Kronik Stres altındaki sıçanlarda oluşan Mide yara lezyonlarında Somatostatin anoloğu Oktreotid iyileştirici etkisi World Journal of Gastroenterology Danışman : Prof.Dr.İbrahim Ethem AKÇIL Çeviren ve Sunan : Opr.Dr.Rasim Levent KILIÇASLAN Literatür Sunumu ANKARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ FİZYOPATOLOJİ BİLİM DALI

AMAÇ Kronik ılımlı streste gastrik ülser gelişimindeki etkisini değerlendirmek ve bir sentetik Somatostatin analoğu olan Oktreotid ile gastrik lezyonlardaki olası düzelmelerin saptanmasıdır. Peptik Ülser sıklıkla stres hastalığı olarak tanımlanır. Stres nörohormonal regülasyon mekanizmalarını değiştirir. Kronik ılımlı stres; ılımlı beklenmeyen stres faktörlerinin kombinasyonuna verilen isimdir. Bunun ötesinde Reaktif Oksijen Türleri’nin (ROS) ve inflamatuar regülatörlerin oluşumunda da etkilidir. Stres; gastrik ülser oluşumunda beyin bağırsak aksını stimüle ederek, mukozal kan akımını azaltarak ve lökosit infliltrasyonunu arttırarak etki eder. Lökosit infiltrasyonu ise serbest radikalleri açığa çıkarır ve sitokin formasyonu ile reaktif oksijen türleri oluşturarak ve mukozal hasarı meydana getirir.

İnterlokin-10 (IL-10) ve Tümör Nekroze edici Faktör-alfa (TNF-α) gastrik ülserde önemli rol üstlenir. Gastrik Ülser TNF-α ve Caspase-3 oluşturarak apopitotik etkiler de gösterir. Somatostatin; mide D hücrelerinden salınıp; parietal hücreleri ve asit salınımını direkt, Histamin ve Gastrin salınımını ise indirekt olarak inhibe eder. Bunun ötesinde Somotostatin; Pepsin sekresyonunu ve peptik ülser kanamalarında önemli olan gastroduedonal kan akımını azaltır. Gastrik ülserlerinde Somatostatin otokoidi’nin kan düzeyinin azalmasının etkili olduğu düşünülmektedir. Sentetik Somatostatin analogları; gastro-protektif ajan olarak lokosit adezyonunu inhibe etmeleri, anti-oksidan özellikleri ve anti-sekretuar potansiyelleri ile önemlidirler. Bu çalışma sentetik Somatostatin analoğu Oktreotid’in kronik ılımlı strese maruz bırakılan deneklerdeki gastrik mukoza değişimlerinin düzeldiğini göstermek amacıyla planlanmıştır.

MATERYAL VE METOD (175 +/- 15 gr) ağırlığında erişkin erkek Wistar fareleri, Her biri 10 ila 12 denek içeren 6 deney grubuna ayrılarak, (23 +/- 2° C) sabit sıcaklıkta, (%60 +/- %10) sabit nemli ortamda, Her gün Sabah saat 05:00’da başlayan sabit süreli 12 saatlik ışık-karanlık ortamında, Her biri sabit standart fare yemi ve musluk suyu ile beslenerek, 21 gün rastgele stres prosedürlerine tabi tutulmuş; Kontrol grupları dışındaki deneklere 50 mg ve 90 mg Oktreotid stresle beraber uygulanmıştır.

Stress Protokolü: Bekris ve arkadaşları tarafından önerilen……. Günlük 10 dakika süreli yüksek hız ajitasyonu, 24 saat süreli denekleri besin ve sudan yoksun bırakmak, Denekleri her gün 5 dakika 45 °C sıcakta ya da 1 saat 4 °C soğukta tutmak, Denekleri her gün 2 saat immobilize etmek, Denekleri günlük 3 saat rahatsız edici sese maruz bırakmak, 24 saat boyunca sürekli ışık altında tutmak, Deneklerin kafesini günlük 12 saat eğerek koşullarını zorlaştırmak ………prosedürlerini içermektedir. Kontrol denekler strese maruz bırakılan deneklerle temas ettirilmemişlerdir.

Grup 1: sadece intraperitoneal saline uygulanan Kontrol Grubudur. Grup 2: sadece 50 microgram Oktreotid kilogram başına intraperitoneal uygulanmış, Grup 3: sadece 90 microgram Oktreotid kilogram başına intraperitoneal uygulanmış, Grup 4: Kronık Ilımlı Stress uygulanıp tedavi verilmemiştir. Grup 5: Kronık Ilımlı stress ile beraber 50 mcgr/kg intraperitoneal Oktreotid 21 gün boyunca stress prosedürünün iki saat öncesi saat 09:00-12:00 arası uygulanmış; Grup 6: Kronik Ilımlı stress ile beraber 90 mcgr/kg intraperitoneal Oktreotid 21 gün boyunca stress prosedürünün iki saat öncesi saat 09:00-12:00 arası uygulanmış; 21 gün sonunda makroskopik ve mikroskopik doku incelemeleri ile beraber Plazma Kortikostreotid düzeyi, Oksidatif Stres ve Apopitotik Biyomarkerlar’ı ölçülmüştür.

Yapılan analizler şunlardır: 1.) Plasma Kortikosteroid düzeyi: 12 saatlik karalık siklus başlangıcında EDTA’lı tüplere toplanarak Radio Immun Assay (RIA) ile çalışılmıştır. Gastrik mukoza soyulup homojenize edilip, buzlu soğuk tuzlu su (Salin) ile Lipid Peroksidaz saptanması için etkileştirilerek; 2.) Total Antioksidant Kapasitesi (TAC), 3.) TNF-α, 4.) IL-10, 5.) Caspase-3 düzeyleri bakılmış ; 6.) PG E₂ saptanması için 1 mmol/L Indometazin içeren 0,1 mol/L (pH=7,4) fosfat tampon solusyonu -70°C ısıda dondurulmuş olarak kullanılmıştır. TNF-α, IL-10, PG E₂ gastrik mukosal değerleri ELISA yöntemi ile ; Caspase-3 aktivitesi ise Chromophore p-Nitro Alidine(pNA)’inin Caspase-3 aktivitesi sonucu doku lisatları tarafından salınması ilkesi ile kolorimetrik kitler kullanılarak spektofotometrik olarak 405 nanometrik olarak ölçülmüştür. 7.)Lipid Peroksidaz düzeyleri saptanması için Tiyobarbitürik asit reaksiyonu Malonildialdehit (MDA) standart olarak alınarak kullanılmıştır.

8.) Ülser İndeksi Ölçümü: Fareler her bir gruptan 4 denek rastgele örneklenerek sakrifiye edilmiş; mide hemen eksize edilip; büyük kurvatur boyunca açılarak her bir saptanan lezyonun en geniş çapı ölçülüp her bir denekte tüm lezyonların çapları toplanmıştır. 9.) Histopatolojik İnceleme: Her bir gruptan 4 denek rastgele alınarak sakrifiye edilip, doku örnekleri %10 fosfat ile tamponlanmış formaldehit ile fikse edilerek; parafin bloklar oluşturulmuş; 5 mikrometrelik kesitler hazırlanıp, Hemotoksilen Eosin ile boyanmıştır. 10.) İstatiksel inceleme: ANOVA (tek yönlü varyans analizi) ve Tukey-Kramer Çoklu Karşılaştırma Testi kullanılarak, SPSS 16.0 Windows istatiksel paketi ile yapılmış, (p<0,05) anlamlı kabul edilmiştir.

SONUÇLAR Kronik ılımlı stres Plazma Kortikosteroid düzeyini Tablo 1 de görüldüğü şekilde yükseltmiştir. (28+/- 0.6 mcg/dl), (p=0.002). Somatostatin analoğu Oktreotid 50 ve 90 mcg/kg dozlarında tedavi amaçlı uygulandığında ise Plazma Kortikostreoid düzeyleri Tablo 1 de altta görüldüğü üzere ( %61 ve %71), (p=0.002) düzelmiş; gastrik lezyon formasyonu gerilemiştir. Kortikostreoid düzeyi artışı ile beraber midenin glandular bölgesinde erozyon Tablo 1 ve Grafik 1 de gösterildiği gibi oluşmuştur. ( 6.4+/ mm), (p=0.01). TABLO 1: MDA Düzeyi,TCA Düzeyi ŞEKİL 1: Mide Mukozasındaki Değişiklikler

50 ve 90 mcg/kg dozunda üç hafta süreli günlük Oktreotid tedavisi kontrol grubu deneklerle karşılaştırıldığında diğer verilerde istatistiksel anlamda bir değişiklik göstermezken sitokinlerden IL-10 düzeyinde artış sağlamıştır.( /-94.1), ( /-95.21pg/g doku),(p=0.001). 50 ve 90 mcg/kg dozunda üç hafta süreli günlük Oktreotid tedavisi kontrol grubu deneklerle karşılaştırıldığında diğer verilerde istatistiksel anlamda bir değişiklik göstermezken prostaglandin PGE₂ düzeyinde azalma sağlamıştır. (64.9+/-2.2), (62.95+/-3.57pg/g doku),(p=0.002). Tablo 2: TNF-α (üstte), IL-10 (altta) düzeyi Tablo 3: PGE₂ düzeyi (pg/g)

Oktreotid ise gerek 50 mcg gerekse 90 mcg/kg düzeylerinde uygulanması ardında gastrik mukozal MDA, TNF-α, PGE₂, Caspase-3 aktivitelerini baskılamış; bunun ötesinde gastrik mukozal IL-10 düzeyini arttırmış; TAC düzeyini ise değişmemiştir. Kronik ılımlı stres gastrik mukozal MDA, TNF-α, PGE₂, Caspase 3 düzeylerini kontrol gruplarla karşılaştırıldığında anlamlı olarak yükseltmiş buna karşılık IL-10 gastrik mukozal düzeyinde azalmaya yol açmıştır. Total Antioksidan Kapasitesi (TAC) düzeyinde kronik ılımlı strese rağmen belirgin bir değişiklik görülmemiştir. TABLO 1: MDA (üstte) ve TCA düzeyi (altta) TABLO 2: TNF-α (üstte) ve IL-10 düzeyi (altta) TABLO 3: PGE2 düzeyi (altta) TABLO 4: Caspase-3 düzeyi (altta)

ÖZET SONUÇLAR Kronik Ilımlı Stres; 1.) Plazma Kortikostreodlerini arttırır. 2.) Histopatolojik olarak doğrulanabilecek şekilde gastrik lezyonlara eşlik eder. 3.) Gastrik mukozal Lipid Peroksidazları, TNF-α ’yı, PgE₂ ’yi ve Caspase-3 aktivitesini arttırır. 4.)Buna karşılık IL-10 düzeyini düşürür. Sentetik Somotostatin analoğu Oktreotid ise uygulandığı her iki doz düzeyinde de; 1.) Plazma Kortikosteroidini azaltır. 2.) Gastrik lezyonlarda iyileşme meydana getirir. Oktreotidin bu etkisini muhtemelen antioksidant, anti-inflamutuar, anti-apopitotik etkilerini bağlı olarak gerçekleştirir.

TARTIŞMA Önceki çalışmalar akut stresin gastrik ülser oluşumunda etkisini göstermiştir. Bu çalışmada ise ılımlı çevresel stres faktörlerine kronik maruziyet etkileri gerek gastrik lezyonların makroskopik ve mikroskopik bulguları ile beraber gerekse ardındaki mekanik yollar ile araştırılmıştır. Kronik ılımlı stres (CMS)’in 21 gün süreli bu çalışmada; 1.)Plazma Kortokostreodi’ ni artırarak, 2) Gastrik mukozal erozyonları tetikliyerek, 3) Mukozal oksidasyon durumunu pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinlerle yeniden düzenliyerek, 4) Caspase-3 aracılıklı apopitozisi aktive ederek, 5) Gastrik mukozada PGE₂ ‘yi artırarak etki göstermiştir. Oktreotid’in uygulaması ile ülser formasyonu azalmış; CMS bağımlı laboratuvar bulguları düzelmiştir.

Stres beyin bağırsak aksının aktivasyonuna sebep olarak hem sempatik hem de parasempatik olarak mideyi stimüle eder. Sempatik aktivasyon arteryal vazokonstriksüyon yaratıp kan akışını azaltırken; Parasempatik aktivasyon ise gastrik motiviteyi ve musküler kasılmayı arttırarak damarın bası altında kalması ve izleyen mukozal iskemiye neden olur. Bu çalışma ile Hidropik Dejenerasyon, Gastrik Erozyon ve Gastrik Epitelyal Deskuamasyon’ un iskemik sonuca bağlı olarak açığa çıktığı saptanmıştır. Bu iskemik sonuç mitokondriyal elektron transport zincirinden Süperoksit anyonunun sızmasını tetiklemiş; makromoleküllerde bunu izleyen Oksidatif Stres hasarına sebep olan Hidroksil radikallerinin oluşumunu arttırmıştır. Stres ülserleri lokosit infiltrasyonuna bağlıdır. Bunun sonucunda Serbest radikal üretimi ve TNF-α oluşumunu arttırır. TNF-α ise inflamatuar bir sitokin olduğu için alana daha fazla nötrofil çekerek hasar siklusunu hızlandırır. Bu çalışmada TNF-α ile beraber Lipid Peroksidazların da arttığı gözlemlenmiştir. Lipid Peroksidaz; Oksidatif Stresdeki Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) belirteçlerinden biridir. Bu çalışmada Lipid Peroksidazyonu artışı MDA ile saptanmasına rağmen Total Antioksidan Kapasitesi (TAC) değişmemiştir.

Total Antioksidan Kapasitesi (TAC)’ın değişmemesi; gastrik mukozanın Kronik Ilımlı Stres (CMS) tarafından tetiklenen Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) bazılarının artması bazılarının azalması sonucu, endojen antioksidanların daha önce akut stres modellerinde de yayınlandığı üzere toplam konsantrasyonunun değişmeden kalmasına bağlıdır. Buna karşılık TNF-α ’ya karşıt etkisi olan anti-inflamatuar sitokin IL-10 seviyesindeki azalmanın gastrik ülser formasyonundaki artışa etkisi olabilir. Son zamanlarda genetik IL-10 polimorfizminin bireylerde peptik ülser oluşumuna yatkınlık meydana getirdiği saptanmıştır. Sentetik Somatostatin analoğu olan Oktreotid anti-ülserojenik aktiviteye sahiptir. Bu protektif özellik mukozal kan akımını sağlamasına bağlıdır. Gastro-protektif etkisinin Malonildialdehid (MDA) düzeyini azaltması ile ilişkili olduğu bir diğer Oktreotid kullanılan çalışmada Şener ve arkadaşları tarafından 2004 yılında kanıtlanmıştır. Oktreotid’in gastro-protektif etkisinin nötrofil infilitrasyonunu inhibe etmesi ve gastrik mukozaya infilimatuvar hücre akımını azaltması yoluyla gerçekleştirdiğini de Scheimann ve arkadaşları bir diğer çalışma ile saptamışlardır.

Oktreotid aynı zamanda sitokin düzeyleri üzerinde de etkili olup; infilamatuar stokinlerden olan TNF-α ’yı baskılayarak anti-inflamatuar etkiler göstermektedir. Buna karşın Velt ve arkadaşları Oktreotid’in doza bağımlı olarak IL-10 düzeyini arttırdığını saptamışlardır. Apopitoz ve apopitotik hücre ölümü TNF-α ve aktif serbest radikal Caspase-3 ’ün artışına bağlı olarak gelişir. Caspase; nötrofil aktivasyonunda ve kemoatraktanların artmış varlığı ile kısır döngü oluşturarak gastrik hasarı arttırır. Kronik Ilımlı Stres (CMS)’de artmış Caspase-3 aktivitesi ve artmış TNF-α düzeyi oksidan-antioksidan mukozal dengesini bozarak etki eder. Espluges ve arkadaşları aslında stresin bizzat kendisinin santral refleks sinir mekanizmaları ile gastrik asit sekresyonunu inhibe ettiğini göstermiş olmasına rağmen bu çalışma ile gastrik bezlerdeki atrofi ve dejenerasyon ile beraber gastrik epitel tabakasında yitmesinin hücre ölümüne katkıda bulunabileceği gösterilmiştir. Her ne kadar bir çok çalışmada Somatostatin apopitozisi arttırıcı olduğu bildirilmesine rağmen, bu çalışma Oktreotid uygulanmasının apopitozisin inhibitorü olan Bcl-2’yi arttırdığını da göstermiştir.

Endojen Glikokortikoidlerin ülserojonik aktivitesi çoğu çalışma tarafından gösterilmiş olsa da Steroidlerin beyin bağırsak aksının bir komponenti olarak belirgin ülserejonik etkilerinden çok strese adaptif yanıt olarak salındığı da gösterilmiştir. Bu çalışmada Kronik Ilımlı Stresin (CMS); strese adaptif yanıt olarak kortikosteroid düzeyini arttırdığını; CMS’ye maruz kalan farelerde soğuğa maruz kalma stresine benzer şekilde şaşırtıcı bir şekilde PGE₂ düzeyinin de arttığı saptanmıştır. Stres koşulları altında Endotelial Büyüme Faktörü (EGF) artmakta ve gastrik mukozal hücre proliferasyonu oluşmaktadır. Bunun ötesinde ılımlı stres ile Fosfolipaz A2 aktive olmakta Araşidonik asit Siklo oksijenaz 1 ve Siklo oksijenaz 2 enzimleri ile metabolize olarak prostaglandinler oluşmaktadır. Prostaglandinler stres karşıtı koşullar oluşturup stres etkisini azaltırlar. Bu olgu muskuler tabakaya kadar invaze olan derin ülserlerden daha çok yüzeyel erozyanların görülmesini de açıklamaktadır. PGE₂ bu özelliğinin yanısıra gastrik savunma faktörlerinden olan gastrik kan akımını regüle eder, mukusu ve bikarbonat sentezini arttırır.

Bu çalışma CMS’ye maruz kalan farelerde artmış mukus salgısının adaptasyon teorisini doğrular şekilde artmış PGE₂ düzeylerinin sonucu olarak oluştuğunu göstermektedir. Protektif ve agresif faktörlerin arasındaki dengenin bozulmasının peptik ülser oluşumundaki sorumluluğu nedeniyle gösterilen değişmiş koşullar gastrik korumadan ziyade ülser formasyonuna işaret eder. Buna karşılık Oktreotid tedavisi PGE₂ düzeyini düzelterek ılımlı stres koşullarının gastrik mukozada yaptığı etkiyi engeller. Bu çalışma halen çevremizde bulunan sonucunda gastrik lezyonların gelişmesine sebep olan gastrik mukozanın agresif faktörlerine Kronik Ilımlı Stres (CMS) yoluyla maruz kalmasını açıklamış olup; CMS’ye maruz kalan farelerin stres kaynaklı peptik ülser için kronik bir model oluşturabileceğini ve anti-ülser aktivitesinin komponentlerinin gösterilmesinde değerlendirilebileceğini göstermiştir. Oktreotid’in gastroprotektif mekanizmaları muhtemelen antioksidant kapasitesi ile beraber bunu izleyen anti-inflamatuar ve anti-apopitotik etkilerine bağlıdır.