ENTAMOEBA HİSTOLİTİCA Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA Prof.Dr.Bülent BAYSAL

AMİPLER İnsan intestinal sisteminin paraziti olan amipler 4 türe ayrılır: Entamoeba Endolimax Iodamoeba Blastocystis Amipler yalancı ayak (psödopot) diye adlandırılan stoplazmik çıkıntılar ile hareket eden organizmalardır Trofozoid ve kist olmak üzere 2 formu bulunur Trofozoidler beslenir ve hareket eder Uygun olmayan koşullarda ve nem oranı düştüğünde , dış ortama dirençli kist şekilleri gelişir

İnsan vücudunda yerleşen amipler Entamoeba histolitica Entamoeba gingivalis Entamoeba hartmanni Entamoeba coli Endolimax nana Iodamoeba bütschlii Naegleria fowleri Acanthamoeba türler

Entamoeba histolitica Entamoeba, ilk olarak 1875’te Rusya’da dışkıda tanımlandı 1890’da da karaciğer amip absesi ve amebik kolit tabloları tanımlandı E. histolitika ise ilk olarak 1903 yılında Schaudinn tarafından tanımlanmıştır. E. histolytica ortalama 25-40 mikron büyüklüğünde trofozoit formu ile 12-15 mikron büyüklüğünde kist formu bulunan bir protozoondur. Trofozoit formunda araba tekerleği gibi kromatin içeren bir çekirdek ve bir merkezi çekirdekcik vardır

Yapısal özellikler Trofozoit Kist

Trofozoid form mikroskop altında incelendiğinde, psödopodlar çıkararak yer değiştirdiği görülür Hareketi yavaştır. Hücrenin bir tarafından parlak saydam zar şeklinde parmak gibi bir uzantı-psödopod çıkar sonra bütün stoplazma bu psödopodun içine akar. Çekirdeğin tam ortasında karyozom denilen oluşum bulunur Buradan perifere doğru uzantılar şeklinde kromatin ağı görülür. Çekirdek çevresinde bu ağ muntazam bir dağılım gösterir.

Diğer kistlerden farkları Dışkıda saprofit olarak bulunabilen Entamoeba coli'nin trofozoit şekillerinde fagosite edilmiş eritrosit bulunmaz. E. coli’ nin çekirdek yapısı düzgün değildir. Karyozom büyük ve eksantrik olup tam merkezde oturmaz. Periferal kromatin solid halka tarzındadır Kist formlarında daha fazla sayıda çekirdek (8 adet) bulunur. E. coli’nin ve E. histolitika’nın trofozoidleri bakterileri sindirir Entamoeba hartmanni'nin hem trofozoit ve hem de kistleri çok daha küçüktür (5-10 mikron) Ayrıca E. dispar denilen non patojen türler de vardır.

Boyalı preparatlarda amibik trofozoitlerin ayrımı WHO, 1994

Two very good examples of Entamoeba histolytica trophozoites.

Trikrom boyamada Entamoeba coli trofozoiti Trikrom boyamada Entamoeba coli trofozoiti. Ekzantrik duran büyük karyozom ve vakuollü stoplaması görülmekte

WHO, 1994

kist Entamoeba hartmanni kistleri

Entamoeba coli cyst and trophozoite, haematoxylin stained

Entamoeba histolytica’da epidemiyoloji E.histolytica özellikle tropikal ve subtropikal bölgelerde daha sık olmak üzere tüm dünyada yaygın olarak görülmektedir Organizmanın yaygın olduğu bölgelerde yaşayan insanların %50 ve daha yüksek orandaki kısmı infektedir İnsan en önemli rezervuardır İnfeksiyon kistlerle kontamine olmuş su ve yiyeceklerin alınmasıyla bulaşır Kistler sadece barsakta oluşabilir Kistler 55 0C lik ısıya,klora ve mide asidine dirençlidir

Seksüel geçiş te görülebilmektedir Asemptomatik E.histolitica infeksiyonu her iki cins arasında eşitken, invasiv amip infeksiyonu erkekleri daha çok etkilemektedir Dokularda veya gaita ile dışarı atılan trofozoidlerden kiste dönüşüm olmaz

KLİNİK ÖNEMİ Her yıl 500 milyon insan E.histolitica ile infekte olmakta , bunların yaklaşık 50 milyonu kolit ve karaciğer apsesi, 100 bini ise ölümle sonuçlanmaktadır E.histolitica ile infekte insanların sayısı , morbidite ve mortalite oranları arasındaki uyumsuzluk, morfolojik olarak biri hastalık oluşturan diğeri oluşturmayan 2 farklı türün varlığı ile açıklanabilir Hastalığa sebep olan E.histolitica Hastalığa sebep olmayan E.dispar E.histolitica amibik kolit ve karaciğer apsesi oluştururken, apatojen olan Entamoeba dispar hastalık yapmamaktadır

Klinik tablo İntestinal hastalık dokulara amibik trofozoidlerin penetrasyonu sonucu oluşmaktadır İnfekte bireylerin %10 u dizanteri, kolit veya nadir olarak ameboma gibi klinik semptomlara sahiptir İnkübasyon periyodu birkaç günden birkaç aya kadar değişir Adezinler, ameboporlar ve proteazlar intestinal amibiyaziste kolon mukozasının lizise uğratılmasıyla ilgilidir

Amipli dizanteri Amibik dizanterinin semptomları düşük derecede ateş , alt abdominal ağrı,kramplı ishal ve dışkıda kan mukus varlığıdır Trofozoidlerin intestinal invazyonu ile oluşan amibik kolitin klasik dar boyunlu şişe şeklindeki ülserleri, yüzeyel yerleşimli lezyonlardan başlamaktadır Amipler ülserin kenar köşelerinde saptanırken genellikle nekrotik bölgelerde bulunmamaktadır Abdominal perforasyon ve peritonit nadir görülen ama ciddi komplikasyonlardır Birçok kronik tablo amibik kolit ile oluşmaktadır Birçok klinik tablo ile karışabilmektedir

Ekstraintestinal tutulum Organizmanın hematojenoz yayılımı ile ortaya çıkmaktadır Öncesinde semptomatik infeksiyon olmadan veya olup ortaya çıkabilmektedir Karaciğer ekstraintestinal hastalık olarak en çok tutulan bölge olup akciğerler, perikart, beyin ve diğer organlar da sıklık sırasıyla tutulabilmektedir Semptomlar düşük dereceli ateş,sağ alt karın ağrısı ve kilo kaybı içerebilmektedir İntestinal semptomlu hastaların %5 i ve üstünde karaciğer apsesi gelişebilmektedir Ama karaciğer apseli hastaların %50 si ve üstü gastrointestinal hastalık hikayesine sahip değildir

LABORATUVAR TANI YÖNTEMLERİ

GAİTANIN TOPLANMASI ve SAKLANMASI Dışkı örnekleri temiz ve geniş ağızlı kaplarda toplanmalıdır 1 kez yapılan mikroskobik inceleme ile parazitin kist ve trofozoitlerine rastlama şansının ancak %33-50 olduğu, farklı zamanlarda yapılan üç dışkı incelemesi sonucunda ise bu oranın %75’e yükseldiği ifade edilmektedir Bu nedenle amebiyazisden şüphelenildiğinde ama saptanamadığında, 3 dışkı örneğinin incelenmesinin infeksiyonun tanısında %90 dan daha fazla etkili olduğu gösterilmiştir Çünkü helmint yumurtaları sürekli çıktığı halde birçok protozoon aralıklı çıkmaktadır

Amip tanısının zor olmasının sebepleri E.histolitica ile enfekte kişilerin dışkılarında her zaman kist ve trofozoitlerin bulunmaması Parazitin kistlerinin diğer amip türlerinin kistleriyle, trofozoitlerinin diğer amip türlerinin trofozoitleri ile ve lökositlerle karıştırılabilmesi Dış ortamda bekletilen dışkılardaki trofozoitlerin ½-1 saat gibi kısa sürede parçalanarak görülemez hale gelmesi bu nedenle mikroskobik incelemenin zaman geçirilmeden yapılmasının zorunlu oluşu İncelemelerde deneyimli kişilere ihtiyaç duyulması olarak sıralanabilir

Gaita örneklerinin incelenmesinde zaman önemli bir faktördür Sulu gaitalar dışkılamadan sonraki ilk 30 dakika içinde incelenmelidir Eğer gaita hemen incelenmeyecekse, PVA (polivinil alkol) veya diğer uygun fiksatifler içinde saklanmalıdır Şekilli gaitaların incelenmesi ertelenebilir, ama mutlaka alındıkları gün içinde incelenmelidir Eğer bu mümkün değilse bir sonraki güne kadar bir fiksatifin içinde veya gaita kabının kapağı iyice kapatılarak buzdolabında saklanabilir

Gaita alınmadan önce hastanın aldığı bazı maddeler barsak protozoonlarının saptanmasını zorlaştırır Bunlar: Mineral yağ Antibiyotikler Antimalaryal ilaçlar Baryum, bizmut İshal kesiciler Bunların alınmasından sonra parazitik organizmalar bir veya birkaç hafta saptanamaz ve şekilleri son derece bozuk bir halde görülebilir bunlar kullanıldıysa örnek alımı en az 5-10 gün sonra yapılmalıdır

GAİTANIN İNCELENMESİ Makroskopik inceleme Mikroskopik inceleme Direk mikroskopik inceleme Lugolle mikroskopik inceleme Boya yöntemleri Trichrome boyası Demirli hematoksilen boyası Seroloji Kültür yöntemi Antijen testi PCR ile inceleme

Makroskopik inceleme Başlangıçta sulu dışkı şeklindeki diyareye hızla kan ve mukus eşlik eder Kan ve mukus bulunan gaitalar amip trofozoitleri yönünden şüphelidir ve dikkatli incelenmelidir

Makroskopisi

Direk mikroskopik inceleme Dışkının, sigmoidoskopiden elde edilen materyalin,doku biyopsi örneklerinin ve apse aspiratlarının incelenmesi ile yapılabilmektedir Gaitada kist ve trofozoidlerin,dokularda ise trofozoidlerin görülmesi ile tanı konur Lökosit veya apatojen amipler yanlışlıkla E. histolitica trofozoidleri olarak yorumlanabilir

Direk mikroskopik inceleme için taze dışkıdan preparat hazırlanır Bir lam üzerine bir damla serum fizyolojik konur ve çubukla taze dışkı örneğinden alınan küçük bir parça ezilir Sonra lama yayılarak üzerine lamel kapatılır Mikroskopta 400 lü büyütme kullanılarak trofozoid ve kistler araştırılır

Direk mikroskopik incelemede hareketli organizmalar görülür Bunlar çok açık renkli olduğundan düşük ışık yoğunluğuyla bakılmalıdır Amip hareketleri yavaş olduğundan şüphelenilen sahaya 2 dakika bakılmalı ve böylece trofozoidin psödopot çıkardığı görülmelidir Amip trofozoidlerinin hareketlerini artırmak için lamın ısıtılması faydalıdır Bunun için yanan bir lamba kullanılabilir

Lugolle mikroskopik inceleme Lamın bir kenarına SF, diğer kenarına iyot eriyiği damlatılıp kürdan ile alınan dışkı ayrı ayrı ezilerek 2 tane ayrı lamel kapatılır Böylece mikroskopta bakılır 1/5 sulandırılmış lugol eriyiği ile hazırlanmış preparatta kistlerin iç yapıları, nükleus ve glikojen kümeleri boyalı olarak görülür Lugolle boyamada hareket görülmez

İyot trofozoidleri öldürdüğü için daha çok kistin tanısında önemlidir Kistlerin içindeki nükleuslar daha görünür hale gelir Amip kistleri iyotla boyandığında glikojen vakuolü koyu kızıl kahverengi, stoplazma ise sarımsı renk alır ve nükleuslar daha kolay görünür hale gelir

Trikrom boyama Gaita lama yayıldıktan sonra Schaudin fiksatifi veya PVA ile tespit edilip değişik basamaklarla boyama yöntemi uygulanır Boyanmış preparatlar havada kurutulduktan sonra immersiyonlu objektifte 1000x büyütmeyle incelenir Trikrom boyasıyla boyanan preparatlar uzun süre bozulmadan kalır

Değerlendirilmesi İyi boyanmış preparatta kist ve trofozoidlerin stoplazmaları morumsu mavi yeşil renkte görülür kistler trofozoidden daha mordur Entamoeba coli’ de bu renk daha çok pembedir Nukleus, eritrositler ve bakteriler kırmızı veya morumsu kırmızı boyanırlar Sindirilmeyen besinler, maya ve mantarlar genellikle yeşil boyanırlar İyi ve erken tespit edilmeyen preparatlarda kistler kırmızıya boyanırlar

Trikromda E.histolitica lehine olan görüntüler Trofozoid: Mor stoplazmada koyu mor-kırmızı 1 adet nükleus Küçük ve merkezi yerleşmiş karyozom Granüler buzlu cam gibi stoplazma Stoplazmada sindirilmiş eritrositler Kist: Mor stoplazmada koyu mor-kırmızı 2-4 adet nükleus Küçük ve merkezi yerleşmiş karyozom Periferal ve çok belirgin olmayan kromatin Yuvarlak veya oval stoplazma

C, D: E. coli trophozoites stained with trichrome.

two images below are cysts of non-pathogenic Entamoeba coli.

Antijen saptama E.histolitica ve E.dispar tür ayrımı için taze,taze-donmuş veya fikse edilmemiş insan gaita örnekleriyle çalışacak kit tasarlanmıştır Kit, kullanıma bağlı olarak E.histolitica /E.dispar grup veya tek bir türü gaitada saptayabilmektedir Mikroskopi yönteminden daha duyarlı ve özgüldür Bu yöntemlerde antijeni denatüre ettiği için fiksatifli gaitalar kullanılmaz

Antijen testlerinde serum, inflamasyon ve tükrük gibi diğer örnek tipleri de kullanılabilir Serum içindeki antijeni saptamak amibik karaciğer apsesi ve intestinal hastalığın tanısı için hassas bir yöntemdir Çünkü karaciğer apseli hastaların %10 undan daha azında etken gaitada saptanır Bu nedenle rutin yumurta ve parazit incelemesi gibi yöntemler karaciğer amibiyazisi tanısında yararlı değildir Karaciğer apselerinden mikroskopik inceleme ile trofozoid aranması düşük duyarlığa sahiptir

Serolojik testler İnvasiv hastalığın tanısı için faydalıdır İndirek hemaglütinasyon, kompleman fiksasyon testi, lateks aglütinasyon ve EIA gibi birçok yöntem vardır Serolojik testler ekstraintestinal hastalığa sahip bireylerde %99 a yakın bir duyarlılığa sahiptir E.dispar ile infekte kişilerde antikor saptanmaz İnvasiv amibiyazisin tedavisinden sonra serum antikorları 10 yıla kadar kalmakta, bu durum infeksiyonun endemik olduğu bölgelerde tanıda zorluklara neden olmaktadır

Endemik bölgelerde insanlar birçok zaman E. histolitika ile karşılaşır Endemik bölgelerde insanlar birçok zaman E. histolitika ile karşılaşır. Çoğu olguda da semptom olmaz. Antikor saptama ile yeni bir olgu ve geçmişte karşılaşma ayırt edilemez. Serolojik incelemede sorun takip eden yılda antikorun persiste olmasıdır. Bu nedenle özellikle endemik bölgelerde yeni ve geçirilmiş olguların ayırımında yetersizdir. E. histolitika’nın yaygın olmadığı endüstriyel toplumlarda serolojik test değerlidir. Özellikle karaciğer amip absesi gibi dışkıda parazitin az saptandığı olgularda yararı vardır.

EIA, IgM ve IgG saptamak için yaygın olarak kullanılmaktadır Bu testler, E.histolitica infeksiyonunun semptomlarının oluşmasından 1 hafta sonra ortaya çıkan anti-lektin antikorlarını saptamayı temel alan testlerdir IHA testi tanı için oldukça yararlı ve spesifik bir yöntem olmasına rağmen EIA ile karşılaştırıldığında duyarlılığı daha düşüktür

Kültür Entamoeba tür ayırımında altın standart kültürde izoenzim analizidir, ancak klinik pratikte kullanımı zordur Özel laboratuvar ortamı gerektirmesi, birkaç hafta sürmesi klinik kullanımını oldukça sınırlandırmaktadır Patojenik ve nonpatojenik ameobalar klasik olarak kültürde izoenzim analizleri ile ayrışır. (malik enzim, heksokinaz, glukoz fosfat izomeraz, fosfoglukomutaz ) E. dispar/E. histolitika kültürdeki ayrışımı 2 türde heksokinazın genetik farklılığına göre yapılır.

Günümüzde E. Histolitika kültürlerinde Robbinson besiyeri ve Diamond TYSGM-9 besiyerleri kullanılmaktadır. Dışkı ve karaciğer aspirasyon materyali kültürünün uzun olması ve izoenzim analizlerinin güvenli olmaması nedeni ile rutinde kültür incelemesi kullanılmaz. Kültür rutinde kulanılmaz ancak araştırma amacı ile kullanılır

PCR ile tanı PCR ile nükleik asit saptama teknikleri, E. histolitica ve E. dispar’ın saptanması ve ayrımları için geliştirilmiştir PCR gaita,karaciğer ve beyin aspirat örneklerine uygulanmakta ve hem trofozoid hem de kist DNA sını tespit edebilmektedir Son zamanlarda, real-time PCR yöntemi E.histolitica ve E.dispar’ın tanımlanması için kullanılmaya başlanmıştır PCR mikroskopiden daha duyarlı ve özgüldür PCR ve antijen saptama yöntemlerinin duyarlılıkları hemen hemen birbirine eşit olabilmekte, ama antijen saptama yöntemleri kullanımındaki teknik kolaylık ve daha kısa bir zamanda sonuç verme açısından daha çok tercih edilmektedir

Dokuz Eylül Üniversitesi Parazitoloji laboratuvarında Ocak 2004-Mayıs 2006 arasında yapılan bir çalışmada 9378 dışkı örneği incelenmiş, E.histolitica/E.dispar saptanan 41 hastaya ELISA uygulanmış ve ancak 18 tanesinde E.histolitica saptanmıştır. Bu durumda direkt mikroskopi ve kültür yöntemleriyle saptanmış ama ELISA yöntemiyle saptanamayan olguların E.dispar olduğu düşünülmüştür Dışkı kültürü yapılan 14 hastada Robinson besiyerinde üreme olurken bu hastaların ELISA ile dışkıda amip antijeni sonuçları negatif olarak bulunmuş, bu durumda da hastalarda bulunan amip türünün E.dispar olduğu düşünülmüştür. Bunun tam tersi olarak direkt mikroskobik bakı yöntemi ile negatif olduğu bildirilen örneklerin ise 13 tanesinde ELISA ile E. histolitica saptanmıştır.

Trikrom boyamada protozoanın doğru tanımlanması %91.8 Direkt ve iyodin boyama yöntemi ile doğru tanımlanma ise %61.8 bulunmuştur

Sonuç olarak E. histolitika gelişmemiş ülkelerde hala ciddi morbidite mortalite nedenidir Bugün için invaziv amebiasis teşhisinde dışkıda ELISA ile antijen saptama ve moleküler yöntemler tercih edilmelidir Mikroskobik incelemeler E. histolitika ve nonpatojen ancak 10 kat daha sık görülen ve morfolojik olarak aynı olan E. Disparın ayrımını yapamaz

Direk mikroskopik bakı ile kistlerin tamamen ayrılması zordur Amip kistleri birbiriyle ve lökositlerle karışabilir Bu nedenle incelemelerde deneyimli kişilere vardır E.histolitica sindirim sisteminde bulunan diğer amiplerden geçmişte çekirdek yapısı, büyüklük, stoplazmik inklüzyonlar ve hareket biçimi ile ayrılabilirken, günümüzde (E. Dispar nedeniyle )izoenzim, DNA analizi, PCR veya monoklonal antikorlar gibi moleküler veya ileri yöntemler ile ayrımı yapılır