’s) Patojen analizlerinde

Hücre grupları arasındaki ifade profillerinin belirlenmesi… …hasta gruplarından alınan örneklerde …viral enfeksiyon sonrası …knockout hücrelere göre …ilaç uygulaması sonrası …farklı gelişim evrelerinde …farklı organlarda 9

Prensip Northern blotlama benzeri – Baz eşleşmesi, nükleik asitler arası hibridizasyon • Northern blotlama ile farklılıkları – Aynı anda binlerce genin tayini / tek gen tayini – Cam lam/naylon membran – Floresan işaretli hedefler / radyoaktif dNTP’ler

Prensip

Mikrodiziler: array yüzeyi Southern et al. (1999) Nature Genetics

En fazla bilinen ticari mikrodizin platformları

Mikrodizin türleri Iki temel mikrodizin teknolojisi vardır cDNA mikrodizileri (Stanford) Oligonükleotid dizileri (Affymetrix)

cDNA çipi (DNA mikrodizisi, iki kanallı dizi) İlk olarak Stanford Üniversitesi’nde geliştirilmiştir. İki adet floresan boya kullanılır (cy3, cy5)

cDNA arrays Animation (Courtesy: Dr. A. Malcolm Campbell, Davidson College, NC) (www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html)

Oligonükleotid dizileri Öncülüğünü Affymetrix yapmıştır (GeneChip®) DNA prob sekansları 25-mer uzunluğundadır Fotolitografi tekniği kullanılarak cam üzerinde sentezlenmektedir Tek floresan boya kullanılmaktadır

Oligonükleotid dizileri Her bir sekans bir prob kümesi ile ifade edilir. 1 prob kümesi = 16 prob çifti Herbir prob çifti = 1 Perfect Match (PM) prob ve 1 MisMatch (MM) prob Perfect match (PM, reference seq) ATG…C…TGC (20-25 bases) Mismatch (MM, one base change) ATG…T…TGC Bir genin ifadesi PM ve MM sinyallerinin ortalama farkları alınarak hesaplanır.