(Mass Spectrometry, MS) Kütle Spektrometrisi (Mass Spectrometry, MS)

Proteinlerin MS ile analizinde farklı stratejiler Ham protein özütü doğrudan proteolitik kesime uğratılır. Ardından tek veya çok boyutlu sıvı kromatografi teknikleriyle ayrıştırılıp MS ile analiz edilir. Proteinler önce fraksiyonlara ayrılır veya jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Ardından tripsin gibi enzimlerle veya kimyasal ajanlarla proteolitik kesime uğratılır. Sonra MS ile analiz edilir. ‘’peptid mass finger print’’ (peptid kütle parmak izi) verilerine dayanarak yapıları hakkında bilgi edinilir Amino asit dizisi belirlenir Posttranslasyonel modifikasyonlar belirlenir. top-down (yukarıdan aşağıya) yapı tayini buttom-up (aşağıdan yukarıya) yapı tayini

A- proteinler 2D Elektroforez ile birbirinden ayrılır - Boyama yöntemleri ile görünür hale getirilir -İlgilenilen proteinler ayrılır, alkilasyon yapılır, tripsin ile jelde proteoliz (in-gel digestion) yapılır B-ikinci bir yol olarak, ‘’Cell-mapping’’ proteomik yöntemleri ile, ( antibody, ‘’small peptid epitop’’ ile veya makromoleküler komplekslerin izolasyonu ile) ilgilenen protein izole edilir ve 1D veya 2D elektroforez ile birbirinden ayrılır. -Boyama yöntemleri ile görünür hale getirilir. -Mass spektrometri aşamasında genellikle Proteomik analizlerinde uygulanan yöntemler olan MALDI ( Matriks destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyonu) ve onu takiben TOF (quadropol Time of Flight) gösterilmiştir. BUAŞAMALARDA YÜKSEK DÜZEYDE VERİ ÇIKIŞI (HIGH THROUGHOUT) elde edilir -Bu yöntemlerle aydınlatılamayan proteinler, DÜŞÜK DÜZEYDE VERİ ÇIKIŞI (LOW THROUGHOUT) UYGULANMAsıyla bilgi toplayan, ESI yöntemi takibedilir. Buradan elde edilen peptid iyonları bilgileri ve Tandem Mass Spektrometrisine giren peptid fragmanları (aşamalı Mass) birlikte değerlendirmeye alınır

Kütle Spektrometresi (Mass Spectrometer) Cihazını oluşturan Bölümler 1- Numunenin uygulandığı bölüm 2- Numune bileşenlerinin değişik metotlarla iyonlara dönüştürülmesi 3- İyonların magnetik ve/ veya elektrik alanına yönlendiren bölüm 4- Elektromagnetik alandan geçen iyonların Kütle-Yük oranının hesaplanması 5- Bu hesaplara dayanarak bileşenlerin tanımlanması 1 4 2 3 5 Mass spectrum of a peptide showing the isotopic distribution

En çok kullanılan yöntem MALDI-TOF ESI ve MALDI TOF ve FT-ICR Mass spekrometrisinin Proteomik te kullanılabilir hale gelmesine sebep olan devrimlerin yapıldığı bölümler

Basit bir örnek olarak NaCl molekülünün Mass spektrometrisi düşünülürse, 1- NaCl gaz fazına geçip iyon haline gelir yani Na+ ve Cl- 2- Na doğada tek izotop halinde bulunur bu yüzden kütlesi sadece 23 amu (atomic mass unit) olarak bulunmakta, fakat Cl nin 2 izotopu var, biri 37 (%75) diğeri ise 35 (%25). Yani toplamda 2 farklı m/z değerine sahip parçacık olacaklardır, (60 ve 58). 3- Magnetik alanda hafif olan parçacıklar, ağır olanlara nazaran daha çok saparlar 4- Yayınlanan iyonların analizörden geçip iyonların bağıl bolluğunu ölçen dedektöre varırlar. 5- Bu sayede her parçacıkta hem Na hem Cl bulunduğu bilgisine ulaşılabilir, bunun dışında 35Cl nin 37Cl’ye olan oranı anlaşılabilir.

Proteomik’te Kullanılan İyon Kaynakları ESI ( Electron Spray Iyonisation) Elektron spray ile iyonlaşma MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) Matrix destekli lazer emilimi/iyonlaşması

ElectroSpray Ionization (ESI) John Bennett Fenn, Biyolojik makrokomelküllerin yapı analizinde çığır açan ESI-MS yöntemini bulduğu için 2002 de Nobel Ödülüne layık görüldü. Bu alanda çalışmaya 70 yaşında başladı ve 82 yaşında Nobel ödülünü kazandı. HİÇBİR ZAMAN HİÇBİR ŞEY İÇİN GEÇ DEĞİL. ESI yöntemi makro moleküllerin parçalanmadan incelenmesine olanak tanıyan bir yöntemdir, bu yüzden proteinlerin yapı analizinde ve karmaşık farmasötiklerin tanımlanmasında önemli rol oynamakta.

7-Makromoleküllerde [M + nH]n+ iyonları gözlenmekte 1- Mass ölçümüne tabii tutulan madde su ve organik bir çözücünün belli oranlarındaki bir karışımda çözünür, bunun amacı prose içerisinde çözünün uçurulmasıyla beraber numunenin zerrecik (aerosol) haline geçmesini sağlamaktır. 2- Su, Organik çözücü ve maddenin daha iyi etkileşmesini ve başlangıçtaki damlacığın hacminin küçülmesini sağlamak amacıyla Asetik asit gibi çözeltiler karışıma eklenir. 3- Numune Elektron spray ile asılı YÜKLÜ damlacıklar( aerosol) haline dönüştürülür. Akımın daha iyi sağlanması için Azot gibi inert gazlardan yararlanılabilir. 4- kapilar bir yoldan geçerek yüklü zerrecikler Mass spektrometresinin ilk vakum bölümüne giriyorlar, burada verilen ısı ile çözücü uçmaya başlar. 5- Isınma sırasında çözücünün uçmasından dolayı damlacıkların yüzeyinde biriken yük, yüzey geriliminden daha büyük bir değer alınca damlacıklar parçalanırlar (fision) 6- bu aşamada molekül BENZERİ (quasimolecular) iyonlar oluşur, bu iyonlar ana moleküle bir atom (1 H+ veya 1 Na+) eklenmiş [M + H]+, [M + Na]+, ve ya bir proton çıkarılmış [M − H]− halidir. 7-Makromoleküllerde [M + nH]n+ iyonları gözlenmekte

Elektrospreylerin Çeşitleri Sağlanan elektron akışı açısından farklılıklar yaratılmakta Mikro- elektrospray Nano-elektrospray Nano-elektrospray kaynağı

a-Örnek olarak, atın kalbindeki apomiyoglobin’e ait hipotetik bir ESI-MS’ı gösterilmektedir. (ortalama molekül ağırlığı 16 951.5 dalton). Spektrumda gözüken moleküler kütle pikleri apomiyoglobin’e değişik sayılarda proton bağlanmasından kaynaklanmaktadır (bir proteinin taşıyabileceği yük sayısı protein denatüre olması ya da katlanmamış hale geçmesi ile değişmektedir). b-Yüksek hassasiyete uygun bir cihaz kullanılırsa, (>10,000)tek bir iyonun izotopik demetini analiz ederek, bölünmüş bir parçanın veya ana molekülün yük seviyesini tespit etmek mümkün olacaktır

Matrix-assisted Laser Desorption/İonization MALDI MALDI yöntemi de ESI yöntemi gibi makro moleküllerin parçalanmadan incelenmesine olanak tanıyan bir İyon Kaynağı çeşitidir. Temelde birbirine çok benzeyen bu yöntemlerde en büyük fark MALDI yönteminde daha az sayıda çoklu yük taşıyan ([M + nH]n+) iyonların üretilmesidir. Koichi TANAKA Kimya Nobel Ödülü 2002, MALDI yöntemi için MALDI-TOF Cihazlarının Görünümü

Jel elektroforezi: SDS- PAGE MALDI yöntemi bu testlerin sonucunu incelemek için kullanılmakta: Size exclusion Kromatografi İki boyutlu jel elektroforezi HPLC

-ESI yönteminde bahsedilen çözücü sistemi (Su, Organik çözücü ve Asetik asit karışımı) burada yeini Matrix olarak adlandırılan çözücü karışımına vermiştir. İyonlaşma Lazer ışınları ile başlatılmakta (genellikle Azot kaynaklı Lazer) ve Matrix çözücüsü, numunenin Lazerin direk ışınlanmasından korumak ve buharlaşmayı kolaylaştırmak için kullanılmakta Matrixlerin ana bileşeni kristal bir bileşiktir, hangi bileşiğin seçileceği deneme- yanılma yöntemi ile gerçekleşmektedir. UV MALDI Matrix List Bileşik Diğer İsim Çözücü Dalga Boyu Uygulama Alanı 2,5-dihydroxy benzoic acid DHB, Gentisic acid acetonitrile, water, methanol, acetone, chloroform 337, 355, 266 peptides, nucleotides, oligonucleotides, oligosaccharides 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid sinapic acid; sinapinic acid; SA acetonitrile, water, acetone, chloroform peptides, proteins, lipids 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid ferulic acid acetonitrile, water, propanol Proteins α-cyano-4-hydroxycinnamic acid CHCA acetonitrile, water, ethanol, acetone 337, 355 peptides, lipids, nucleotides Picolinic acid PA Ethanol 266 oligonucleotides 3-hydroxy picolinic acid HPA

2,5-dihydroxy benzoic acid DHB, Gentisic acid Bileşik Diğer İsim 2,5-dihydroxy benzoic acid DHB, Gentisic acid 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid sinapic acid; sinapinic acid; SA 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid ferulic acid α-cyano-4-hydroxycinnamic acid CHCA Picolinic acid PA 3-hydroxy picolinic acid HPA Bu kristaller belirli özelliklerinden dolayı kullanılmaktadırlar: Kolay buharlaşmayı sağlayacak kadar düşük molekül ağırlığına fakat numune hazırlanması ve spektrometri sırasında buharlaşmayacak kadar büyük yapıya sahiptirler. Asidik yapıya sahiptirler dolaysıyla molekülün protonlanmasında hızlandırıcı ve kolaylaştırıcı etkileri olacaktır. UV de hızlı ve yüksek bir emisyona sahipler dolayısıyla Lazer ışınını yüksek bir verimle absorplayabilirler. Sulu çözeltilerde çözünmeyi kolaylaştırmak için polar gruplarla sübstitüe edilmişlerdir.

Lazer ışını enerjisi Matrix bileşikleri tarafından absorplanır daha sonra bu enerjinin bir bölümü incelenmek üzere olan numuneye aktarılır, bu esnada numunenin bileşimi lazerin zararlı etkisinden ve dolaysiyle parçalanmaktan korunmuş olur alınan enerji ile analit iyonize olur. Bu esnada molekül BENZERİ (quasimolecular) iyonlar oluşur, bu iyonlar ana moleküle bir atom (1 H+ veya 1 Na+) eklenmiş [M + H]+, [M + Na]+, veya bir proton çıkarılmış [M − H]− halidir. uygulanan lazer ışığının gücüne bağlı olarak zaman zaman ([M+nH]n+) iyonları da oluşabilir.

Atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionization AP-MALDI Proteomik, DNA/RNA/PNA, lipidler, oligosakkaridler, fosfolipidler, bakteriler, küçük sentetik moleküller ve bakteriler gibi bileşiklerin kütle spektrometrisinde kullanılan bir diğer yöntem atmosferik basınçta yapılan MALDI yöntemidir. Normal MALDI vakumda iyonlaştırmayı gerçekleştirirken, AP-MALDI atmosferik basınçta cereyan etmektedir. Bu yöntemin tek dezavantajı sınırlı hassasiyeti ve sınırlı aralıktaki kütleye sahip bileşikler için kullanılmasıdır.

MALDI iyon kaynakları genellikle TOF tipi Mass analizörleri kullanılmakta (TOF ayrıntılı olarak anlatılacaktır) Bu iki parçanın birleştirilmesinin önemli sebepleri bulunmaktadır: Lazer ışıması sürekli bir ışıma özelliğini taşımaktan daha ziyade ‘’tek vuruş’’ özelliği taşımakta ve bunu en iyi TOF yöntemi analiz etmekte Yüksek kütleye sahip olan bileşiklerin yorumu en iyi TOF analizörleri yapmakta MALDI-TOF cihazlarında genellikle iyon aynaları taşımakta, bu aynalar İyonları yansıtarak iyonun uçuş mesafesini ikiye katlayarak daha büyük bir çözünürlük sağlamaktadırlar. MALDI-TOF iyon reflektörü

Time of Flight (TOF) Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)

TOF yönteminin tam açıklaması matematiksel bağlantılarla mümkün olmaktadır; BEN HİÇBİR ŞEY ANLAMADIM

Özet Olarak; Time of Flight (TOF) (UÇUŞ ZAMANI) sadece Mass spektrometrisine özel olan bir terim değil; genel olarak bir zerrecik veya bir nesnenin, belli bir mesafe katettikten sonra bir dedektöre ulaşması için gerekli olan süreyi ölçen yönteme verilen isimdir. Mass Spektrometrisinde ise; bu yöntem iyonların belli büyüklüğe sahip olan elektriksel alanda hızlandırılmalarında kullanılmaktadır. Bu hızlanmanın sonucunda aynı yük fakat farklı kinetik enerjisine sahip olan iyonlar birbirinden ayırdedilebilmekteler. Bu ayrım ise Kütle/Yük oranının farklılığı İLE ŞİDDETLENMEKTEDİR. Kütle/Yük oranı değişik olan iyonların detektöre ulaşma zamanı ölçülmekte (ağır olanlar geç ulaşır) ve belirli formüllerle kütleleri hesaplanmaktadır Çok Şükür Anladım

Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR). Yöntemin temeli TOF yöntemi gibidir, fakat iyonların ayrılması, iyonların elektrik alanda değil MAGNETİK ALANDA hareket etmelerinden kaynaklanmakta. Bu yöntemin en büyük özelliği, m/z oranları birbirine çok yakın olan iyonları birbirinden ayırması ve dolaysiyle ince pikler vermesidir. Proteinler gibi biyolojik makromoleküller, bir çok yerinden iyonlaşabildiği için bir çok iyonik izotop üretmekte, bu da çoklu piklerin oluşmasına sebep olmakta, FT-ICR yüksek hassasiyeti ile bu pikleri birbirinden ayırmakta ve AYRI ve İNCE pikler vermekte.

Açıklanan MASS Tekniklerinin PROTEOMİK’te Uygulama şekilleri Peptide mass fingerprinting (PMF) (Peptidlerin Kütle Parmakizi) Tandem Mass spektrometri (MS/MS) Ardışık Mass Spektrometri

Öncül İyondan bir tek pik seçilir ve ikinci MS analizi yapılır Elde edilen bilgi, Bilgi Bankaları ile karşılaştırılır.

Peptide Mass Fingerprinting PMS 1993’ten beri Proteinlerin yapı tayininde kullanılan ANALİTİK bir yöntemdir Bu yöntemde Swissprot ve Genbank gibi Bilgi Bankaları kullanılmakta En büyük avantajı ise sadece Peptidlerin ağırlığının bilinmesinin proteinin yapısının aydınlatılmasında yeterli olacağıdır, ‘’de novo peptide sequencing’’ (Peptidlerin sıralanmasını belirleyen yöntem) gibi bilgilere ihtiyaç yoktur. En Büyük Dezavantajı ise saf bir protein üzerinde uygulanmasına duyulan gereksinimdir, aksi takdirde MS/MS kullanılmalı. Bu yüzden bu yöntem 1- 2D Elektroforez ve 2- SDS-PAGE’ (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) dan sonra kullanılmaktadır

Peptide Mass Fingerprinting PMS aşamaları: Yukarıda belirtilen saflaştırma yöntemlerinden elde edilen proteinler trypsin, chymotrypsin veya Glu-C gibi enzimatik yöntemlerle peptidlerine parçalanırlar, öngörülen numune proteaz miktarı 50:1 dir. Buradan elde edilen peptidler asetonitril ile ekstrakte edildikten sonra vakumda uçurulur ve az bir miktar distile suda çözündükten sonra Mass analizine tabii tutulur. Numune MALDI yönteminde bahsedilen MATRİX ile karıştırılıp, beraber kristalize edildikten sonra MALDI/TOF yöntemi ile ilgili numunenin Mass Spektrometresi gerçekleşmektedir. Elde edilen Mass spektrumu bilgileri devasa Bilgi Bankaları ile karşılaştırılır. Bu Bilgi Bankaları değişik peptidlerin Mass Bilgilerini içermektedirler, elde edilen Mass Listesi bu bilgilerle karşılaştırılıp, İstatistiksel olarak Proteinin yapısı aydınlatılmaktadır.

Sequencing analysis of 1872 Da actin I peptide Sequencing analysis of 1872 Da actin I peptide. MS2 at 937 Da = (1872 Da + 2 Da)/2 of the tryptic digest, “B-Series” (5×: peak intensity 5 times magnified). Expected sequence of 1872 Da peptide 1-18 is: acetyl-GEEDVQALVVDNGSGNVK (partial sequence found is underlined).

2 Farklı şekilde gerçekleşmektedir: Tandem Mass Spectrometry MS/MS 2 Farklı şekilde gerçekleşmektedir: Mass Spektrometri Cihazının Bölümleri (parçaları) aynı cihaz içersinde peş peşe 2 veya birkaç MS/MS parçalanması gerçekleşecek şekilde yüksek vakumda bir araya getirilmiştir Bir tek cihaz ve bir tek MS yöntemi kullanılmakta, ancak zaman içerisinde numune 2 veya birkaç kez MS parçalanmasına uğramakta (zamanla ayrılmış parçalanma)

Vakumda Tandem Mass Spektrometrisine bir Örnek Öncül İyon Son İyon

TOF/TOF MS den bir örnek Tandem (Aşamalı) MS/MS söz konusu olduğu zaman CID (Collision-Induced Dissociation) adı verilen bir parçalanma tekniği söz konusu olmakta, bu yöntem başka MS yöntemlerinde kullanmamakta ve sadece MS/MS aşamalarının ortasında daha iyi sonuç elde etmek için kullanılabilmektedir

Collision-Induced Dissociation CID ( Çarpma ile Parçalanma) MS/MS yönteminde bazen değişik İyon Kaynakları tarafından üretilen iyonlar, elektriksel veya magnetik alanda bahsedildiği gibi hızlandırılırlar, bu hızlandırılmış iyonlar İNERT GAZ ortamına gönderilirler (Helyum, Nitrojen veya Argon) Bu ortamda gaz molekülleri ile çarpışan iyonların taşıdıkları kinetik enerjinin bir bölümünü ‘’İnternal (İÇ) Enerjiye’’ dönüşmekte, bu enerji numunenin kendi içinde belirli bağlardan (proteinlerde peptid bağlarından) parçalanmasına sebep olmakta. EK BİLGİ: CID’ye benzer bazı yöntemlerin adı: electron transfer dissociation (ETD), electron capture dissociation (ECD) ve Infrared multiphoton dissociation (IRMPD) dir.

İkinci MS Birinci MS CID Hücresi TOF Bölümü CID MS/MS’i takiben TOF yöntemi ile Mass Spektroskopisi

Zamana Bağlı MS/MS yöntemlerinde her aşamada elde edilen İyonların korunması için İyon Tuzağı kullanılmaktadır, bu yüzden bazen İyon Trap Mass Spektrometrisi terimi ile karşılaşılabilir. Ion Trap

ESNEMEDEN DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜRLER