Proteinlerin kantitatif tayini

Protein tayin yöntemi • Bir çözeltideki toplam protein miktarının belirlenmesi, bilimsel araştırmalarda, gıda analizlerinde, endüstriyel ve biyoteknolojik birçok ürünün analizinde kullanılır. • Proteinlerin saflaştırma basamaklarında mutlaka protein tayinleri yapılmalıdır. • Saflaştırılan protein bir enzimse; buna ek olarak aktivite tayinlerinin de yapılması gerekir.

Proteinlerin konsantrasyon tayini 1. Warburg metodu 2. Kjeldahl Metodu 3. Biuret Metodu 4. Folin – Lowry Metodu 5. Bradford Metodu

WARBURG METODU ÖLÇÜM Protein çözeltisinin bir belirteçle reaksiyona sokulup oluşan renkli bileşiğin (kromofor) görünür alanda ölçülmesi. Protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun ölçülmesi.

Uv absorpsiyon yöntemi )WARBURG-CHRISTIAN YÖNTEMİ( Bu yöntemde, çalışılan çözeltinin UV absorbsiyonu doğrudan ölçülür ve protein derişimi hesap yoluyla bulunur. Diğer yöntemlerde ise belirteçlerle işlem sonucu oluşan renkli bileşiğin absorbsiyonu belirlenir ve derişimleri bilinen satandart protein çözeltilerinin ortaya koyduğu verilerle karılaştırılır.

)Warburg-christian yöntemi( Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok proteinin 280 nm’de maksimum absorbsiyon gösterme özelliğinden yararlanılarak örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için kullanılan hızlı bir yöntemdir.

Bu yöntem çok duyarlı olmamakla beraber (duyarlılık: 0. 05-2 Bu yöntem çok duyarlı olmamakla beraber (duyarlılık: 0.05-2.0 mg/ml), kolaylığı ve hızlı sonuç vermesi nedeniyle çok kullanılan bir tekniktir. Ancak, 260 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm’de de absorbsiyon yetekleri olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle nükleik asit artıkları ile çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir. Bunun önüne geçmek için, Warburg ve Christian (1941) tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü ile ortaya çıkabilecek hata payı daha aza indirgenebilmektedir.

A280/A260 Oranı Diyaliz ya da fraksinasyon (Ters Difüzyon) yoluyla protein olmayan maddelerin uzaklaştırılmasından sonra 260-280 nm’de UV. absorbsiyon analizleri yapılır. Protein konsantrasyonu ( mg/ml ) = 1.5 x A280 - 0.75 x A260

KJELDAHL YÖNTEMI Yöntem 1883 yılında Johan Kjeldahl tarafından geliştirilmiştir. Bileşiklerin azot miktarını belirlemek için kullanılan oldukça eski bir yöntemdir. Bu yöntemde protein numunesi H2SO4’li ortamda parçalanır. Böylece proteinin içerdiği azot (NH4) 2SO4’a dönüşür. (NH4) 2SO4’a dönüşen azot destilasyon cihazına alınır ve NaOH ilave edilir. Oluşan NH3 destillenerek alınır. HCl çözeltisine gönderilerek, NaOH titre edilir. Proteindeki azot oranından hareket ederek protein miktarı belirlenir.

uygulanışı

Yöntem bütün protein moleküllerinin saf polipeptit zincirinden ibaret olup yaklaşık % 16 oranında azot içerdikleri varsayımına dayanır. Bulunan mg azot miktarı 6,25 ile çarpılarak protein miktarına geçirilir. Büyük miktarda numunelerle çalışılırken bu metot kullanılabilir. Genellikle bitki materyallerinin ve hayvan yemlerinin analizinde çok kullanışlıdır. Kuru kan örneklerindeki azotu belirlemek içinde bu metot kullanılır. Bu yöntemin hassasiyeti iyi değildir.

Biuret yöntemi Amaç: Konsantrasyonu bilinmeyen maddelerin standart eğriden tayin edilmesi. Metodun prensibi: İki ya da daha fazla peptid bağına sahip peptidler ya da proteinlerin bazik ortamda Cu +2 iyonu ile mor-mavi kompleks yapması esasına dayanır. Bu kompleks iki peptid zincirindeki 4 azot atomunun ortaklaşmamış elektronları ile Cu +2 iyonu arasında gerçekleşir. Oluşan renkli bileşik 546 nm’de ölçülebilir. Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir.

avantajı Oluşan renk şiddeti sadece proteine aittir. Burada nükleik asitlerin bulunması ölçümü etkilemez. Pratik bir yöntem.

dezavantajı Bu metot sonucu protein başka bir moleküle dönüştüğü için onu geri kazanmamız olanaksızdır. Amonyak ve amonyum iyonları bozucu faktör olduğundan amonyum sülfat çöktürmesi sonucu elde edilen protein numunesine direkt uygulanamaz. Duyarlılığı düşük.

FOLİN-LOWRY METODU Folin – Lowry yöntemi, protein miktarının Biuret yönteminden daha duyarlı olarak belirlenmesini sağlayan bir metottur. Bu yöntem için Biüret yönteminin bir modifikasyonudur diyebiliriz. Hassasiyet aralığı 5 - 100 μg/ml’dir. Yöntem alkali koşullarda meydana gelen iki farklı reaksiyona dayalıdır.

folin-lowry yöntemi Reaksiyon •Amid bağları ile bakır arasında meydana gelen ve indirgenmiş bakır oluşumu ile sonuçlanan Biüret reaksiyonu 2. Reaksiyon •Folin-Ciocalteu ayıracının (fosfomolibden ve fosfotungsten) tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek indirgenmesi •İndirgenmiş ayıraç mavi renktedir.

Oluşan rengin şiddeti 660 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülebilir. Bu iki reaksiyonu bir arada gerçekleşmesi Biüret reaksiyonunun hassasiyetini 100 kat artırır. Lowry yöntemi pH hassasiyeti gösterir, ortam pH’sı 10-10.5 olmalıdır. Yöntem triptofan ve tirozin içeriği fazla olan proteinlerin miktar tayini için avantajlıdır zira ayıraç bu amino asitlere daha yüksek hassasiyet gösterir.

uygulanışı

avantajları Lowry yöntemi, hassasiyetinin iyi olması ve kolaylığı açısından protein biyokimyası işlemlerinde çok fazla kullanılır. En fazla gıda proteinlerinin tayininde kullanılır. Çünkü gıda karışımından proteinleri izole etmeye gerek yoktur. Biüret yöntemine göre 50-100 kez daha hassastır. 280 nm de absorbans yöntemine göre ise 10-20 kez hassastır. Diğer yöntemlere göre daha spesifiktir.

dezavantajları Renk oluşumu proteinlere göre farklılık gösterebilir. Renk tamamen protein konsantrasyonuyla orantılı olmayabilir. Lipitler, sakaroz, fosfat tamponları, monosakkaritler ve hegzoaminlar girişim yaparlar.

BRADFORD YÖNTEMİ (boya bağlama yöntemi) Boya bağlama esaslı yöntemlerin en yaygını 1976 yılında Bradford tarafından geliştirilen ve Coomassie Brillant Blue G–250 boyasının kullanıldığı yöntemdir. Metodun Prensibi: Proteinlerin fosforik asitli ortamda Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) boyası ile kompleks yapma esasına dayanır. Bu boya negatif yüklüdür ve pozitif yüklü proteinlerle kompleks yaparak kırmızı renkten (Amax=465) mavi renge (Amax=595) dönüşür.

uygulanışı

avantajları Yöntem çok basit ve hızlıdır. Oluşan reaksiyon hızlıdır ve 2 dakika içerisinde tamamlanır. Oluşan renk stabildir. Reaktif hazırlandığı zaman renkli şişelerde uzun süre saklanabilir. Standart eğri uzun süre kullanılır.

dezavantajı Renk şiddeti pH değişimine karşı çok duyarlıdır. Standart eğrinin elde edilişi zordur.Çünkü geniş bir konsantrasyon aralığında lineerlik sağlanamamaktadır. SDS ve Triton X-100 gibi maddeler bu reaksiyon için bozucu faktörlerdir. Boya küvetlerde kalıntı bıraktığı için küvetler tek kullanımlık olmalıdır.