PLURİPOTENT KÖK HÜCRELER VE İŞİTME KAYBINDA KULLANIMI Pluripotent hücrelerle hücresel tedavi ve regeneratif tıp günümüzde gelişim halindedir ve biz KBB de önemli bir araştırma alanı olan, iPS hücre teknolojisiyle duyu kaybının biyolojik tedavisi konulu yazımızla bu konuya dikkat çekmek istedik. Kök hücre, mitoz bölünmeyle özelleşmiş hücre tiplerine farklılaşabilen ve daha fazla kök hücre üretmek için kendini yenileme yeteneğine sahip olan, bütün çok hücreli canlıların doku ve organlarını oluşturan ana hücre türleridir. Yrd. Doç. Dr. Ahmet Hamdi Kepekçi Yeni Yüzyıl Üniversitesi Meltem Hastanesi

SUNU İÇERİK Kök hücre Pluripotent kök hücreler Tanım Özellikler Klasifikasyon Pluripotent kök hücreler Embriyonik kök hücre İnduced pluripotent kök hücre Kulak anatomi ve işitme fizyolojisi Sensorinöral işitme kaybı fizyopatolojisi Sensorinöral işitme kaybında kök hücre uygulamaları

KÖK HÜCRE VE TEMEL ÖZELLİKLERİ Kök hücre, canlıda tüm hücrelerinin, doku ve organlarının kaynaklandığı ana hücredir. Self-renewal (Kendini yenileyebilir), Sayıları sürekli sabit olarak kalır. Bir hasar oluşumunda yeni bir doku oluşturabilme ve onarımını sağlamak üzere özelleşmiş hücrelere farklılaşabilen hücrelerdir.

KÖK HÜCRE ÇALIŞMALARININ TARİHİ SEYRİ Kendi kendini yenileyebilen kan hücrelerinin varlığı ilk kez 1950'li yıllarda gösterilmiştir. Bugün kullandığımız anlamdaki kök hücrenin tanımı ise 1961 yılında deney hayvanlarında yürütülen çalışmalar üzerine yapılmıştır. Kemik iliği nakillerinin başarı kazanmasıyla birlikte 1970'li yıllarda kemik iliğinin bütününün değil, yalnızca onu oluşturan temel hücrelerin, yani bugünkü kullandığımız terimiyle kök hücrelerinin nakli gündeme geldi Embriyolojik kökenli kök hücreleri 1981 farede (Evans M), 1998 yılında insanda tanımlandı (Thomson) İndüklenmiş pluripotent kök hücreler ilk olarak Yamanaka'nın çalışma grubu tarafından 2006 yılında üretildi. Son yıllarda yapılan araştırmalar kök hücrelerinin laboratuarda uygun koşullar altında yağ, kas, damar endoteli (iç çeperi), karaciğer, kıkırdak, kemik ve sinir hücrelerine dönüşebildiğini göstermiştir.  Kendi kendini yenileyebilen kan hücrelerinin varlığı ilk kez 1950'li yıllarda gösterilmiştir. Bugün kullandığımız anlamdaki kök hücrenin tanımı ise 1961 yılında deney hayvanlarında yürütülen çalışmalar üzerine yapılmıştır. Kemik iliği nakillerinin başarı kazanmasıyla birlikte 1970'li yıllarda kemik iliğinin bütününün değil, yalnızca onu oluşturan temel hücrelerin, yani bugünkü kullandığımız terimiyle kök hücrelerinin nakli gündeme geldi Embriyolojik kökenli kök hücreleri ise 1998 yılında tanımlandı. Özellikle Thomson’ın 1998’deki insan embriyosu kök hücrelerini tanımlaması ve kültürde ne kadar çoğaldığını göstermesinden sonra insan embriyonik kök hücrelerinin tedavi seçeneği olarak kullanılıp kullanılmaması, bazı ciddi tartışmaları gündeme getirdi. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler ilk olarak Shinya çalışma grubu tarafından 2006 yılında Kyoto Üniversitesi'nde üretildi. Kök hücre nakli uygulamaları daha çok doku 'onarımı' amacıyla yapılmaktadır. Son yıllarda yapılan araştırmalar kandan elde edilen kök hücrelerinin laboratuarda uygun koşullar altında yağ, kas, damar endoteli (iç çeperi), karaciğer, kıkırdak, kemik ve sinir hücrelerine dönüşebildiğini göstermiştir. 

1. Totipotent kök hücreler DÖNÜŞME (PLASTİSİTE) YETENEĞİNE GÖRE KÖK HÜCRE SINIFLAMASI 1. Totipotent kök hücreler Zigot oluşumundan blastosist aşamasına kadar embriyonun en erken evresindeki diferansiye olmamış kök hücrelerdir. Embriyo, embriyo sonrası bütün dokuları, embriyo dışı plasenta ve amniotik membran gibi yapıları oluşturan sınırsız çoğalma yeteneğine sahip kök hücrelerdir. Sınırsız sayıda farklılaşma yeteneği olanlar (Totipotent). Bu tür hücreler ancak ceninlerin erken evresinde (embriyo) bulunurlar ve hemen her türlü vücut hücresine dönüşebilme yetenekleri vardır. Totipotent kök hücreler ile bilimsel çalışmalar yasaklanmıştır

2. Pluripotent kök hücreler DÖNÜŞME (PLASTİSİTE) YETENEĞİNE GÖRE KÖK HÜCRE SINIFLAMASI 2. Pluripotent kök hücreler Embriyonun 5-6. günlerinde 64-200 hücre aşamasına geldiği blastosist evresindeki iç hücre kitlesindeki embriyoblastlardır. Plasenta haricinde, ektoderm, endoderm ve mezoderm karakterli tüm germ hücrelerine dönüşerek bütün organ ve dokuları oluşturabilir. Sınırsız proliferasyon yeteneğine sahip hücrelerdir. Embriyonik kök hücre olarak da ifade edilen pluripotent kök hücreler rejeneratif tıp için çok önemlidir. Sınırlı sayıda farklılaşabilen, bununla birlikte organizmada birçok dokunun oluşması veya onarımı yeteneğine sahip hücreler (Pluripotent). implantasyondan sonra ise multipotent (üç germ tabakasına ait hücrelerden bazılarına farklılaşabilme) özellik kazanırlar Pluripotent kök hücreler ile bilimsel çalışmalar yasaklanmıştır

Pluripotent hücreler, gerekli ortam hazırlandığında bilinen 200 hücre türüne dönüşebilecek güce sahiptirler.

3. Multipotent kök hücreler DÖNÜŞME (PLASTİSİTE) YETENEĞİNE GÖRE KÖK HÜCRE SINIFLAMASI 3. Multipotent kök hücreler Tek bir germ tabakasında farklılaşmaya programlanmış ve embriyonik gelişimin ilerleyen aşamalarındaki kendini yenileme özelliğine sahip erişkin kök hücreleri oluştururlar. Kemik İliği hücreleri ve mezenkimal kök hücreler multipotent kök hücrelerdir. Multipotent hücreler somatik kök hücreler olup kemik iliği, kas, göz, sinir, karaciğer ve deri gibi dokularda bulunabilir. Ölen ya da hasar gören hücreleri yenileme özelliğine sahip farklılaşmamış hücrelerdir. Bölünebilme ve kendini yenileme özellikleri vardır.

DÖNÜŞME (PLASTİSİTE) YETENEĞİNE GÖRE KÖK HÜCRE SINIFLAMASI 4. Multipotensi

5. Unipotent kök hücreler DÖNÜŞME (PLASTİSİTE) YETENEĞİNE GÖRE KÖK HÜCRE SINIFLAMASI 5. Unipotent kök hücreler Yalnız tek bir hücre serisine dönüşebilen kendini yenileme özelliğine sahip potent kök hücrelerdir. Kas kök hücreleri buna örnek olup sadece matür kas hücrelerine diferansiye olabilirler. Tek bir yönde farklılaşabilen hücreler (Unipotent); örnek olarak beyinden elde edilen kök hücrenin yalnızca sinir hücresine dönüşmesi verilebilir. Unipotent hücreler sadece bir hücre tipini, kendilerini üretebilirler. Fakat onları kök-hücre olmayan hücrelerden (örn. kas kök hücreleri) ayırt eden kendini-yenileme yeteneğine sahiplerdir.

KAYNAĞINA GÖRE KÖK HÜCRE SINIFLAMASI Embryonic SCNT: Somatic Cell Nuclear Transfer iPSC : Induced Pluripotent Stem Cells Fetal Umbilical Cord Adult

EMBRİYONİK KÖK HÜCRE (EK HÜCRE) Embriyonik kök hücreler fertilizasyonun 5-6. günlerinde iki katmanlı olarak oluşan blastosistin iç hücre kitlesinden elde edilir. Trofoblast olarak bilinen dış hücre katmanı: plasentayı ve amnion zarını oluşturur. İç hücre kitlesi: ektoderm, endoderm ve mezodermal doku hücrelerini oluşturur. ES ve İPS hücreleri pluripotense sahiptirler ve üç germ tabakasından gelişen hücrelere farklılaşırlar; hücresel tedavi, ilaç geliştirilmesi ve hastalık model araştırması için tercih edilirler. ES elde etmede karşılaşılan etik kısıtlamalardan dolayı iPS hücreleri alternatif pluripotent hücre kaynağıdır ve embryo bu metodla zarar görmemektedir. Bu nedenle etik ve politik dezavantajlar iPS hücrelerle aşılmıştır, ve hasta spesifik otolog pluripotent hücreler bu yöntemle elde edilmektedir. Pluripotent hücrelerle hücresel tedavi ve regeneratif tıp günümüzde gelişim halindedir ve biz KBB de önemli bir araştırma alanı olan, iPS hücre teknolojisiyle duyu kaybının biyolojik tedavisi konulu yazımızla bu konuya dikkat çekmek istedik.

İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK (İPK) HÜCRELER İndüklenmiş pluripotent kök (iPK) hücre embriyonik kök hücre benzeri işlevi olan ve vücut somatik hücrelerinin bazı transkripsiyon faktörleri ile yeniden programlanması (re-programming) sonucu elde edilen hücrelerdir. Yeniden programlama gen anlatımı seviyesinde olur. İlk olarak Yamanaka ve arkadaşları tarafından retroviral gen aktarım metodu ile dermal fibroblast hücreleri pluripotent kök hücreye dönüştürülmesi ile İPK hücre elde edilmiştir. Transkripsiyon (yazılma veya yazılım), DNA'yı oluşturan nükleotit dizisinin RNA polimeraz enzimi tarafından bir RNA dizisi olarak kopyalanması sürecidir. Başka bir deyişle, DNA'dan RNA'ya genetik bilginin aktarımıdır. DNA'da bulunan bilgi işlevsel protein veya RNA ürünlerinin sentezini sağlar. Bu işlevsel ürünleri kodlayan DNA dizilerine gen, bunların oluşumuna da "gen ifadesi" denir. DNA'daki bilginin RNA olarak yazılmış haline "transkript" denir. iPKH embriyonik kök hücrelerin neredeyse tüm özelliklerine sahiptirler ancak, embriyodan oluşturulmamışlardır. Bu nedenle iPKH ile ilgili etik problemler yoktur. Gen, genom dizisinde yeri tanımlanabilen, transkripsiyonu yapılan, düzenleyici ve/veya fonksiyonel bölgeleri olan bir bölgedir. Gen ifadesi ya da Gen ekspresyonu, DNA dizisi olan genlerin, fonksiyonel protein yapılarına dönüşmesi süreci için kullanılan bir terimdir. Basitçe, bu durum genlerin açık (aktif) olup olmadıkları olarak da tanımlanabilir. iPKH hastanın kendi kök hücre olmayan hücresinden elde edilir, bu da, iPKH hastaya bağışıklık sistemi reddi olmaksızın verilebileceği anlamına gelmektedir ki, bu durum kök hücre nakillerinde çok önemlidir.

TRANSKRİPSİYON FAKTÖRLERİ Yamanaka Faktörleri Sox2 Oct3/4 C-Mic Klf4 Transkripsiyon faktörleri, tek başına veya bir komplekste yer alan başka proteinlerle beraber, RNA polimeraz tarafından bir genin transkripsiyonunu ya aktive veya represe ederler. Moleküler biyolojide bir transkripsiyon faktörü genlerin transkripsiyonunu düzenlemek için DNA üzerinde belli bir diziye bağlanabilen bir proteindir. Bunlar diziye-özgün DNA bağlanma proteini olarak da adlandırılır.[1][2] Transkripsiyon faktörleri tek başına veya bir komplekste yer alan başka proteinlerle beraber, RNA polimeraz tarafından bir genin transkripsiyonunu ya (bir aktivatör olarak) kolaylaştırırlar veya (bir represör olarak) engeller.

İPS HÜCRESİ OLUŞTURULAN HÜCRELER Mouse Embryonic fibroblasts Adult tail fibroblasts Hepatocytes Gastric epithelial cell Pancreatic cell Neural stem cell B lymphocyte Keratinocyte Human Cilt fibroblast Keratinosit Periferik kan hücrelerinden

Dr. Kazutoshi Takahashi, PhD Dr. Shinya Yamanaka, PhD Dr. Kazutoshi Takahashi, PhD Human iPSCs

İPS KÖK HÜCRE KOLONİSİ • Dens yoğun görünüm • Keskin sınırlı • Çekirdekleri büyük • Dar stoplasma

İPS HÜCRELERİ Vücutta 200 civarında hücre çeşidine dönüşebilirler. Kişiye özeldir. İmmünolojik özelliği yoktur. Doku red reaksiyonu oluşturmazlar.

iPS TEKNOLOJİSİ KULLANIM ALANLARI Rejeneratif tıpta kullanımı Hastalık spesifik iPS modeli Hasta spesifik iPS modeli İlaç araştırma çalışmaları Toksikoloji testi araştırmalarında Hayvan bioteknoloji çalışmalarında

Gwenaëlle S. G. Géléoc, and Jeffrey R. Holt Science 2014;344:1241062 Fig. 1 Anatomy of the inner ear.(A) Schematic diagram of the human inner ear. Anatomy of the inner ear.(A) Schematic diagram of the human inner ear. The spiral-shaped cochlea is shown with endolymph and perilymph fluids indicated in red and yellow, respectively. The auditory organ known as the Organ of Corti is shown in blue. Potential routes of entry for therapeutics are indicated: round window membrane (RWM) and cochleostomy (CO). [Credit: (24)] (B) Schematic diagram of a cross section of the Organ of Corti. The three rows of outer hair cells and the one row of inner hair cells are colored in blue, and the auditory neurons or spiral ganglion neurons are shown in green. [Reproduced by permission of the American Physiological Society from (81)] (C) Scanning electron micrograph of the Organ of Corti. The hair-cell cell bodies are pseudo-colored blue. [Reproduced by permission of Informa Healthcare from (82)] (D) Scanning electron micrograph of the hair bundle of a single outer hair cell. [Credit: David N. Furness] Gwenaëlle S. G. Géléoc, and Jeffrey R. Holt Science 2014;344:1241062 Published by AAAS

Bazilar zarının titreşimi; tektorial zar içine gömülü durumdaki tüylü hücre uzantılarının (stereosilya) bükülmesine neden olmaktadır. Bu mekanik etki hücrelerin elektriksel potansiyellerini değiştirerek ses titreşimlerini elektriksel sinir sinyallerine dönüştürmektedir.

https://fortwaynehearingcare. files. wordpress. com/2012/02/hc20damage https://fortwaynehearingcare.files.wordpress.com/2012/02/hc20damage.jpg?w=300&h=172

İç kulakta yaklaşık 15. 000 koklear tüylü hücre bulunmaktadır İç kulakta yaklaşık 15.000 koklear tüylü hücre bulunmaktadır. Tüylü hücreler, mekanik ve kimyasal uyaranlara karşı duyarlıdır. Akustik aşırı uyarılma, kemoterapi, aminoglikozid ilaç yan etkileri, yaşlanma ve gürültülü ortamlar işitme bozulmasına yol açarlar. Bu kalıcılı işitme kaybının ana nedeni koklear tüylü hücrelerinin yok olmasıdır.

Günümüzde duyusal epitelin, pluripotent kök hücrelerden elde edilmesine yönelik çalışmalar yapılmaktadır. İşitme bozukluğu toplumun %10’unu değişik seviyelerde etkileyen en sık rastlanan bozukluklardan olup, duyma fonksiyonun tekrar sağlanması iPS hücre tedavilerinde önemli bir başlıktır

İŞİTME KAYIPLARINDA KÖK HÜCRE UYGULAMALARI Embriyonik kök hücrelerde önemli olduğu saptanan transkripsiyon faktörlerinden  Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 genlerinin aktarılmasının fibroblastlara pluripotent hale getirirler.

Hu Z, Ulfendahl M (2013). The potential of stem cells for the restoration of auditory function in humans. Regen Med 8: 309–318. Kök hücre teknolojisindeki yeni araştırmalar, sağırlık için yeni umutlar taşımakta, İPS hücreleri hasarlı duyma hücrelerinin yerine konmasında biyolojik bir yaklaşım sağlamaktadır. İki ana strateji araştırılmaktadır; endojen kök hücrelerin yeni tüylü hücrelere farklılaşması ve iç kulağa eksojen hücrelerin hasarlı nöronların yerine konulması. Halen kök hücre bazlı ekleme tedavileri hayvan araştırmaları düzeyinde de olsa, gelecekteki klinik çalışmalarda kişiselleştirilmiş kök hücrelerin yeni bir girişim olarak kullanılma şansı vardır.

Koehler KR, Mikosz AM, Molosh AI, Patel D (2013) Koehler KR, Mikosz AM, Molosh AI, Patel D (2013). Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature 500: 217–221. Hastalardan alınan iPS hücreleri yaşa bağlı duyma kayıplarının sebeplerini ve çevresel etmenlerle bağını araştıran çalışmalarda kullanılabilir. Bu araştırmalar genomik araştırmalarla kombine edilebilirse, belirli bir hastada duyma kaybı beklentisinin hastaya özel olarak belirlenebilmesine olanak verebilir. Yakın dönem fare çalışmaları 3d kültürde pluripotent kök hücrelerden iç kulak duyma hücreleri üretimin mümkün olduğunu gösterdi.

Oshima K, Shin K, Diensthuber M, Peng AW (2010) Oshima K, Shin K, Diensthuber M, Peng AW (2010). Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell 141: 704–716. Embriyonik ve iPS hücrelerden stereosilier bundlelarla hair-cell benzeri hücre oluşturma protokolü yayınlanmıştır. (Oshima ve ark.)

Merling RK, Sweeney CL, Chu J, Bodansky A (2015) Merling RK, Sweeney CL, Chu J, Bodansky A (2015). An AAVS1- targeted minigene platform for correction of iPSCs from all five types of chronic granulomatous disease. Mol Ther 23: 147–157.  Eğer hastada genetik duyma kaybı varsa iPS hücrelerinin hastaya verilmesinden önce iPS hücre transplantasyon terapisi, mutasyonun gen terapisiyle onarımı gibi zorunlu bir adıma da ihtiyaç duyacaktır

Kepekçi AH, Özturan OÖ, Köker MY Kepekçi AH, Özturan OÖ, Köker MY. Pluripotent stem cells and their use in hearing loss. Turkish Journal of Biology 2016: 40. Kök hücrelerin doğal görevleri hasta veya yaşlı hücreleri yenilemek olduğundan, bilim adamları birçok çeşit tıbbi rahatsızlığı olan hastalara, kök hücre tedavisi uygulamayı düşünmektedirler. Buradaki fikir, hastaya kök hücre veya kök hücreden elde edilmiş, farklılaşmış hücreler vererek, kök hücrelerin iyileştirici doğal özelliklerinden faydalanıp hastayı yeniden sağlıklı yapmaktır.  Hepimizde bulunan doğal kök hücre popülasyonunun vücudumuzdaki hasarları onarmaktaki kapasitesi sınırlıdır. FDA onayı ile tedavi edilen kan kanseri ve bazı kan hastalıkları dışında, şeker hastalığı yani Tip 1 Diyabet, Cerebral Palsy, Autizm, işitme kaybı ve kafa travması ile ilgili insan çalışmaları da özel izinle FDA onayı almış bazı kliniklerde yapılıyor. Ayrıca bu tür bir tedavi sınırlı yeteneği olan kök hücreler ile kemik ve deri greftleri yapımlarında da başarılı ve güvenli bir şekilde uygulanıyor. Pluripotent hücrelerle hücresel tedavi ve regeneratif tıp günümüzde gelişim halindedir ve biz KBB de önemli bir araştırma alanı olan, iPS hücre teknolojisiyle duyu kaybının biyolojik tedavisi konulu yazımızla bu konuya dikkat çekmek istedik.

TEŞEKKÜRLER dr.kepekci@gmail.com