Nörotransmitter döngüsü: Veziküler ve Plazma Membranı Taşıyıcılarının Moleküler Yapısı ve Düzenlenmesi Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/ Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi

Nörotransmitterler (NTler) Sinir sisteminde mesajcı olarak iş gören moleküllerdir Yapıları son derece çeşitlilik gösterir 2C’lu Gly Büyük peptidler

Otto Loewi

Bir molekülün NT olabilmesi için şu koşulları sağlanması gerekir: Nöronda sentezlenmeli veya nöronda bulunmalı Nöron uyarıldığında salınmalı ve hedefte bir yanıt oluşturmalı Molekülün deneysel ortamda hedef üzerine uygulanması ile aynı yanıt elde edilmeli İşlevini yerine getirdikten sonra bulunduğu yerden uzaklaştırılmalı

Sinaptik iletimde ilk basamak NT’lerin sentezlenmesidir

Küçük-molekül yapısındaki NT’ler Akson terminalinde lokal olarak sentezlenirler Sentezlenmeleri için gerekli olan öncü moleküller, membran üzerindeki seçici taşıyıcılar aracılığı ile akson terminaline alınır. Bir grup öncü molekül ise hali hazırda nöronda meydana gelen metabolik olayların ara ürünleridir. Bu işlemleri katalizleyecek olan enzimler ise hücre gövdesinde üretilip yavaş aksonal taşınma ile akson terminaline ulaştırılırlar.

Peptid NT’ler Büyüklük ve sentezlendikleri yer bakımından diğer NT’lerden farklıdırlar. 3-36 aa uzunluğunda Hücre gövdesindeki ribozomlarda sentezlenirler Sentez süreçleri daha karmaşıktır, sekretuvar protein sentezine benzer

Asetilkolin (ACh) İlk keşfedilen NT 1921de Alman Biyolog Otto Loewi tarafından izole edilmiştir Kolinden sentezlenir İnhibitör/Eksitatör

Dopamin (DA) Tirozin’den sentezlenir Motor aktivite, duygu durum, motivasyon ve dikkat

Norepinefrin=Noradrenalin (NE) Dopaminden direkt olarak sentezlenir Epinefrinin öncü molekülüdür Sinaptik vezikül içerisinde sentezlenir Kalp atım hızı ve kan basıncının artmasına neden olur Bellek oluşumunda da önemli işlevi vardır

Glutamat (Glu) Aminoasittir Eksitatör sinapsların çoğunda bulunur Algı, bellek, öğrenme gibi çok farklı beyin işlevlerinde rol oynar Krebs döngüsünün bir ara ürünü olan α-ketoglutarattan sentezlenir

GABA (Ɣ-amino bütirik asit) Glutamat’tan sentezlenir En önemli inhibitör NT’dir CNS’de yüksek konsantrasyonda bulunur

Serotonin (5-HT) 5-Hidroksitriptamin Triptofan’dan 2 basamakta sentezlenir Dikkat, yeme, duygu durum, rüya görme, ağrı regülasyonu gibi kompleks bilişsel işlevlerde rol oynar

NT döngüsü NTlerin sinaptik veziküllerde paketlenmesi Hücre dışı ortamdam geri alınması Sinaptik iletimin sonlandırılması NTnin bir sonraki salınım için geri dönüştürülmesi

Sinaptik iletimin hızı ve etki gücü Aksonal butona uyarım geldiği anda, yüksek konsantrasyonda NT ile doldurulmuş sinaptik veziküllerin mevcudiyetine bağlıdır

Çok aktif olarak geri alınma söz konusu olur ise: Salınabilir NT havuzu yenilenebilir Postsinaptik hücrede meydana gelen sinyalin süresi ve seviyesi azalır Geri alınma ortadan kalkar ise: Postsinaptik reseptörler aşırı aktive olur NT kaynakları tükenir

Veziküllerde dik bir konsatrasyon gradyanı söz konu olur ise Vezikül başına salınan NT miktarı artar Ancak veziküllerin tekrar doldurulmasında kullanılacak sitoplazmik NT kaynakları azalır Veziküllerde yüzeyel bir konsantrasyon gradyanı söz konusu olur ise Veziküllerin NT ile doldurulması için gerekli sitoplazmik kaynak bol miktardadır Ancak salınma için mevcut NT miktarı azalır

Veziküllerin NT ile doldurulmasında 3 önemli belirleyici söz konusudur NT’nin sitoplazmik konsantrasyonu Vezikül membranı boyunca oluşan protonun elektrokimyasal gradyanının itici gücü Veziküler taşıcı proteinlerin içsel özellikleri

Bütün klasik NT’lerin sinaptik veziküllere taşınması veziküler H+/ATPaz (V-ATPaz) tarafından oluşturulan H+’nin elektrokimyasal gradyanının itici gücüne (ΔμH+) bağlıdır

ΔμH+ ΔPh Δψ

H+/ATPaz (V-ATPaz) ATP hidrolizinden salınan enerjiyi kullanarak protonları vezikül lümenine pompalar Membran sektör V0 ve membran sektör V1’den oluşan bu H+ pompası, aynen mitokondriyal ATP sentazdaki gibi, dönerek çalışan mekanizmaları kullanır

V-ATPaz’ın düzenlenmesi Vezikül dışı ortamda Cl- yokluğunda, V-ATPaz pozitif elektriksel membran potansiyeli (Δψ) oluşturur Veziküler NT taşıyıcısı (örn: VGLUT) protona karşılık olarak NT molekülünü konsantrasyon gradyanının aksi yönde vezikül içerisine transfer eder. Vezikülün NT ile dolması yavaştır ve giren NT miktarı azdır.

V-ATPaz’ın düzenlenmesi Vezikül dışı ortamda az miktarda Cl- bulunması, veziküler NT taşıyıcısı aracılığı ile Cl-’un vezikül içerisine doğru akışına neden olur. Anyonun girişi Δψ’yi ortadan kaldırır Anyon varlığına bağlı ve ikincil olarak H+ pompası aktive edilir. pH gradyanı oluşurulur (ΔPh) ΔPh’nın bir miktar artmasına bağlı olarak, Cl- olmadığı duruma göre daha kuvvetli bir NT girişi söz konusudur.

V-ATPaz’ın düzenlenmesi Vezikül içerisinde yüksek konsantrasyonda Cl-bulunduğunda, veziküler NT taşıyıcısı Cl-’un vezikülü terketmesine aracılık ederek elektriksel gradyanın yükselmesine neden olur. Elektriksel gradyanın oluşturduğu itici güç ile NT’nin vezikül içerisine girişi kolaylaşır. Vezikülün hızlı ve etkin bir biçimde NT ile doldurulması anlamına gelir.

Hücre dışı ortamda Cl- konsantrasyonunun lokal olarak değişkenlik göstermesi, GABA reseptörleri veya Cl-değişitiricileri aracılığıyla sağlanıyor olabilir. Düşük Cl- konsantrasyonuna sahip bölgelerde endositozla alınan veziküller daha yavaş ve az miktarda NT ile doldurulurlar.

Sinaptik veziküller çok sayıda ClC izoformu içerir. Ancak bu kanallardan hangilerinin vezikül asidifikasyonu için gerekli Cl- akışına katkı sağladığı net değildir

Aslında Glu, Cl-’dan daha etkin ve kalıcı bir biçimde ΔPh oluşturabilmektedir. Monoamin nöronlar tarafından salınan Glu, vezikül asidifikasyonu ve monoamin depolanmasındaki rolünden bağımsız olarak postsinaptik Glu reseptörlerini de aktive etmektedir. Herhangi bir monoamin salındığında (örn DA/5-HT) eş zamanlı olarak az miktarda da olsa Glu salınımının da gerçekleştiği tahmin edilmektedir. Dolayısı ile eş zamanlı glutamaterjik yanıt da oluşmaktadır. Bir nörondan iki farklı sinyalin salınmasının rolü henüz bilinmemektedir.

Veziküler NT Taşıyıcıları Sinaptik veziküller üzerinde bulunan ve veziküllerin NT ile doldurulmasından sorumlu membran proteinleridir. 1. VMATs : Veziküler Monoamin Taşıyıcıları (+ yüklü) 2. VAchTs: Veziküler Asetilkolin Taşıyıcıları (+ yüklü) 3. VGATs/VIAATs: Veziküler inhibitör aminoasit taşıyıcıları (nötral zwitteriyon) 4. VGLUTs: Veziküler Glutamat Taşıyıcıları (- yüklü)

Bütün klasik NT’lerin sinaptik veziküllere taşınması veziküler H+/ATPaz (V-ATPaz) tarafından oluşturulan H+’nin elektrokimyasal gradyanının itici gücüne (ΔμH+) bağlıdır ΔμH+ ΔPh Δψ

Veziküler NT Taşınması H+’nin elektrokimyasal itici gücünün (ΔμH+), ΔPh veya Δψ şeklinde ifade bulması, NT salınmasında özel bir öneme sahiptir. Farklı veziküler NT taşıyıcıları H+ gradyanının bu iki bileşenine farklı ölçülerde bağlıdır

Veziküler Monoamin Taşıyıcıları (VMATlar) 2 lümenal proton (H+) ile 1 sitozolik protonlanmış monomanin’in karşılıklı değiş tokuşu Dopamin, serotonin, epinefrin, norepinefrin, histamin Daha ziyade ΔPh’ya dayanır pHsı 5.8 ve Δψ 60 mV olan bir vezikül lümen/sitozol monoamin gradyanı 10^5

VMATlar Memelilerde 2 tip: VMAT1 ve VMAT2 VMAT1 non-nöronal hücrelerde (adrenal kromafin hücrelerinde) eksprese olur VMAT2 nöronlarda eksprese olur Substratlarına afiniteleri çok yüksek (Km: mikromolar seviyelerinde) Vmax: 5-20/sec Sitozolik monoamin konsantrasyonları çok düşük olsa bile vezikülleri etkin bir biçimde doldurabilirler

VAChT Asetil kolinin veziküler depolanmasından sorumlu taşıyıcı proteindir Proteinin primer aa dizisi bakımından VMATlara benzer Ancak Km’i daha yüksektir Vmax ~1/sec

VGAT İnhibitör NT’ler olan GABA ve Gly’nin her ikisi için de veziküler taşıyıcıdır Yapı olarak VMATlardan oldukça farklıdır. İşlevi büyük ölçüde Δψ’ye olmakla birlikte ΔPh’ya da dayanır Aktif aşınma için Cl-’a ihtiyaç duyar. Km’i diğer taşıyıcılarla karşılaştırıldığında oldukça yüksektir (GABA için ~5mM, Gly için ~25 mM). Vezikülleri doldurabilmek için yüksek sitozolik konsatrasyona ihtiyaç duyar.

VGLUTlar Diğer veziküler taşıyıcılar içinde işlevi Δψ’ye en bağlı olan ayrı bir protein ailesine dahildir. Veziküler Glu taşınmasında rol oynar Farede VGLUT genlerinin fonksiyonlarının engellenmesi sinaptik Glu salınmasını engellemektedir.

Striyatumdaki kolinerjik internöronlar  VGLUT3 DA nöronlar  VGLUT2 VGLUT2 inaktive edilirse DA depolanması ve salınmasındaki azalma nedeni ile psikostimülanların etkisi azalıyor Striyatumdaki kolinerjik internöronlar  VGLUT3 VGLUT3 inaktive edilirse ACh depolanması ve salınması azalıyor

VGLUT1-3 Beyinde bu genleri eksprese eden nöronlar Glutamaterjik nöronlar olarak kabul edilir VGLUT1: Hipokampüs ve korteks VGLUT2: Talamus ve beyin kökü VGLUT3: Glutamat salınması ile ilişkisi olmayan nöronlarda

Farklı VGLUT izoformlarının vezikül doldurma aktivitleri birbirine benzer Ancak bu izoformların hücre içi trafikleri farklılık gösterir VGLUT1 ve VGLUT2 neredeyse her zaman aksonal VGLUT3 ise dendritik ve bazı hücre populasyonlarının aksonlarında

VGLUT1 iki adet poli-prolin motifi içeriyor Bu motif sayesinde endofilin gibi proteinlerle etkileşerek endozitozda rol oynuyor Böylece taşıyıcının geridönüşümünde de etkili

Veziküler Taşıyıcıların Düzenlenmesi Vezikül üzerinde bulunan taşıyıcı sayısındaki farklılıkların vezikülün NT ile doldurulma hızını etkileyeceği tahmin edilebilir. Aslında tek bir VGLUT proteini bir vezikülü Glu ile doldurmak için yeterlidir. VGLUT1 heterozigotlarda sinaptik iletimde belirgin bir değişiklik yok. Farede davranış değişiklikleri rapor edilmiş.

VGLUT genleri aktivite ile düzenlenen genler Nöronal aktiviteye bağlı olarak ekspresyonları artmakta ve NT salınması üzerinde etkili olmaktadırlar Taşıyıcıların trafiği de düzenlenmede ve dolayısıyla sinaptik vezikül üzerindeki sayılarının belirlenmesinde son derece önemli

Plazma Membranı NT Taşıyıcıları Küçük molekül yapılı NT’lerin postsinaptik hücredeki etkilerinin sonlanması için bu moleküllerin sinaptik yarıktan temizlenmesini sağlayacak mekanizmalar gereklidir. NT’in taşıyıcı aracılı geri alınması Enzimatik olarak inaktif forma dönüştürme Asetilkolinesteraz

Sinaptik yanıtın akıbeti pekçok faktör tarafından belirlenir Sinapsın geometrisi Salınan NT’nin tipi NT reseptörlerinin özellikleri, sayısı ve lokalizasyonu NT taşıyıcıları NT tarafından ne kadar reseptörün ne süre ile aktive olacağını etkileyerek sinaptik yanıt üzerinde önemli belirleyici olarak işlev görürler.

Plazma Membranı NT Taşıyıcılarının İşlevleri Seçici olarak taşıyıcı blokörlerinin kullanılması Taşıyıcı proteinleri kodlayan genler bakımından transgenik hayvan modelleri Reseptörlere yakın lokalizasyonda ve yoğun olarak bulunduklarında sinaptik yarıkta ulaşılabilecek maksimum NT konsantrasyonunu düşürmek Reseptörleri aktive etmek için NT’lerin ulaşılabilir olduğu zamanı azaltmak NT’nin salındıktan sonra difüze olabildiği mesafeyi kısaltmak Komşu sinapslara yayılarak oradaki reseptörlere bağlanmayı (crosstalk) engeller Aynı anda aktif olan sinapslardaki NT’ler ile karışmayı (pooling) engeller

NT’in taşıyıcı aracılı olarak geri alınması çoğunlukla salındığı membran tafından gerçekleşir. Fakat özellikle aa yapısındaki NT’lerin sinaptik yarıktan temizlemesi astrosit membranında veya başka bir NT’nin salındığı presinaptik membranda bulunan taşıyıcılar tarafından geri alınma yoluyla gerçekleşir.

Ekzositoz ile salınmadan sonra, NT’lerin ekstraselüler alana difüzyonu son derece hızlı gerçekleşir ki bu hız taşıyıcı aracılığı ile hücre içine tekrar alınmasından çok daha fazladır. Bu nedenle sinaptik yarığın NT’den temizlenmesinde en önemli aşama, taşınma işleminden ziyade mümkün olan en kısa sürede (etrafa çok dağılmadan) taşıyıcıya bağlanmasının sağlanmasıdır.

Vezikül membranında bulunan taşıyıcılara benzer şekilde plazma membranı taşıyıcıları da transmembran iyon veya voltaj gradyanını temizleme işleminde enerji olarak kullanır. Bu özellikle aa NT’ler için son derece önemlidir. Çünkü sitozolik konsantrasyonları son derece yüksektir. Bu nedenle büyük bir konsantrasyon gradyanına karşı taşınmaları gerekir. Eğer membranın her iki tarafından konsantrasyonu dengeye eriştirecek şekilde bir taşınma olsaydı bu geri alınma değil: salınma olurdu.

Plazma membranı taşıyıcıları, plazma membranı boyunca Na+/K+ ATPaz tarafından meydana getirilen Na+ ve K+ gradyanını geri alma işlemi sırasında kullanır.

KO fare çalışmaları bu taşıyıcıların sinaptik fonksiyondaki fizyolojik önemlerini ortaya koymuştur. Beklendiği üzere NT temizlenmesinde azalmanın yanı sıra presinaptik NT havuz homeostazında da önemli. Etki sinapsın her iki tarafında söz konusu

Plazma Membranı NT Taşıyıcılarının Farmakolojisi

NET ve DAT Antagonistleri NET: Atomoxetine DAT: Methylphenidate

Plazma Membranı Taşıyıcılarının Moleküler Yapısı GABA, Gly, NE, DA, 5-HT taşıyıcıları SLC6 ailesine dahil 12 adet transmembran domain

EAAT’lar ayrı bir gen ailesinin üyesi SLC1 8-10 TMD

İlk yapı SLC1 ailesi üyesinde aydınlatılmış Kase şeklinde bir trimer Her bir momomerde birer adet olmak üzere 3 ayrı substrat bağlanma bölgesi Ortada bir koridor

Plazma Membranı Taşıyıcılaının Düzenlenmesi Transkripsiyon seviyesinde En çok çalışılmış ve en iyi bilinen örnek: SERT promotor’undaki tekrar dizisi polimorfizmi 5HTTLPR Kısa form «s»: Az sayıda tekrar: Azalmış mRNA ve Protein Uzun form «l»: Çok sayıda tekrar Kısa form: Anksiyete, duygu durum bozuklukları

Trafik ve Fosforilasyon seviyesinde düzenlenme Diğer tüm membran proteinlerinde olduğu gibi bu proteinler için de hücre yüzeyine doğru ve aksi yöne doğru konstitütif ve düzenlenmiş trafik söz konusudur. Tüm bu süreçler çok sayıda protein kinazlar tarafından düzenlenmektedir. İlave olarak, bu taşıyıcıların fosforilasyon-bağımlı olarak katalitik aktivasyon değişikliği gösterdiği bildirilmiştir. Ancak sadece birkaç düzenleyici fosforilasyon bölgesi bildirilmiştir ve henüz hiç birinin in vivo önemi gösterilememiştir.

İlave olarak, bu taşıyıcıların fosforilasyon-bağımlı olarak katalitik aktivasyon değişikliği gösterdiği bildirilmiştir. Ancak sadece birkaç düzenleyici fosforilasyon bölgesi bildirilmiştir ve henüz hiç birinin in vivo önemi gösterilememiştir.

PKC Glu taşıyıcısı GLT1/EAAT2’yi fosforiller ve PKC’ nin aktive olması GLT-1’in yüzey ekspresyonunu azaltır. Ancak fosforilasyonla trafik arasındaki ilişki tam bilinmiyor. PKC aktivasyonu DAT’ı fosforile ederek aktivitesini azaltır, ancak trafiğini etkilemez.

NT Taşıyıcıları ile İlişkili Proteinler 3 grup proteinle interaksiyonları tanımlanmış SNARE proteinleri (özellikle Syntaxin 1A) PKC, PKG, CaMKII ve PP2A gibi kinazlar ve fosfatazlar Hücre yüzeyi reseptörleri (D2 DA reseptörleri ve integrin beta3-içeren adezyon molekülleri)

Hücre içi Ca2+ SYN1A/NET interaksiyonunu engeller Ca2+ konsantrasyonu arttığı zaman veziküler füzyonun tetiklenmesi nedeni ile SYN1A, NET’den ayrılır NET’in taşıma aktivitesi artar Salınma ile eş zamanlı geri alınma sağlanmış olur

Plazma Membran Nörotaşıyıcılarının disfonksiyonu ile ilişkili hastalıklar

Ortostatik İntolerans (Postural Taşikardi Sendromu) NET Ala457Pro Artmış plazma NE In vitro: Azalmış yüzey NET ekspresyonu, NE geri alınımında dramatik azalma Dominant negatif etki Tüm OI hastalarında bu mutasyon yok Bilişsel fonksiyon bozuklukları

NET promotor varyantı Azalmış NET ekspresyonu ADHD

SERT Ile495Val nadir varyantı OKB, Asperger sendromu, anoreksi ve majör depresyonu bireylerin bulunduğu iki farklı ailede bildirilmiş In vitro: Transport aktivitesi artmış SERT

İlave 5 «gain of function» varyantı OSB’da bildirilmiş. Gly6Ala: Hiperfosforilasyon ve artmış aktivite Diğer 4 varyant: Artmış yüzey ekspresyonu