Mikroorganizmaların Üretilmesi- metabolizması

MİKROORGANİZMALARIN ÜRETİLMESİ Mikroorganizmaların Beslenme ve Üremesi için Gerekli Maddeler Doğada bulunan çeşitli mikroorganizmaların çeşitli beslenme biçimleri vardır. Beslenmelerini sodyum, potasyum, demir ve magnezyum tuzları gibi maddelerden, atmosferdeki karbondioksitten ve karbonatlardan sağlayan ve organik maddelere ihtiyaç göstermeksizin beslenebilenlere ototrof mikroorganizmalar denir.

Beslenebilmek için en az bir tane organik maddeye ihtiyaç gösterenler heterotrof mikroorganizmalardır. Heterotrof mikroorganizmaların bir kısmı etraflarındaki ölü organik maddeleri besin olarak kullanarak ayrıştırırlar ve doğadaki madde değişimine katkıda bulunurlar. Bunlar saprofit mikroorganizmalardır.

Tıbbi mikrobiyolojinin alanına giren mikroorganizmaların çoğu kemoheterotroftur

Mikroorganizmaların beslenme ve üremesi için gerekli maddeler: Hidrojen verici ve hidrojen alıcı maddeler Karbon kaynağı Azot kaynağı Mineraller Gelişme faktörleri ve vitaminler Oksijen Karbondioksit Su

Mikroorganizmaların üredikleri ortamda bulunması gereken maddeler : 1. Hidrojen verici ve hidrojen alıcı maddeler: Bunlar okside olabilen maddeler olup, oksidasyon esnasında enerji açığa çıkar. 2. Karbon kaynağı: Sitoplazmanın esaslarından olan polisakkarit, lipit ve proteinlerin yapısına giren karbonun sağlanması için gereklidir.

Gerekli olan karbon kaynağı mikroorganizmanın genetik özelliğine bağlı E. coli, tüm biyosentetik gereksinimleri için glukozu kullanabilir Streptokok türleri için bu yeterli değildir Ortamda farklı üreme faktörleri de bulunmalıdır

3)Azot kaynakları Mikroorganizmalar azot ihtiyaçlarını çoğunlukla amonyum tuzları, organik asitler ve aminoasitlerden sağlar Nitrat ve nitriti redükte ederek kullanırlar asimilasyon yolu Bazıları havadaki azot gazını hidrojen iyonuna bağlayarak amonyum oluştururlar azot fiksasyonu

Bakteri hücresi için mineraller; 4)Mineral kaynakları: Bakteri hücresi için mineraller; Mikroorganizmaların enzim aktiviteleri, elektron transport reaksiyonları, osmotik basınç dengeleri için gerekli Kalsiyum, magnezyum, potasyum, fosfor, kükürt, demir tüm bakteriler için gereklidir Çinko, molibden, manganez gibi eser elementler bazıları için ve çok az miktarda gereklidir Eser elementler musluk suyu/distile suda bile bulunduklarından, çoğu kez besiyerine ilaveleri şart olmayabilir

Sülfür kaynakları: Bakteri hücresinde sülfür Koenzimlerin yapısında Proteinlerin yapısında Çoğu mikroorganizma sülfür kaynağı olarak sülfat kullanır

Fosfor kaynakları: NAD gibi koenzimlerin, nükleik asitlerin ve ATP’nin sentezinde gereklidir Besiyerinde mono veya dipotasyum fosfat (KH2PO4, K2HPO4) tuzları bulunur

5) Gelişme faktörleri ve vitaminler: Çok küçük miktarları bile gelişme için mutlak gerekli, ancak mikroorganizma tarafından sentez edilemeyen, vitamin veya aminoasit gibi organik maddelerdir. Riboflavin Piridoksin Nikotinik asit, hematin Glutatyon Folik asit

ÜREMEYİ ETKİLEYEN ÇEVRESEL FAKTÖRLER

Fiziksel faktörler Sıcaklık Ozmotik basınç Hidrostatik basınç

Kimyasal faktörler Oksijen Hidrojen iyon yoğunluğu Redoks potansiyeli

Mekanik faktörler Basınç uygulama Çalkalama

SICAKLIK Beslenme ve üremeleri esnasında enzimlerinin çalışması için gerekli bir çevre sıcaklığına ihtiyaç duyarlar.

En düşük üreme sıcaklığı Bu sıcaklığın altında hücre içindeki su kristalleşir Hücrenin elektrolit yoğunluğu artar, Dehidrate olur En yüksek üreme sıcaklığı Bu sıcaklığın üzerinde enzimler denatüre olur, mikroorganizma canlılığını kaybeder En uygun üreme sıcaklığı Üremenin en hızlı olduğu sıcaklık

Optimum sıcaklıktan her iki yöne doğru uzaklaşıldıkça virülans faktörlerinde azalma gözlenmektedir.

Psikrofil Bakteriler -10…+20ºC En uygun üreme sıcaklıkları 15-20 ºC Toprak, su deniz ve göllerde yaşayan bazı mikroorganizmalar, balık ve soğukkanlı hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmalar bu gruba girer.

Mezofil Bakteriler Klinik önemi olan mikroorganizmalar bu gruptadır!!! 10-45 ⁰C En uygun üreme sıcaklıkları 35-42 ⁰C

Termofil Bakteriler 50-70 ⁰C Özel enzimleri sayesinde yüksek sıcaklıklarda denatüre olmadan yaşayabilirler. Gübrede, sıcak su kaynaklarında bulunurlar

Üremeyi etkileyen çevresel faktörler Fiziksel faktörler ısı, ozmotik basınç, hidrostatik basınç Kimyasal faktörler oksijen, hidrojen iyon yoğunluğu, redoks potansiyeli Mekanik faktörler basınç uygulama, çalkalama

Osmotik basınç Mikroorganizmalar hücre içi ozmotik basıncı ve iyon yoğunluğunu dengede tutmak zorundadırlar Bu özellikle enzim aktivitesi için gereklidir Gram pozitif bakterilerin ozmotik basıncı genellikle 15-20 atmosfer, Gram negatiflerinki ise 5-10 atmosferdir.

Mikroorganizmaların en iyi üreyebildikleri ozmotik basınç kendi basınçlarına yakın değerlerdir Hipotonik ortamda bakteri hücresine sıvı girer ve bakteri patlar Hipertonik ortamda ise hücre sıvı kaybeder, hücre zarı hücre duvarından ayrılır ve ortada toplanarak büzülür

Ozmofilik mikroorganizma Normal ozmotik basınç değerleri içinde yaşayabilen mikroorganizma Halofilik mikroorganizma Yüksek tuz, şeker yoğunluğuna gereksinim duyan mikroorganizma

Hidrostatik Basınç Bakteriler sert hücre duvarlarıyla hidrostatik basınca direnç gösterirler Yüksek hidrostatik basınç altında proteinler denatüre olur Deniz diplerinde yaşayabilen mikroorganizmalar yüksek basınca uyum sağlamışlardır (barofilik)

Üremeyi etkileyen çevresel faktörler Fiziksel faktörler ısı, ozmotik basınç, hidrostatik basınç Kimyasal faktörler oksijen, hidrojen iyon yoğunluğu, redoks potansiyeli Mekanik faktörler basınç uygulama, çalkalama

Oksijen Bakterilerin serbest oksijeni kullanma özellikleri farklılık gösterir Üreyebilmeleri için oksijene duydukları gereksinime göre dört grup bakteri mevcuttur.

Oksijen gereksinimine göre; Zorunlu areop Fakültatif anaerop/aerop Mikroaerofil Anaerop

Anaerop = Oksijensiz ortamda üreyen demek midir??

Anaerop Oksijen varlığında üreme inhibe olan demektir!!

Aerop bakteriler Beslenip üreyebilmeleri için ortamda mutlaka oksijen bulunmalıdır Gereksinim duydukları oksijen yoğunluğu, havadaki oksijen yoğunluğudur Bacillus anthracis Mycobacterium tuberculosis

Zorunlu aerop bakteriler katalaz ve süperoksit dizmutaz enzimleri ile metabolizma sonrası oluşan hidrojen peroksit ve süperoksit iyonlarını metabolize eder. Hücrenin özellikle enzimlerine, dış zar proteinlerine toksik

Mikroaerofil bakteriler %1-4 gibi düşük oksijen yoğunluğunda veya %5-10 CO2 li ortamlarda üreyebilirler Hidrojen peroksit ve süperoksidi parçalayan enzimleri vardır çok fazla toksik ürün oluştuğunda yetersiz kalabilir ve üreme inhibe olur

Fakültatif Anaerop veya Fakültatif Aerop Bakteriler Hem oksijenli hem de oksijensiz ortamda üreyebilen bakterilerdir Oksijen varlığında enerji elde etmek için aerobik solunum, yokluğunda ise fermentasyon veya anaerobik solunum mekanizmalarını kullanırlar Daha fazla enerji sağlayan oksijenli ortamda daha iyi ürerler Katalaz ve süperoksit dizmutaz enzimleri vardır

Anaerop bakteriler Solunumlarını tamamen oksijensiz ortamda yapabilirler; oksijen varlığında üreyemezler Mutlak (zorunlu) anaerop bakteriler oksijenli ortamda canlılıklarını en fazla 10 dakika koruyabilirler

Hidrojen peroksit ve süperoksidi parçalayacak enzimleri yoktur Bazılarında katalaz enzimleri yoktur fakat peroksidaz enzimleriyle hidrojen peroksidi parçalayarak oksijenli ortamda 6-7 saat canlılıklarını koruyabilirler aerotoleran

Üremeyi etkileyen çevresel faktörler Fiziksel faktörler ısı, ozmotik basınç, hidrostatik basınç Kimyasal faktörler oksijen, hidrojen iyon yoğunluğu, redoks potansiyeli Mekanik faktörler basınç uygulama, çalkalama

Hidrojen İyonu Yoğunluğu (pH) Her türün iyi üreyebildiği pH değeri farklıdır Çoğu mikroorganizma 6.0-8.0 pH değerinde iyi ürer  (nötrofiller) Bazıları 3.0’a kadar düşen asit pH larda ürer  (asidofiller) Bazıları 10.5’e varan alkali pH larda ürer  (alkalofiller)

Bakteriler genellikle 4-9 arası, optimum 7.2-7.5 pH değerinde ürer Küf ve maya mantarları asidik ortamı (pH 4-6) tercih eder Vibrio cholera ve Mycoplasma pneumoniae alkali ortamda üreyebilirler

Üremeyi etkileyen çevresel faktörler Fiziksel faktörler ısı, ozmotik basınç, hidrostatik basınç Kimyasal faktörler oksijen, hidrojen iyon yoğunluğu, redoks potansiyeli Mekanik faktörler basınç uygulama, çalkalama

Oksidasyon-Redüksiyon Potansiyeli Oksidan maddelerin elektron verebilme özellikleri nedeniyle elektriksel potansiyelleri yüksek, redüktan maddelerin ise düşüktür Besiyerlerindeki oksidasyon-redüksiyon potansiyeli (redoks potansiyeli) “Eh” simgesiyle gösterilir ve elektron verici veya alıcı gücünü gösterir

Besiyerlerinin Eh değeri genellikle +0.2-+0.4 mV tur. Zorunlu anaerop bakteriler Eh değeri düşük ortamlarda üreyebilirler Anaerop besiyerlerinin içeriğinde redüktan maddeler bulunur

MİKROORGANİZMALARIN ÜRETİLME ORTAMLARI

Mikroorganizmaların Üretilme Ortamları Mikroorganizmalar uygun çevre şartları sağlanarak in vivo (canlı) veya in vitro (organizma dışı, cansız) ortamlarda üretilirler

1. Canlı ortamlar Deney hayvanları: Kobay, fare, sıçan, tavşanlar,hamster, kümes hayvanları ve maymun kullanılabilir. Döletli yumurta da canlı ortam olarak kullanılabilir. Özellikle bazı virüsler ve riketsiyaların üretilmesinde kullanılmaktadır.

Hücre kültürleri Canlı dokulardan alınan hücrelerin in vitro koşullarda yaşama ve üremeleri sağlanarak hücre içi mikroorganizmaların üreyebileceği ortam hazırlanır Özellikle viral enfeksiyonların tanısında, aşıların hazırlanmasında hücre kültürleri kullanılır Bakteriyolojide Chlamydia’ların ve Rickettsia’ların üretilmesinde kullanılır

2. Cansız ortamlar : Mantar, bakteri, mikoplazma gibi mikroorganizmaların invitro olarak üretilebildikleri cansız ortamlara besiyeri adı verilir. Besiyerinde hidrojen alıcı ve verici maddeler, karbon kaynağı, azot kaynağı, mineraller ve gelişme faktörleri bulunmaktadır. Kıvamlarına göre sıvı besiyeri ve katı besiyeri olarak hazırlanırlar.

Besiyerleri

Mikroorganizmaların üretilmesi, Diğer mikroorganizmalardan ayırt edilmesi, Koloni yapısının ve biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi için hazırlanan in vitro besleyici ortamlara “besiyeri” denir.

Besiyeri bileşiminde bulunan maddeler Su Et ve et yerine kullanılan maddeler Peptonlar Agar Kan ve serum Safra veya safra tuzları Na, K, Cl, Mg, Fe, Zn, Mn, Cu besiyerlerinde değişen oranlarda bulunurlar

Besiyerinin içeriğinde bulunan aminoasitler, protein, pepton ortam pH’sını düzenleyici rol oynarlar Aminogrup ve karboksil grupları, ortam pH’sına göre iyonize olarak pH dengesinin korunmasına katkıda bulunurlar

Mikrobiyal metabolizma sonucu oluşan pH değişiklikleri çeşitli belirleyicilerle görünür hale getirilir Fenol kırmızısı, bromkrezol moru, fuksin, metil kırmızısı bu amaçla kullanılan indikatörlerdir

Besiyeri çeşitleri A- Kimyasal yapılarına göre Kimyasal yapıları kesinlikle bilinen sentetik besiyerleri Kompleks veya sentetik olmayan besiyerleri B- Kullanım amaçlarına göre Genel üretim besiyerleri Özel besiyerleri Taşıma besiyerleri Saklama besiyerleri C- Fiziksel yapılarına göre Katı besiyerleri Yarı katı besiyerleri Sıvı besiyerleri

KİMYASAL YAPILARINA GÖRE BESİYERLERİ Kimyasal yapıları kesinlikle bilinen sentetik besiyerleri: Saf kimyasal maddelerden hazırlanırlar Eritici olarak saf su ya da iyonsuzlaştırılmış su kullanılır Özellikle mikroorganizmaların metabolizmalarını incelemek ve biyolojik ürünlerini saf olarak elde etmek gibi amaçlarla kullanılır

b) Kompleks veya sentetik olmayan besiyerleri: Buyyon, et özütü kullanılarak hazırlanan sıvı bir besiyeridir Et özütünün miktarı bellidir ama et özütünde bulunan aminoasit ve tuzların miktarı tam olarak bilinmez

Kullanım amaçlarına göre Genel üretim besiyerleri: -Temel besiyerleri -Zenginleştirici besiyerleri Özel besiyerleri: -Özgül besiyerleri -Seçici besiyerleri -Ayıraçlı besiyerleri -Ayırt edici besiyerleri Saklama besiyerleri Transport besiyerleri

Genel üretim besiyerleri: Mikroorganizmaların çoğunluğunun üretilebildiği besiyerleridir. Çoğunlukla et özütü, pepton temel alınarak sıvı ve katı biçiminde hazırlanır a- Temel (Bazal) besiyerleri ya da basit besiyerleri Çok sayıda bakteri türünün üremesini sağlayacak yeterlilikte pepton, tuz, et suyu, ve benzeri besin maddesi içeren besiyerleridir

b- Zenginleştirilmiş besiyerleri: Temel besiyerlerine; kan, serum, haben sıvısı, glikoz , safra, yumurta eklenmesi ile elde edilir Basit besiyerlerinde üretilemeyen bazı mikroorganizmalar bu besiyerlerinde üretilebilirler Kanlı agar (koyun kanı temel besiyerlerine % 5 oranında kan ilave edilerek zenginleştirilmiş besiyeridir)

2) Özel besiyerleri: Üremede güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmesi, tanısı, saf kültürlerinin elde edilmesi, etkilerinin incelenmesi için hazırlanan besiyerleridir

a- Özgül besiyerleri: Yalnız bir çeşit ya da sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi için hazırlanır

b- Seçici ya da seçerek üretici besiyerleri: Birden fazla mikroorganizma türü içeren klinik örneklerden, bazılarının üremelerini önleyici maddeler içermek suretiyle diğer bazı mikroorganizmaları karışık ortamdan seçerek üreten besiyerleridir. Eozin metilen blue (EMB) agarda kristal viyole boyası ve safra tuzu gram (+) bakterileri baskılar, gram negative çomaklar ürer

Örnek: c-Ayırt edici (Ayırtıcı) besiyerleri: İçerdikleri ayraçlar(indikatörler) aracılığı ile benzer bakterilerin ayrı görünümde koloniler oluşturmalarını sağlayarak, karışık bakterileri birbirinden ayırt etmeye yarayan besiyerleridir Örnek: Bakterileri hemoliz özelliklerine göre ayırt eden kanlı agar,

d-Ayraçlı besiyerleri: Mikroorganizmaların metabolizmalarına bağlı biyokimyasal özelliklerini incelemek amacıyla besiyerlerine çeşitli maddeler ve onların reaksiyonlarını gösteren ayıraçlar eklenerek hazırlanan besiyerleridir Örneğin: Sitrat, TSİ, Üre, MIL besiyerleri gibi

3) Taşıma besiyerleri: Mikrobiyoloji laboratuvarında kültürü yapılıncaya kadar klinik örnekler taşıma besiyerlerinde saklanır Cary-Blair taşıma besiyeri

4) Saklama besiyerleri: İzole edilen mikroorganizmaların uzun süre saklanabilmesi için saklama besiyerleri kullanılır Skim milk sıvı besiyeri

Fiziki yapılarına göre besiyerleri 1- Katı besiyerleri: Bakterilerin üretilmesi, türlerinin ayırt edilmesi, saf kültür elde etme olanaklarını sağlar Bir bakterinin katı besiyerinde çoğalarak oluşturduğu topluluğa koloni adı verilir Kolonilerin özellikleri bakteri türlerinin tanımlanmasında önemli bilgiler verir Katı besiyeri elde etmek için % 1-3 oranında agar kullanılır

Agar Deniz yosunundan elde edilen agar mikroorganizmalar tarafından besin maddesi olarak kullanılmayan ve reaksiyona girmeyen inert bir maddedir.

Yarı katı besiyerleri: Düşük agar yoğunluğu ( %0,05-0,5 ) içerir Mikroorganizmaların hareket özelliklerinin araştırılması gibi amaçlarla kullanılır MİL besiyeri

3-Sıvı besiyerleri: Mikroorganizmalar kaynakların tümünden faydalandıkları için daha yoğun ürerler BHI (Brain Heart Infusion) besiyeri, kan kültürleri ve metabolik testler için temel besiyeridir Sıvı besiyerlerinde üreme, tortu, zar oluşması, bulanıklık, renk değişimi şeklinde gözlenir

BAKTERİ KOLONİ ŞEKİLLERİ Koloni Morfolojisi: Eğer bir bakteri, uygun bir katı besiyerinde ve uygun koşullarda (ısı, süre, rutubet, oksijen, vs.) üretilirse, kısa bir zaman içinde gözle görülebilen yığın, küme (koloni) meydana getirir

S (smooth) koloni tipi Hastalık vakalarından yeni izole edilen mikroorganizmalar, katı besi yerlerinde kenarları muntazam, üstü düzgün, kabarık, parlak ve homojen görünümde koloniler oluşturur

R (rough) Koloni tipi Eski kültürlerde görülür Uzun süre pasajlara maruz kalmış suşlar tarafından meydana getirilirler Katı besiyerlerinde kenarları ve üzeri pürüzlü, granüler yapıda koloniler halinde görülürler

M (mukoid) Koloni tipi Kapsül veya mukoid salgı oluşturan mikroorganizmalarda (Klebsiella pneumoniae) bu tarz koloni formasyonuna rastlanır Bu kolonilere öze değdirilince iplik gibi uzama görülür

Mikroorganizmaların üreme şekilleri Mikrobiyal büyüme sayısal artıştır. Mikroorganizmanın bulunduğu ortamdaki besin ve ortam şartları elverişliyse ilk önce hacimsel büyüme olur. Daha sonra hacim olarak büyüyen mikroorganizma hücre bölünmesi geçirerek sayısal artış olur

Tek bir hücrenin yaklaşık olarak eşit büyüklükte iki kardeş hücreye bölünmesi ile sonuçlanan çoğalma şekline binari fizyon denir. Bazı mikroorganizmalar tomurcuklanma vasıtasıyla çoğalır. Önce hücrenin bir ucunda küçük bir çıkıntı belirir. Daha sonra bu tomurcuk genişler ve hücresel bileşenleri içeren yeni bir hücre oluşur. Daha sonra da bu hücre ana hücreden ayrılır.

Filamentöz olarak üreyen bazı mikroorganizmalar ise iilamentlerin fragmentasyonu yoluyla çoğalırlar. Sonuçta oluşan küçük çomak veya kok şeklindeki yeni hücrelerin her biri yeniden çoğalma özelliğine sahip olur.

Bakteriyel üreme eğrisi Bakterilerin üreme döngüsü dört safhaya sahiptir. Lag safhası Log (logaritmik) safhası Stasyoner safha Ölüm safhası

Küçük bir miktar bakteri sıvı besiyerine ekildiğinde ve sık aralıklarla bakteri sayısı belirlendiğinde standart bir üreme eğrisi elde edilir . İlki lag safhasıdır. Yoğun bir metabolik aktivite olmasına rağmen hücre bölünmesi yoktur. Birkaç dakikayla birkaç saat arasında sürebilir.

 Log (logaritmik) safhası hızlı bir şekilde bölünmelerin gerçekleştiği zamandır. Hücre artışı bu safhadadır. Stasyoner safha besinlerin azaldığı, toksik maddelerin arttığı safha olup, üreme yavaşlar. Canlı hücre ile ölü hücre sayıları arasında bir denge vardır.

Üremenin daimi olması arzu edildiğinde kemostat adı verilen cihazla ortama taze besiyeri ilave edilip, toksik maddeler uzaklaştırılır. Bu yöntem biyoteknolojik bazı işlemlerde kullanılmaktadır. Son safha ölüm safhasıdır. Canlı hücre sayısı hızla düşer.

MİKROORGANİZMALARIN METABOLİZMASI Organizma tarafından taşman reaksiyonların tümüdür. Anabolizma enerji kullanarak basit moleküllerden kompleks moleküllerin sentezidir. Katabolizma kompleks moleküllerin parçalanması ve enerji salınmasıdır.

Virüsler dışındaki mikroorganizmalar tüm canlılarda olduğu gibi metabolizmalarını enzimleri ile sağlarlar. Enzimler biyolojik kimyasal reaksiyonları katalize eden, çok az miktarlarda etkinlik gösteren ve reaksiyon sonunda aynı yapı ve miktarda ortamda kalan organik maddelerdir. Protein yapısındadırlar. Her enzim özgül bir kimyasal reaksiyonu katalize eder ve yalnız bir madde (substrat) üzerine etkilidirler.

Enzimlerin protein kısmına apoenzim, apo ve koenzimden oluşan toplam enzime holoenzim denir. Bakteri, mantar gibi mikroorganizmalarda İki türlü enzim vardır. Ekzoenzimler ve endoenzimler. Ekzoenzimler üreme ortamında bulunan kompleks bileşikleri hidroliz ve ayrışma ile daha basit ve çözünebilen maddelere parçalarlar.

Endoenzimler hücre içi metabolizmasını yürütürler. Enfeksiyon yapan mikroorganizmalar enerjiyi hazır yapılmış organik bileşiklerin parçalanmasından temin eden mikroorganizmalardır.

Bu mikroorganizmalar glikolizis (glukozun piruvik aside oksidasyonıı), fermentasyon (piruvik asidin etil alkol, laktik asit veya diğer organik bileşiklere dönüşümü), ve aerobik solunum (piruvik asidin C02 ve suya oksi- dasyonu) gibi yöntemlerle enerji sağlarlar.