MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 10. Ders

PROTEİN SAFLAŞTIRMA YAKLAŞIMLARI Proteinler dışındaki tüm moleküller karışımdan uzaklaştırılır. (Örneğin, ham özüte streptomisin sülfat eklenerek DNA çöktürülür. Daha sonra da santrifüjleme ile uzaklaştırılır.) Proteinler çöktürülür. (TCA-NH4 sülfat-organik çözücüler kullanılarak çöktürülen proteinler santrifüjlemeyle ayrılır.)

PROTEİNLER çoğunlukla Büyüklük ve şekil, Toplam yük, Yüzeyde bulunan hidrofobik gruplar, Kullanılan durağan faza bağlanma kapasitesi gibi özelliklerinin farklı olmasına dayanarak KROMATOGRAFİK YÖNTEMLERLE ayrılıp saflaştırılabilir.

KROMATOGRAFİ Yunanca chroma ("color") ve graphein ("to write") kelimelerinden türetilmiş, kelime anlamı "renkli yazmak" olan kromatografi terimi, ilk kez Rus Botanikçi Mikhail Tsweet tarafından 1906’da kullanılmıştır. Kromatografi, bir karışımdaki çeşitli maddeleri, maddelerin özelliklerindeki farklılıklara dayalı olarak ayıran analitik tekniktir.

KROMATOGRAFİ Katı veya sıvı bir durağan (ʺstationaryʺ) fazın yüzeyine veya içine uygulanmış bir karışımdaki moleküllerin, sıvı veya gaz halindeki bir hareketli (ʺmobileʺ) faz aracılığıyla hareket ederken birbirinden ayrılmaları temeline dayanır.

Bu ayrılmaya yol açan etkenler: Moleküllerin Tutunma (ʺadsorptionʺ) özelliği Dağılma (ʺpartitionʺ) özelliği İyon değişimi özelliği İlgi (afinite) özelliği Ağırlıklarındaki farklılıklar

Kolon kromatografisi, kolon dolgu maddesi (durağan faz, matris) ile doldurulmuş alttan musluklu basit bir cam boruda gerçekleştirilebilir. Protein karışımı uygun bir elüsyon çözeltisiyle kolonda sürüklenir. Durağan fazla etkileşim (adsorbsiyon) ve kolondan ayrılma (dezorbsiyon) özelliği bakımından farklı proteinler belli zaman aralıklarında veya hacimlerde toplanarak farklı fraksiyonlara ayrılır.

Elüsyon tamponu (Yüksek-tuz) Elüsyon tamponu (Düşük-tuz) Protein konsantrasyonu Düşük-tuz Yüksek-tuz Örnek karışımı Kromatografi kolonu Fraksiyon sayısı veya akış hacmi Sırayla toplanan fraksiyonlar

Absorpsiyon bir akışkanın başka bir sıvı veya katı cisim (emici madde) tarafından soğurulması işlemidir.  Adsorpsiyon ise bir maddedeki (gaz veya sıvı da olabilir) atom, iyon veya moleküllerin emici maddenin yüzeyine yapışması, tutunması işlemidir.

Kolondan çıkan fraksiyonların otomatik olarak belli hacimlerde toplandığı ve absorbsiyonlarının ölçüldüğü sistemler de vardır. Böyle bir sistemde elüsyon çözeltisi rezervuarla kolona gönderilebileceği gibi, peristaltik pompa ile sürekli de beslenebilir. Kolondan geçen farklı fraksiyonlar fraksiyon kollektörü tarafından ayrı kaplarda toplanır ve absorbsiyonları belirlenebilir ya da enzim aktivitesi ölçülerek izlenebilir.

Kolon kromatografisinin farklı temellere dayanan çeşitli tipleri vardır: Elektrik yükü veya hidrofobik grupların dağılımı gibi bazı yapısal özelliklere dayanan: iyon değişimi kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi, metal-kelat kromatografisi Protein ve dolgu maddesi arasındaki yapısal ve işlevsel uyum ve etkileşim temeline dayanan: afinite kromatografisi (lektin afinite kromatografisi, immünopürifikasyon) Molekül boyutuna dayanan: jel geçirgenlik kromatografisi (jel filtrasyonu veya moleküler elek tekniği)

İYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFİSİ Proteinleri oluşturan amino asitler farklı yan zincirlere sahiptir. Aspartik ve glutamik asit pH 7.0 değerinde negatif yüklü asidik gruplar taşırken; lizin, arjinin ve histidin pozitif yüklü bazik gruplar içerir.

aspartik asit glutamik asit arginin histidin lizin

Her protein, bu beş amino asiti farklı oranlarda içerdiğinden, moleküllerin yükleri de farklı (pozitif veya negatif) olur. Proteinin net yükü yapısındaki bu amino asitlerin miktarına ve protein çözeltisinin pH’sına bağlı olarak değişir. Proteinler toplam yüklerinin 0 olduğu pH değerinin (izoelektirik nokta, pI) üzerindeki pH değerlerinde negatif, altındaki pH değerlerinde ise pozitif elektrik yüküne sahiptir.

İyon değişimi kromatografisinin temelini, proteinin yüklü grupları ile katı matriks arasındaki elektrostatik etkileşimler oluşturmaktadır.

+ yüklü iyon değiştirici matrisler ANYON DEĞİŞTİRİCİLER, - yüklü iyon değiştirici matrisler KATYON DEĞİŞTİRİCİLER + + + - - -

Proteinler, ya kullanılan tampon çözeltisinin pH’sının ya da tuz konsantrasyonunun değiştirilmesi ile kolondan ayrılırlar.

NaCl a) b) Bir anyon değiştiricide negatif yüklü proteinlerin ayrılması: Kolon ayırımı yapılacak proteinle zıt yükte olan dolgu maddesi (matriks) ile doldurulur. (a) Pozitif ve negatif yüklü proteinlerden oluşan karışım kolona yüklenir. Zıt yüke sahip proteinler kolon dolgu maddesine adsorbe olurken, matriksle aynı yükte olanlar kolonu terk ederler. (b) Kolon içinde tutulmuş proteinlerin ayrılması için, kolon NaCl çözeltisi ile yıkanır. Tuz iyonları (karşıt iyonlar, "counter ions") matriks yüzeyindeki yüklü gruplarla rekabet ederek ilgili proteinin kolondan ayrılmasına yol açarlar. Tuz konsantrasyonunun kademeli olarak artırılması ile, daha fazla yüke sahip proteinlerin de kolonu terk etmesi sağlanır.

GENEL KATYON DEĞİŞTİRİCİLER’de yer alan - yüklü gruplar: Sülfo SO3- Karboksimetil CH2COO- GENEL ANYON DEĞİŞTİRİCİLER’de yer alan + yüklü gruplar: Aminoetil C2H4N+H3 Dietilaminoetil C2H4NH+(C2H5)2 Trietilaminoetil C2H4N+(C2H5)3

Anyon değiştirici mi, katyon değiştirici mi seçmeliyiz? Ayırmak istediğimiz proteinin pH stabilitesi önem taşır. pI değerinin üzerindeki pH değerlerinde mi (yani – yüklü olduğu durumda) daha kararlı, yoksa pI değerinin altındaki pH değerlerinde mi (yani + yüklü olduğu durumda) daha kararlı? Hangisinde daha kararlı ve dayanıklı ise onu seçmeliyiz.

pH 4-9’un dışındaki pH değerlerinde stabilitesini koruyan protein sayısı azdır. Onun için adsorban sayısı sınırlıdır. En çok kullanılan adsorbanlar selüloz, agaroz ve dekstranın karboksimetil (CM) ve dietilaminoetil (DEAE) türevleridir.

Anyon değiştirici matriksler Anyon değiştirme kapasitesi Tablo 2. Proteinlerin ayrılmasında kullanılan iyon değişimi matriksleria,b. Anyon değiştirici matriksler Anyon değiştirme kapasitesi Katyon değiştirici matriksler Katyon değiştirme kapasitesi Polistiren AG 1 Kuvvetli AG 50W AG 2 Bio-Rex 70 Zayıf Bio-Rex 5 Orta AG 3-X4A Bio-Rex MSZ 1-X8 Sellüloz Aminoetil sellüloz CM-sellüloz DEAE-sellüloz Benzil DEAE-sellüloz ECTEOLA-sellüloz PEI-sellüloz QAE-sellüloz TEAE-sellüloz DEAE-sepasel (sephacel)

Dekstran esaslı matrikslerdir. DEAE-sefadeks (A-25 veya A-50) Zayıf Anyon değiştirici matriksler Anyon değiştirme kapasitesi Katyon değiştirici matriksler Katyon değiştirme kapasitesi Sefadeks (sephadex) Dekstran esaslı matrikslerdir. DEAE-sefadeks (A-25 veya A-50) Zayıf CM-sefadeks (C-25 veya C-50) QAE-sefadeks Kuvvetli SP-sefadeks Sefaroz (sepharose) Agaroz esaslı matrikslerdir. DEAE-sefaroz CL-6B CM-sefaroz (hızlı akışlı) Q sefaroz S sefaroz aKısaltmalar: CM, karboksimetil; DEAE, dietilaminoetil; ECTEOLA, epiklorohidrin trietanolamin; PEI, polietilenimin; Q, kuaterner amin; QAE, dietil-2-hidroksipropil-aminoetil; S, sülfonat; SP, sülfopropil; TEAE, trietilaminoetil. bSephadex, Sephacel ve Sepharose Pharmacia tarafından üretilmektedir. Sellülozun çeşitli türevleri Whatman, Sigma ve diğer bazı üretici firmalardan da sağlanabilir. AG ve Bio-Rex Bio-Rad firması tarafından üretilen polistiren esaslı matrikslerdir. Başka firmalar da benzer maddeler üretmektedirler (örneğin, Dow ("Dovex"), Rohm ve Haas ("Amberlite") gibi.

EVET Por özelliği önemli mi? Çünkü bağlama kapasitesi etkilenir MW10.000-100.000 proteinler için DEAE-Sephacel veya –Sepharose; Daha büyük proteinler için Sephadex A-25 veya C-25 kullanılır.

İyon değişimi kromatografisinde hareketli faz daima tamponlanır İyon değişimi kromatografisinde hareketli faz daima tamponlanır. Tamponlanmayan çözeltiler, proteinler yerine, anyon değiştiricilerin yüzeyinde OH ve katyon değiştiricilerin yüzeyinde H+ iyonlarının lokalize olmasına (Donnan etkisi) yol açar. Bu da olumsuz iyon değişimlerine ve protein denatürasyonuna neden olur.

HİDROFOBİK ETKİLEŞİM KROMATOGRAFİSİ (HIC) Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu hidrofobik etkileşimlerden yararlanılır. Bu etkileşimin derecesine göre farklı proteinler farklı zamanlarda kolonu terk ederler.

Sabit fazdaki hidrofobik ligantlara örnekler Örnek, yüksek derişimde tuz içeren (not: denatürasyona yol açmayacak türden olmalı, örneğin amonyum sülfat) bir tamponda çözündürülerek kolona yüklenir. Proteinler tampondaki tuz konsantrasyonu azaltılarak kolondan ayrılır.

hidrofobik bölge hidrofilik bölgeler Düşük tuz Yüksek tuz konsantrasyonlarında hidrofobik etkileşimler meydana gelir. Hidrofobik bölgelerin agregat oluşturma eğilimi fazladır. Düşük tuz Tuz konsantrasyonundaki artış hidrofobik etkileşimlerin güçlenmesine (ortaya çıkmasına) neden olur

METAL-KELAT KROMATOGRAFİSİ Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu metal komplekslerinden yararlanılır.

Örneğin, İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi (IMAC) Bu teknik, Psödoafinite (Yalancı İlgi) teknikleri olarak da adlandırılan bir gup teknik içinde ele alınmaktadır. Bu grubun diğer örnekleri ise: Tiyofilik Adsorpsiyon Kromatografisi (TAC)dir. Boya Ligand Kromatografisidir.

AFİNİTE (İLGİ) KROMATOGRAFİSİ Bu yöntem biyolojik etkileşim temeline dayanır ve bu nedenle son derece özgül ayırımların yapılabilmesini sağlar.

A (makromolekül) + B (ligand) A:B biyolojik yanıt Bu teknikte proteinler ligand adı verilen maddelere geri dönüşümlü olarak bağlanırlar. Ligandlar, aktif taşıyıcıya kovalent olarak bağlanan ve saflaştırılacak makromoleküle özel ve seçimli afinite gösteren küçük moleküllerdir. Örneğin, antikor, bir enzimin inhibitörü, kofaktörü ve özel hallerde substratı olabilir. Birçok ligand önce inert destek metaryaline bağlanır ve kromatografi kolonuna paketlenir. Bu sistemde sadece istenilen protein kolondaki liganda bağlanır. Diğer proteinler bağlanmadan ayrılır. Daha sonra kolonun uygun bir tampon ile yıkanması sonucunda istenmeyen proteinler tamamen uzaklaştırılır. Bir sonraki adımda ise tamponun uygun bir şekilde değiştirilmesi ile liganda bağlanan protein kolondan geri kazanılır.

http://www. bio. davidson http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/01grnoland/affinchr.html

Yöntemin, ligand ile ayrılacak protein arasındaki etkileşimin tipine göre farklı uygulamaları vardır:

İMMÜNOPÜRİFİKASYON İmmobilize protein A veya İmmobilize protein G veya İmmobilize protein L içeren kolonda ANTİKOR saflaştırması yapılabilir.

Adım:İmmünoadsorban hazırlanır Adım:İmmünoadsorban hazırlanır. Antijenler (mavi) katı matrise (pembe yuvarlaklar, selüloz, agaroz vb.) kovalent olarak bağlanır (İMMOBİLİZASYON). 2. Adım: Protein karışımı (ör. Serum) kolondan geçirilir. Antijene afinitesi olan antikorlar (kırmızı) antijene kovalent olmayan etkileşimlerle bağlanır ve kolonu daha geç terkeder. 3. Adım: Antijene tutunmuş antikoru kolondan ayırmak için elüsyon sıvısı (yüksek derişimde tuz içeren ve/veya düşük pH’da bir tampon) geçirilir. 4. Adım: Kolondan toplanan örneğin (elüent) dializ edilerek tuzlardan arındırılması gerekir.

JEL GEÇİRGENLİK KROMATOGRAFİSİ (JEL FİLTRASYONU, MOLEKÜLER ELEK TEKNİĞİ) Bu yöntemde proteinler molekül büyüklüklerinin farklı olması esasına göre ayrılırlar.

Kolon dolgu maddesi küresel yapılı ve belirli boyutta gözeneklere sahip inert jel parçacıklarından oluşmuştur. Farklı boyutta molekülleri içeren bir çözelti kolondan geçirildiğinde, büyük moleküller gözenekli taneciklerin aralarındaki boşluklardan geçerek kolonda hızla ilerlerler; gözenek boyutlarından küçük moleküller ise gözenek içerisine diffüzlenir ve molekül küçüldükçe artan bir alıkonma süresi ile kolondan çıkarlar.

Jel geçirgenlik kromatografisinde kullanılabilecek matris materyallerinden örnekler. Ticari adı Matriks tipi Üretici pH aralığı Sıcaklık stabilitesi (oC) Sefadeks Dekstran Pharmacia 2 120 Sefaroz Agaroz 4-9 40 Sefaroz CL Çapraz bağlı agaroz 3-14 Sefasiril Dekstran/bis 2-11 Ultrogel A IBF Biogel A Bio-Rad Biogel P Poliakrilamid 2-10

YÜKSEK BASINÇLI (PERFORMANSLI) SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC)

Amino asitler, karbohidratlar, lipidler, nükleik asitler, proteinler, pigmentler, streoidler ve diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrılmasında ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren bu teknik temelde otomatik hale getirilmiş modern bir sıvı kromatografi tekniğidir.

HPLC’nin klasik sıvı kromatografilerine göre önemli üstünlükleri vardır: Çözünme (ayrıştırma) ve analiz hızı klasik yöntemlerden çok yüksektir. Kolonları yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin sürekli kullanılabilir. Ayırma gücünü etkileyen değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebildiğinden tekrarlanabilirliği son derece yüksektir. Aletin çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla otomatikleştirilir. Büyük boyuttaki (preparatif) ayırım süreçlerine uygulanabilir.

GAZ KROMATOGRAFİSİ (GC) Kromatografik bir sistemde hareketli faz gaz, durağan faz da inert katı partiküller üzerini kaplayan bir sıvı olduğunda bu tekniğe gaz-sıvı kromatografisi ya da kısaca gaz kromatografisi (GC) denir.

Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik veya camdan bir tüp (kolon) içine doldurulur. İnert bir gaz (genelde helyum, azot veya argon) (hareketli faz) yüksek basınç altında kolondan geçirilir.

Çalışılan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi sağlanır. Örnekteki bileşenler hareketli faz ile katı destek üzerindeki durağan sıvı faz arasında dağılırlar. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin kolondaki hareketleri daha yavaş olur.

Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son derece iyi ayrılmasını sağlayan; basit, çok yönlü, hızlı bir tekniktir ve çok duyarlıdır. Bununla birlikte, bu kromatografideki en önemli kısıtlama örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık derecelerine (200-250oC) dayanıklı olması gerekliliğidir. Bu nedenle, gaz kromatografisi ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen moleküllerin ayırımında kullanılabilir.

Models : Agilent 7890A, 6890N, Thermo Trace GC Ultra Detector : Flame Ionisation Detector (FID) Columns available : DB 5, DB 35, DB 225, HP Chiral Analysis: Separation of volatile metabolites, pesticides, chiral compounds

GAZ KROMATOGRAFİSİ (GC) - KÜTLE SPEKTROMETRİSİ (MS)

http://summons.mit.edu/biomarkers/experimental-methods-to-extract-biomarkers/gas-chromatography-mass-spectrometry/

HPLC-KÜTLE SPEKTROMETRİSİ (MS)

Sonuç : Tüm proteinler için geçerli bir saflaştırma stratejisi yoktur !!! Hedef proteinin özelliklerine göre araştırmacı en uygun yöntemi uygulamalıdır.

F.Zihnioğlu (http://protein.ege.edu.tr/Konular/PROTEINsafla%FE.pdf)