Prof. Dr. Akgün YAMAN MİKROBİYOLOJİ AD

... konulu sunumlar: "Prof. Dr. Akgün YAMAN MİKROBİYOLOJİ AD"— Sunum transkripti:

1 Prof. Dr. Akgün YAMAN MİKROBİYOLOJİ AD
ANTİJENLER Prof. Dr. Akgün YAMAN MİKROBİYOLOJİ AD

2 ANTİJEN NEDİR ? Organizmaya girdiğinde , kendisine karşı bir bağışık yanıt oluşmasına yol açan ve bu cevap sonucunda oluşan ürün ile özgül olarak birleşebilen maddelere antijen denir. Bağışık yanıt hücresel, humoral veya sık olarak ikisi bir arada olabilir. Antikor cevabı oluşturabilme yeteneği olan antijenler genel olarak “makromoleküllerdir’’.

3 ANTİJEN NEDİR ? Proteinler veya polisakkaritlerden oluşup bazen nükleik asitler ve lipitler de antijen olarak davranabilirler. Kuvvetli antijenler genelde makromoleküler yapıda olmalarına karşın ; polisakkaritler , sentetik polipeptidler , ve diğer sentetik polimerler de uygun şartlar altında antijenik uyarıma neden olabilirler.

4 ANTİJENİK ÖZELLİKLERİ BELİRLEYEN FAKTÖRLER
A ) Yabancılık Bir madde, girdiği organizmanın yapısına yabancı ise antijenik özellik gösterebilir. Örn; Hemoglobin molekülü. Hb. bir pr.dir ve tüm memelilerde işlevi aynıdır.Fakat a.a .dizilişindeki farklılık nedeni ile bir türe ait hb. başka bir canlı için yabancıdır ve antijenik özellik göstermektedir.

5 A ) Yabancılık İki canlı evrimsel akrabalık yönünden birbirinden ne kadar uzaksa yapı maddeleri birbirine o kadar yabancıdır ve o kadar iyi antijen özelliği gösterir. Akrabalık ne kadar yakınsa antijen özelliği o kadar zayıflar hatta kaybolur. Bağışıklık mekanizması bozulursa canlıda kendine karşı da bağışık yanıt oluşur ve hastalıkla sonuçlanır. ( otoimmün hastalıklar )

6 B) Molekül Ağırlığı Bir molekülün antijenik özellik gösterebilmesi için minimum bir ağırlığa ihtiyaç vardır , bu ağırlık dalton kabul edilir. Çok küçük moleküller (amino asitler veya monosakkaritler) antijenik değildir. En kuvvetli antijenite gösteren maddeler molekül ağırlığı dalton ↑ olan pr. molekülleridir. İstisnaları : Glukagon 3600 dalton Dekstran dalton

7 C) Kimyasal Yapı Antijenik moleküller belirli kimyasal karmaşık yapı göstermelidir. Aynı tip a.a.ten yapılmış homopolimerler a.a. sayısı önemli olmaksızın iyi antijenik yapı göstermezler. İki-üç çeşit a.a.ten oluşan kopolimerler çok iyi antijenik yapı gösterirler. Kimyasal yapıda ne kadar çok determinant bulunursa, antijenik özellik o kadar kuvvetli olur.

8 D) Konağın Genetik Yapısı
Ag’lere karşı gelişen özgül cevabın konağın genetik yapısı ile sıkı bir ilişkisi vardır. Aynı ajana karşı antijenik cevap türden türe değişebileceği gibi, ırktan ırka da değişim gösterir.

9 E) Antijenin Dozu Ve Veriliş şekli
Bir Ag’nin bağışık cevap oluşturma etkisi veriliş dozu ve şekline büyük ölçüde bağlıdır. Bazı Ag’ler i.v. verildiğinde antikor cevabı uyandırmadığı halde, derialtı yolla ve adjuvanla karıştırıldığında uyandırabilir.

10 E) Antijenin Dozu ve Veriliş yolu
Ag miktarı çok az ise immün sistem uyarılamayabilir, miktar çok fazla olursa da immünolojik felç gelişebilir. İyi bir bağışık yanıt almak için Ag’nin uygun dozda, uygun yolla ve uygun zaman aralıkları ile verilmesi gerekir. (aşılamada )

11 G) Çözünürlük ve metabolize olma
F) Antijenin sertliği Ag molekülünün belli bir sertliği olmalıdır. - Lipit ve jelatin iyi antijen değillerdir. - Protein, CHO (oldukça katı) iyi antijendir. G) Çözünürlük ve metabolize olma Antijenite, verilen maddenin organizmada çözünürlüğü ve metabolize olması ile artar. - Naylon, teflon, poliakrilamid gibi maddeler makromolekül olmasına karşın metabolize edilemez ve antijenite gösteremezler. Bunlara karşı bağışık yanıt oluşmaz.

12 H) Emilim ve Atılım Hızı
Antijenik maddenin immün sistemi uyarabilecek bir süre organizmada kalabilmesi antijenitesini etkiler. Genelikle yavaş emilen ve organizmadan yavaş atılan maddelerin immün sistemle etkileşimleri daha iyi olduğundan antijeniteleri daha güçlüdür. Hızla emilip hızla vücuttan atılan maddeler iyi Ag değildir.

13 I) Elektrik Yükü İyi bir antijenik madde elektrik yükü taşımalıdır. Elektrik yüklü gruplar moleküle, sulu ortamda eriyebilirlik kazandırarak çevre ile daha iyi temas etmelerini dolayısıyla immün sistem hücrelerine daha kolay girmelerini sağlayan hidrofilik nitelik kazandırır.

14 J) Adjuvant Maddelerin Kullanılması
Bazı zayıf Ag’ler, organizmada kuvvetli antijenik uyarım göstermesi için adjuvant denilen maddelerle karıştırılarak verilir. Bu karışımın aktivasyonu sonucu zayıf Ag’lere verilen immün cevap da arttırılmış olur. Adjuvantlar : Ag’nin makrofaj içinde depolanması Ag’nin yıkılmasında ki gecikmeyi Ag’nin etki süresinin uzamasını T ve B lenfositleri ile makrofajları aktive eder.

15 Adjuvant etkili maddeler
-Potasyum alüminyum fosfat - Alüminyum sülfat - Alüminyum hidroksit - Kalsiyum fosfat - Madeni yağlar - Lanolin - Vitamin E - Bakteriler-Bakteriyel ürünler:B.pertusis, C.parvum, BCG

16 FREUND ADJUVANTI Laboratuvar hayvanlarında immün cevabın arttırılması için en çok kullanılan adjuvanlardan biridir. Tam olmayan freund adjuvanı (incomplete freund’s adjuvant) : Lanolin-parafin karışımı olup, özgül antijenle karıştırılarak konağa verilir. Tam freund adjuvanı (complete freund’s adjuvant) : Tam olmayan freund adjuvanına ölü tüberküloz basili eklenmiştir.Ag karıştırılarak konağa verilir.

17 ANTİJENİK DETERMİNANT
Kuvvetli antijenik maddeler büyük moleküller olmasına karşın, yalnız belirli bir bölgesi antikora bağlanabilir. Antijen antikor bağlanmasında, antijene ait bölgeye antijenik determinant denir.

18 Ag.ik determinantlar Nispeten büyük moleküllerin çok küçük parçalarıdır ve kendi başlarına Ab. oluştururlar. Bu bakımdan haptene benzerler. Ag.ik determinantın büyüklüğü: Proteinler için 5-10 a.a. Polisakkaritler için 5 heksoz ünitesi Ölçüm olarak 15x15 nm.

19 Bir antijendeki epitopun sayısı molekülün büyüklüğü ve kompleksliğine bağlıdır. -Yumurta albümininde 5 ag.ik determinant Tiroglobulin molekülünde 40 ag.ik determinant -hapten de ise 1 taneye iner

20 HAPTEN Bazı küçük moleküller kendileri Ag olmadıkları halde bir taşıyıcı proteine bağlanarak Ag özelliği kazanırlar ve taşıyıcı protein ile değil kendileri ile spesifik olarak birleşen antikorlar oluştururlar.Bu maddelere hapten denir Proteinlere bağlanmış haptenler antijenik determinant olarak iş görür.Bağlanılan proteine ise taşıyıcı (carrier) denir. Native determinants Haptenic determinants

21 HAPTEN Bazı ilaçlar veya onların yıkım ürünleri vücuttaki bazı yapılara bağlanıp onların sanki yeni bir antijenik yapı gibi immün sisteme sunulmalarına yol açar.Antikor bu antijenle birleşerek o yapının yok olmasını sağlar. Native determinants Haptenic determinants

22 HAPTEN Örn, metildopa, quinidin, aspirin, digitoksin gibi ilaçlar özellikle trombositler üzerine bağlanır ve yeni bir haptenik yapı oluşturarak antikor yapımına neden olur. Ab → trombositlere bağlanır → parçalanır → fagositoz → idiopatik trombositopenik purpura (İTP) Antijenik determinant grup ile antikorun bağlanma yüzeyi, yapı olarak birbirine tam uyan bir görünümdedir.(anahtar-kilit)

23 HAPTEN Bazı kimyasal maddeler (dinitrofenol), N-asitler - Laktamaz
Bazı ilaçlar-Penisilin (6APA) Penisilonik asit

24 KİMYASAL BİLEŞİKLERİN ANTİJENİK ÖZELLİKLERİ
Proteinler : En iyi antijen özelliği gösteren kimyasal bileşiklerdir. Karbonhidratlar : Polisakkaritler Ag özelliğindedir. Mono ve disakkaritler antijenik değildir, hapten özelliği gösterir. Yağlar : Saf halde iken antijenik özellikleri yoktur.Protein ve polisakkaritle birleştiklerinde Ag özelliği kazanabilirler.

25 Nükleik asitler : Saf halde iyi Ag değildir
Nükleik asitler : Saf halde iyi Ag değildir. Parçalandıklarında veya protein ile birleştiklerinde antijenik özellik kazanabilirler. İlaçlar ve çeşitli kimyasal bileşikler : Küçük molekül ağırlıklı ve basit kimyasal yapıda olmalarına rağmen pek çok ilaç ve kimyasal maddeye karşı bağışık yanıt oluşabilir.Çünkü bu maddeler girdikleri canlının proteinleri veya bazı kan hücrelerinin üzerine yapışarak antijenite kazanabilirler. Protein > CHO > Nükleik asitler > Lipitler > İlaçlar

26 ÇAPRAZ REAKSİYON Bir antikoru oluşturan antijenden başka veya benzer yapıdaki antijenle tepkime vermesine çapraz reaksiyon denir. Antikorun oluşmasını sağlayan antijene homolog antijen Çapraz reaksiyon veren Ag ise heterolog antijen denir. Evrimsel yakınlığı ve akrabalığı olmayan ve birbirine hiç benzemeyen türlerde, ortak epitoplara sahip olan antijenlere forssmann antijenleri ( heterofil antijen ) denir. Paul bunnel testi

27 Alloantijen (isoantijen)
Aynı türden olan ancak, genetik özellikleri bakımından birbirinden farklı bireylerde farklı bazı Ag’ler vardır.Bu Ag’ler tür içinde nakledildiğinde özgül Ab cevabı oluşturur.Bu Ag’lere alloantijen (isoantijen) denir. Örn : Kan grubu Ag, HLA, Nötrofil ve trombosit Ag Canlıların evrimsel yakınlığına göre tanımlanan Ag çeşitlerinin, organizmada oluşturduğu Ab’larda aynı isimle ifade edilir. Heterofil antikor, izoantikor (alloantikor)

28 KAN GRUBU ANTİJENLERİ

29

30 KAN GRUBU ANTİJENLERİ Landsteiner 1901’de eritrositlerdeki isoantijenleri bulmuştur. Kanın yapısal ve bireysel özelliklerinin eritrositler üzerindeki isoantijenlere bağlı olduğunu ve bütün insanların A, B, C olarak üç gruba ayrıldığını ileri sürmüştür. Bugün C grubu → O grubu → A, B, O ve AB olarak isimlendirilmektedir.Bu sisteme ABO sistemi denmektedir. 1937’de Landsteiner ve Wiener → Rh faktörünü bulmuşlardır.

31 KAN GRUBU ANTİJENLERİ A ve B Ag leri, intra-uterin hayatın 37. gününden itibaren oluşmaya başlar. Ama genelikle yenidoğanda anti-A ve B antikorları bulunmaz veya titreleri çok ↓ , hayatın ayında belirli seviyeye çıkar ve yaşlarda en yüksek seviyeye ulaşır. Kalıtımla geçen A ve B Ag leri dominant, O Ag resesiftir. İnsan hücreleri diploid olduğundan, kan grup Ag leri genlerde çift olup, hücrelerde tek kalacak şekilde bölünür.

32 KAN GRUBU ANTİJENLERİ ABO Ag’leri membran Ag’leri olarak ;
- Eritrosit ve trombositlerin yüzeyinde - Vasküler epitel hücreleri - İntestinal - Servikal - Meme bezi hücrelerinde bulunur. Plasma, tükrük, süt, idrar ve gaita da ise çözünmüş halde bulunur.

33 KAN GRUBU ANTİJENLERİ Eritrosit yüzeyinde bulunmayan Ag’lere karşı serumda kuvvetli reaktif Ab’lar vardır. Bu özellikler ABO sistemini transfüzyon ve doku naklinin en önemli Ag’i yapmaktadır. Bu sistemde A ve B antijenik maddelerinden başka serumda bulunan ve bu antijenlerle reaksiyon veren antikorlar da (isoantikorlar) bulunur. Eritrositlerdeki isoantijen ne ise serumda ona karşı Ab yoktur.

34 KAN GRUBU ANTİJENLERİ

35 KAN GRUBU ANTİJENLERİ İSOANTİJEN İSOANTİKOR A Anti-B B Anti-A AB - O

36 Aglütinojenler A grubu A aglütinojen B grubu B aglütinojen AB grubu
AB aglütinojen O grubu Aglütinojen yok

37 KAN GRUBU ANTİJENLERİ

38

39 KAN GRUBU TAYİNİ Eritrosit tipi serumlar Anti-A Anti-B A + - B AB O

40 KAN GRUBU ANTİJENLERİ Yanlış kan transfüzyonu yapıldığında alıcının plazmasındaki aglutininler, vericinin aglutinojenleri ile etkileşir. Sonuçta eritrositler aglutine olur,kompleman katkısı ile de lizise uğrar. Anti-A antiserumu ile aglütinasyon Aglütinasyon olmayan Anti-B antiserumu

41 Rh SİSTEMİ Landsteiner ve Wiener 1940’ta Rhessus cinsi maymun eritrositleri ile bağışıklanmış tavşan serumunun, beyaz ırktan insanların % 85’inin eritrositlerini aglutine ettiğini görmüş. Eritrositlerinde Rh Ag varsa Rhessus pozitif, yoksa Rhessus negatif ismini vermişler. Sonra eritrositlerde ki bu Ag’ler D Ag olarak isimlendirilmiş. Rh sistemi en kompleks eritrosit antijen sistemlerinden birisidir.

42 Rh SİSTEMİ Rh sisteminde C, c, D, d, E, e olmak üzere altı majör faktör vardır. En önemlisi D faktörüdür. 11.gebelik haftasından itibaren oluşmaya başlar. Rh (+)→D faktörü var Rh (-)→D faktörü yok Uyuşmazlıkların % 85’inden D faktörü sorumludur.

43 Rh SİSTEMİ Rh’a göre daha zayıf reaksiyon veren faktörler C ve E .
Normal olarak insan serumda ki Rh sistemine karşı Ab bulunmaz. Rh pozitif kişi eritrositlerinde Rh faktörlerinden bir veya bir kaçı bir arada bulunur. Rh negatif kişilerin eritrositlerinde bu faktörler bulunmadığı gibi serumlarında da anti-Rh isoaglutinini bulunmaz. Tekrarlayan kan nakilleri ve gebelikte isoimmünizasyon sonucu anti-Rh Ab bulunur ve kan uyuşmazlığına neden olur.

44 Rh SİSTEMİ Anti-D Ab → beyaz ırkın % 85’inde aglutinasyon
Anti-C Ab → beyaz ırkın % 70’inde aglutinasyon Anti-E Ab → beyaz ırkın % 30’u ile aglutinasyon Rh (-) → eritrositlerinde Rh sistemine ait hiç faktör yoktur.

45 Rh UYGUNSUZLUĞU Rh(-) olan bir kişiye ABO kan grubu uygun olmak şartı ile Rh(+) kan verilecek olursa 1. verilişte →reaksiyon görülmez. Fakat böyle Rh(-) kişiye verilen Rh(+) kan eritrositlerinde ki Rh faktörleri kişiyi immünize etmeye başlar ve serumda anti-Rh isoantikorlarının çıkmasına sebep olur. Tekrarlanırsa, anti-Rh antikor titresi ↑ verilen Rh(+) eritrositlerle reaksiyona girecek titreye ulaşırlar. Sonuçta uygunsuz kan nakli sırasında görülen çeşitli klinik tablolar ortaya çıkar.

46 Rh UYGUNSUZLUĞU

47 Rh UYGUNSUZLUĞU Baba Rh (+) Anne Rh (-) Çocuk Rh (+)
Yenidoğan hemolitik hastalığı ( Erytroblastozis fetalis ) Hidrops fetalis neonatorum İkterus gravis neonatorum

48 Rh UYGUNSUZLUĞU Rh antikorları bazı istisnalar dışında immün orijinli IgG yapısında Ab’lardır. IgA ve IgM tipi Rh antikorları nadirdir.

49 DOKU UYGUNLUK ANTİJENLERİ ( HUMAN LEUCOCYTE ANTİGENS = HLA )
Lökositlerde olduğu gibi birçok doku ve hücrelerde, bazı vücut salgılarında bulunur. Kalıtımla geçer. Transplatasyonda aktarılan dokunun atılması veya kabulünde görev alır. HLA’nın esas görevi, immün cevapta Ag’nin bir hücreden diğerine sunulmasına katkıda bulunmaktır.

50 HLA Vücuda giren antijenler mikrobik, transplantasyon Ag , tümör veya oto-immünojenik uyarım olsun, önce fagositoz ve/veya Ag sunumu yapabilen hücreler tarafından işlenmesi ve T lenfositlerine sunulması gerekir. ASH Ag i T lenfositlerine sunarken HLA Ag lerini kullanır. Aynı şekilde T lenfositleri de yüzeylerinde ki HLA Ag leri sayesinde Ag i tanır.

51 HLA En fazla lökosit, trombosit ve lenfositlerde bulunur.
Karaciğer, dalakta fazla, kas ve beyin dokularında az, yağ dokusu ve eritrositlerde hiç bulunmaz. HLA Class I Tüm çekirdekli hücrelerin yüzeyinde bulunur.

52 HLA HLA Ag lerinin 4 temel grubu vardır : HLA-A HLA-B HLA-C HLA-D
-HLA-DP - HLA-DQ -HLA-DR

53 HLA Transplantasyonda en önemlisi HLA-B
İnsanda HLA antijenlerini kontrol eden MHC (Major Histocompatibility Complex) genleri vardır. Bunlar 6 nolu kromozomun kısa kolu üzerindedir. 3500 kb kadar yer tutar( Total genomun 1/3000’idir.) MHC sistemi sadece transplantasyon için değil lenfositlere antijenlerin tanıtılması gereken durumlarda da gerekli ve önemlidir.

54 Human leukocyte antigen (HLA) kodlayan gen bölgesi insanda 6
Human leukocyte antigen (HLA) kodlayan gen bölgesi insanda 6. kromozom üzerinde bulunur.

55 HLA Moleküler yapılarına göre 3 tip MHC Ag vardır : Class -I Class -II
Class –III Bu bölge sentromerden başlayarak ; - Class II Class III Class I Isı şok proteinleri (HSP-70) Lenfotoksin (LT) Nekrozis faktör (TNF) Class-I ve Class-II moleküller; - Antijenlerin tanıtımında önemli - Yapıca benzerlik gösteren glikoprotein yapısında - Vücut hücrelerinde dağılımı ve yapıları farklı olan moleküllerdir.

56

57 MHC Moleküllerinin Dokulara Göre Dağılımı
MHC Class I MHC Class II T Hücreleri B Hücreleri Makrofajlar Diğer Antijen Sunan Hücreler Timus Epiteli Nötrofiller Hepatositler Böbrek Beyin Eritrositler +++ + - +/- ++

58 MHC MOLEKÜLLERİNİN YAPISI
Class – I MHC Molekülü 1900 kB ‘e yakın, MHC içerisinde en büyük yer kaplayan bölge. Santromerden başlayarak; - HLA-B - HLA-C - HLA-A

59 HLA WHO 1991’e göre: HLA-A  A1, A2.....A74 (27)- 40
HLA-B B5,B7....B7801 ve Bw HLA-C Cw1, Cw2.....Cw10 (10) HLA-DR DR1, DR DR HLA-DQ DQ1, DQ DQ9 (9) HLA-DP  DPw1, DPw2.....DPw

60 The graph below indicates the numbers of alleles named since 1987, up to the end of March 2013.

61 *allele numbers from the IMGT/HLA
Class I Alleles Class II Alleles Gene # Alleles A 2188 B 2862 C 1746 E 11 F 22 G 50 Gene # Alleles DPA1 36 DPB1 159 DQA1 49 DQB1 193 DRB 1386 *allele numbers from the IMGT/HLA database, Jan. 2013

62 HLA ALLEL VE HAPLOTİPLERİ BLOK HALİNDE KALITILIRLAR
Anne Baba A 9 10 B 11 12 C 13 14 DR 15 16 2 1 3 4 5 6 7 8 Çocuk 1 Çocuk 2 Çocuk 3 Çocuk 4

63 HLA Her bireyde Class-I ve II için
Anneden 1A, 1B, 1C, 1DR, 1DQ, 1DP Babadan 1A, 1B, 1C, 1DR, 1DQ, 1DP Ancak anne ve baba arasında benzer veya ortak Ag.ler varsa (homozigot) bireydeki allel sayısı azalabilir.

64 MHC Lokusundaki Genler ve Görevleri
MHC Bölgesi Gen ürünleri Doku Yerleşimi Görevi-Fonksiyonu Class I HLA-A, HLA-B, HLA-C Tüm çekirdekli hücreler -Tanıma - anormal veya infekte olmuş hücrelerin sitotoksik T hücreleri tarafından öldürülmesi Class II HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP B lenfositler, monositler, makrofajlar, dendritik hücreler, aktive T hücreleri, aktive endotel hücreleri, deri (Langerhans hücreleri) Helper T hücreleri tarafından yabancı antijenlerin tanınması Class III Kompleman C2, C4, B Plazma proteinleri Ekstrasellüler patojenlere karşı savunma Sitokin Genleri TNFa, TNFb Hücre büyümesi ve farklılaşması

65 HLA ANTİJENLERİNİN KULLANILDIĞI ALANLAR
- babalık tayini, - transplantasyon, -hastalık yatkınlığı -antropolojik araştırmalarda önem taşımaktadır. •Bugün en çok kullanıldığı alan transplantasyon immünolojisidir. • Doku atılım reaksiyonlarında rol oynayan bu antijenler doku uygunluk ya da transplantasyon antijenleri olarak ta adlandırılmaktadırlar.

66 TRANSPLANTASYONDA HLA ANTİJENLERİ
• Organ ve doku nakli planlanan alıcı ve vericiler için öncelikle hasta ve hastanın hayatta olan birinci dereceden yakınlarında HLA-A, B ve DR doku gruplarının tiplendirilmesi gerekmektedir. • Daha sonra uygun olanlarda HLA-C, DQ ve/veya DP doku grupları çalışılmalıdır. •HLA-C, DQ ve/veya DP doku grupları bazı doku ve organ transplantasyonları için yardımcı olsa da zorunlu değildir.

67 TRANSPLANTASYONDA HLA ANTİJENLERİ
Kemik iliği transplantasyonunda nakledilen dokunun reddedilmemesi için en önemli parametrelerden biri doku gruplarının tamamının (HLA-A, B, C, DR, DQ, DP) uygun (full-match) olmasıdır . Solid organ nakillerinde ise yine en önemli parametrelerden biri her doku grubundan en az birer tanesinin uygun olmasıdır.

68 HLA ANTİJENLERİNİN TİPLENDİRİLMESİNDE KULLANILAN TESTLER
PCR tabanlı tipleme Serolojik tipleme

69 HLA Tiplendirme 1. Seroloji (Lenfositotoksisite testi) 2. PCR tabanlı
a) PCR-SSP (sequence-specific primers) b) PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides) c) DNA dizi analizi(sequence-based typing, SBT)

70 Spesifik Anti-HLA Antikorları
1- Serolojik Tipleme Spesifik Anti-HLA Antikorları Lenfositler Kırmızı: Ölü Yeşil = Canlı + rabbit complement

71 PCR-SSP Primers recognizing different alleles are supplied in a 96-well plate format. Reagent blank Amplification control Allele-specific product 96 well PCR plate Agarose gel

72 PCR TABANLI TİPLEME a) PCR-SSP
(SSP= Sequence-specific primer) Bu yöntemde allele spesifik primerler kullanılarak HLA alleleleri amplifiye edilmektedir. Amplification controls Allele-specific product SSP matches allele Amplification SSP No amplification SSP SSP does not match allele

73 b-) PCR-SSO (Luminex) Bu teknikte aynı reaksiyon tüpünde bulunan ve 100 farklı renkte floresan veren boncuğun her birine farklı problar bağlanarak floresan ölçümüne dayalı tiplendirme yapılmaktadır.

74

75 Itoh et al. Immunogenetics (2005) 57: 717–29

76 c) DNA DİZİ ANALİZİ (Sequence-based typing, SBT)
Sekans temelli doku tipleme ile yüksek çözünürlüklü sonuçlar elde edilmektedir. Bu yöntemde önce PCR ile polimorfik bölgeler amplifiye edilir, sonra PCR ürünlerinin nükleotid dizileri belirlenir. HLA-B Forward PCR primer Sequencing primers Reverse PCR primer

77 HLA Allellelerinin Adlandırılması (Nomenclature)
MHC gen bölgesinin her lokusunda her biri farklı HLA antijenlerinden sorumlu allel genler bulunur. Her lokustaki bu alleller, HLA harflerinden sonra lokus ve numara yazılarak ifade edilirler.(HLA-A1 gibi) HLA isimlendirmesinin yapıldığı ilk yıllarda bir lokusta henüz tam olarak spesifiye edilmemiş bir allel, rakamdan önce workshop kelimesinin baş harfi olan küçük “w” harfi yazılarak ifade edilirdi. (HLA-DRw1 gibi) Daha sonraki çalışmalarda kesin olarak tanımlanır ise ’’ w’’ harfi elimine edilirdi. (HLA-DR1 gibi)

78 -Artık gen dizilerinin tanımlanması nedeniyle, “w”harfi kullanılmasına gerek kalmamıştır.
- HLA antijenlerinden molekül üzerinde, tek bir allel ile tanımlanan antijenlere özel HLA antijenleri denilir. (ör:HLA-B35, HLA-B7 ) - Her biri özel HLA antijeni içeren moleküllerde genel olarak bulunan antijenlere ise genel HLA antijenleri adı verilir. -Genel HLA antijenlerine örnek olarak HLA-Bw4 HLA-Bw6 verilebilir. -İsimlendirme de “w” harfi yalnızca HLA-Bw4 HLA-Bw6 için kullanılmaktadır.

79 Birbirleri ile yakın ilişkileri olan 2 veya 3 HLA
- HLA antijenlerinin yakın özgüllük gösteren antijenik tiplerine “splits” adı verilir. Birbirleri ile yakın ilişkileri olan 2 veya 3 HLA antijeni tek bir genel HLA antijeni olarak düşünülür. -Örneğin; HLA-A25(10) ve HLA-A26(10), HLA-A 10’un splitleri olan A25 ve A26’ yı içerirler HLA-A10, molekül üzerinde HLA-A25 ve HLA-A26 özel antijenlerini içeren genel antijen olarak düşünülebilir.

80 CREG ; cross reactive group
-Bazı HLA antijenleri kendi üyelerinin aralarında çapraz reaksiyon verdiği gruplara ayrılmıştır. Bu gruplara cross reaktif grup denir. Ör; (HLA-A25, A26, A30, A31, A32, A33, A68, A69, B15, B35, B51 B52, B53)

81 HLA Allellelerinin Adlandırılması (New Nomenclature-2010)

82 HLA Allellelerinin Adlandırılması (Nomenclature)
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) nomenklatür komitesi tarafından önerilen standart isimlendirmeye göre; HLA-DRB1 Gen bölgesi Gen lokusu Alt bölge b-zinciri polipeptidi

83 HLA Allellelerinin Adlandırılması (Nomenclature)
HLA-DRB1*01 Gen bölgesi Gen lokusu Alt bölge b-zincir polipeptidi Allel grubu

84 HLA Allellelerinin Adlandırılması (Nomenclature)
HLA-DRB1*01:03 Gen bölgesi Gen lokusu Alt bölge b-zincir polipeptidi Allel grubu Spesifik allel

85 Bazı Otoimmün Hastalıklarda HLA İlişkisi

86 MHC Molekülleri ve Hastalıklarla İlgisi
HASTALIK İLGİLİ HLA ANTİJENİ ORTALAMA RÖLATİF RİSK Hematokromozis Narkolepsi Ankilozan spondilit Reiter sendromu Psoriatrik spondilit Akut anterior üveit Behçet hastalığı Romatoid artrit Pausiartiküler romatoid art. Kronik hepatit Sistemik lupus eritematozus Sjögren sendromu İnsulin bağ. Diabetes mellit Goodpasture Multiple skleroz Myastenia gravis Hodgkin hastalığı Preeklampsi A3 DR2 B27 B5 DR4 DR5/DP2 B8 DR3/C4 DR3 DQ8/DR3/4 DQ57 DR2/B8/A2 B18 - 81.8 40 10 8 3.3 6.4 7 17.1 5.6 31.8 0.1 20 6

87 Class – I MHC Molekülü Class I molekülleri fizyolojik rollerine uygun olarak bütün çekirdekli hücrelerde bulunur. Bir Ag’nin CD8 (killer) T lenfositlerce tanınabilmesi için class I molekülüne tutunmuş olması gerekir. (HLA restriksiyonu)

88 Virus hücreyi enfekte ettiği zaman,
Viral Ag ler peptid fragmanlarına ayrılır. Class I moleküllerince bağlanarak CD8 T hücrelerine sunulurlar.

89 Class – I MHC Molekülü İki farklı polipeptid zincirinden oluşur.
A ) α zinciri ve ona non kovalen bağlarla bağlı B ) β2-mikroglobulin denen proteinden oluşur. Arada da disülfit bağları mevcut.

90 Class – I MHC Molekülü Class I , 4 bölgeden oluşur :
1 ) Ekstraselüller peptid bağlayan bölge 2 ) Ekstraselüller immünglobulin benzeri bölge 3 ) Transmembran bölge 4 ) Sitoplazmik bölge

91 MHC Tek bir peptid fragmannı bağlar Sadace peptidleri bağlar
Mikrobik ya da kendi proteinlerden kaynaklanan antijenleri sunar.

92

93 1- PEPTİD BAĞLAYAN BÖLGE
MHC’nın en önemli görevi; yabancı proteinleri bağlamak ve T lenfositleri tarafından tanınmasını sağlamak Bu bölge α1 ve α2 yarı parçalarından oluşur. β bant yapısında 8 zincir, α heliks yapısında 2 zincir kavuk şeklinde üç boyutlu yapı meydana getirir. Doğal globuler proteinler küçük parçalara bölünerek Class I MHC molekülüne bağlanır.

94 1- PEPTİD BAĞLAYAN BÖLGE
Her MHC molekülü ancak bir peptid bağlayabilir. Bağlanan peptidler 8-11 aminoasitten oluşur. Bağlanan peptidler endojen kökenlidir. Bu bölgenin bir kısmı da T hücre reseptörü ( TCR ) ile etkileşme girer.

95 2- İMMÜNGLOBULİN BENZERİ BÖLGE
3 bölgesi, α2 segmentinin COOH terminalinden başlayıp plazma membranına kadar uzanır. α3 immünglobunlerin ana yapısına çok benzer. β bölgesi polimorfizm göstermeyen β2 mikrog. molekülüdür. Bu molekül yapısal olarak immunglobunlerin constant bölgesine benzer. β2 mikroglobulin solubl formda serum ve idrarda bulunur.

96 3- TRANSMEMBRAN BÖLGE MHC molekülünün hücre membranına tutunmasını sağlar. Class I molekülünün transmembran kısmı uzaklaştırıldıktan sonra hücre dışında kalan kısmı solubl halde bulunabilir.

97 4- SİTOPLAZMİK BÖLGE Yaklaşık 30 aminoasitten oluşur.
Sitoplazmik bölgenin bazı kısımları büyük ölçüde korunmuş olsa da molekülün değişkenlik gösteren kısımlarından biridir. Bu kısmın fosforilasyonu, transpeptidasyonu molekülün diğer hücre içi proteinlerle iletişimini sağlarken bazı kısımların delesyonuda Class I molekülün internalizasyonunu önler.

98 CLASS II MHC MOLEKÜLÜ Molekülleri sınırlı hücreler tarafından üretilir. İmmünokomponent hücreler B lenfositler Ag sunucu hücreler(makrofaj ve dendritik hücreler) Aktive olmuş T hücreleri

99 CLASS II MHC MOLEKÜLÜ Class II molekülünün fonksiyonu; immün cevabın başlangıcında aktif Ag peptid fragmentlerini CD4 T lenfositlerine sunmaktır. Sentromerden başlayarak; DP, DQ ve DR alt bölgeleri Organ doku naklinde en önemli olan HLA-DR’dir

100 CLASS II MHC MOLEKÜLÜ Birbirleri ile nonkovalent bağlarla bağlanmış 2 simetrik polipeptid zincirinden oluşur. α1 ve α2, β1 ve β2’den biraz daha büyük. Bu iki zincir faklı MHC gen bölgeleri tarafından kodlanır Polimorfiktirler.

101 CLASS II MHC MOLEKÜLÜ Class II MHC molekülleri de 4 fonksiyonel bölgeden oluşur. 1 ) Peptid bağlayan bölge 2 ) İmmünglobulin benzeri bölge 3 ) Transmembran bölge 4 ) Sitoplazmik bölge

102

103 1- PEPTİD BAĞLAYAN BÖLGE
Her biri 900 aa’den oluşan α1 ve β1 zincirleri bulunur. Peptid bağlayan kovuk bölgesi bulunur. Bu bölgenin açık olan uç kısmına (10-30 aa) peptidler bağlanır. Bağlanan peptidler ekzojen kökenlidir.

104 MHC Sınıf II Yolu

105 2- İMMÜNGLOBULİN BENZERİ BÖLGE
900 aa den oluşan α2 ve β2 zincirlerinden meydana gelir.

106 3- TRANSMEMBRAN BÖLGE Yaklaşık 25’er aa lik α2, β2 zincir segmentlerinden oluşur. Hücre membranına tutunmayı sağlar.

107 4- SİTOPLAZMİK BÖLGE Değişik uzunlukta olup işlevi tam olarak bilinmemektedir. Class II moleküllerinin hücre içi dağılımlarını ve diğer moleküllerle ilişkilerini belirlemede rolü vardır.

108 MHC moleküllerinin yapısı
TCR ile temas eder α1 α2 TCR ile temas eder α1 β1 Peptit bağlama oluğu Peptit bağlama oluğu β2 α3 Sınıf I molekülü α ve β-2 zincirlerinden oluşur. Amino ucundaki α1 ve α2 kıvrımları arasında aa uzunluğunda peptidlerin yerleşebileceği bir oluk bulunur. Bu oluğun tabanına peptid bağlanırken, oluğun yanları ve üst kısmı T hücre reseptörleri ile temas eder. Sınıf I moleküllerin polimorfik noktaları, yani MHC moleküllerinin bireyler arası farklılık gösteren aminoasitleri, α1 ve α2 altbirimlerinde bulunur. Zincirin α3 birimi sabittir, T hücre eş reseptörü CD8’in bağlanma noktasını taşır. Sınıf I deki bazı polimorfik noktalar oluğun tabanındadır, farklı MHC moleküllerinin peptid bağlama özelliklerinde değişkenliğe sebep olur. Bazıları ise oluğun tepesindedir, bu durum T hücre reseptörlerinin MHC molekülünü tanımasını etkiler. Sınıf II MHC molekülleri α ve β zincirinden oluşur. Her iki zincirin α1 ve β1 alt birimleri polimorfik noktalar içerir. Bunlar aa uzunluğunda peptidlerin yerleşebileceği bir oluk oluştururlar. Değişken olmayan β2 altbirimi T hücre eş reseptörü CD4’ün bağlanma noktasını taşır. Bağlanma noktaları önemlidir, çünkü T hücre aktivasyonu T hücre reseptörünün MHC ile sunulan peptidi tanımasını ve eş zamanlı olarak T hücre eş reseptörünün MHC ile bağlanmasını gerektirir. β2 α2 Sabit bölgedir. CD8’le temas eder Sabit bölgedir. CD4’le temas eder MHC-I Polimorfik noktalar α1 α2 zincirlerinde bulunur. MHC-II Polimorfik noktalar α1 β1 zincirlerinde bulunur. 108

109 MHC moleküllerinin özellikleri
Peptidlerin MHC moleküllerine bağlanması düşük afinitelidir. Ama kopma hızı saatler veya günler alır.

110 MHC moleküllerinin özellikleri
Düşük afinitenin sebebi: Antijene spesifik yapısal özelliğin olmayışı, böylece birçok peptid bağlanabilir. Peptidlerin uzun süreli gösterimi: T hücresi ile buluşma şansını yükseltme

111 Sabit peptid-MHC kompleksinin düzeni
ÖZELLİK MHC CLASS II MHC CLASS I Sabit peptid-MHC kompleksinin düzeni Polimorfik α ve β zincirleri, peptid Polimorfik α1, α 2 zinciri β2 mikroglobulin,peptid ASH tipleri Dendritik hücreler, mononükleer fagositler, B lenfositleri, endotelyal hücreler Bütün çekirdekli hücreler Duyarlı T Hücreleri CD4+ T hücreleri CD8+ T hücreleri

112 Peptid oluşumundan sorumlu enzimler MHC’nin peptid bağlama bölgesi
ÖZELLİK MHC CLASS II MHC CLASS I Protein Ag kaynagı Endozomal / lizozomal proteinler Sitozolik proteinler Peptid oluşumundan sorumlu enzimler Endozomal , lizozomal proteazlar Sitozolik proteazlar MHC’nin peptid bağlama bölgesi veziküler kompartman ER

113 CLASS III BÖLGESİ Kompleman sisteme ait olan C2, C4B, C4A ve faktör B genleri bu bölgede yer almaktadır. Yaklaşık 250 Kb uzunluktadır.

114 SÜPER ANTİJENLER Bilinenen en güçlü immünomodülatör ajanlardır.
Çok az yoğunlukta bile T hücrelerini uyarabilen moleküllerdir. Klasik Ag lerden farklı olarak hücre içi işlemden geçmeksizin, doğrudan MHC Class II moleküllerin Ag bağlayan kısmına yüksek affinite ile bağlanır. Class I moleküllerine affinite göstermezler.

115 SÜPER ANTİJENLER MHC II ile bağlanan süper antijenler CD4+ ve CD8+ T hücre reseptörleri ile ilişki kurabilir ve bunları uyarabilirler. Bu antijenler sadece α / β TCR’ünü taşıyan T-hücrelerini değil, aynı zamanda  / δ TCR’ünü taşıyan T-hücreleriyle de ilişki kurabilir. Ancak, β zincirinin V bölgesine (Vβ ) karşı afinitesi daha fazladır.

116 SÜPER ANTİJENLER Konvansiyonel peptid Ag lerin sunumu belli allelerle sınırlı kalırken süper antijenler birçok allelik formdaki Class II moleküllerine bağlanabilir. Çok sayıda T hücresi aktive edebilme özelliği vardır. Konvansiyonel Ag ler 1/104 -1/ 106 T hücresi (CD4+ ) ile ilişki kurar, süper antijenler % 5-30 gibi çok büyük bir bölümünü aktive eder. Süper antijenler B hücrelerini, ASH ’leri ve fagositleri de etkiler.

117 SÜPER ANTİJENLER Süper antijenler, ASH’ler tarafından işlenmeden MHC-II ile birleşerek hücre yüzeyine çıkarılır ve prezente edilirler. Süper antijenlerin, ASH’ler tarafından işlenmemesi ; Antijenik determinantların tahrip olmamasına Çok sayıda antijenik determinantın bir MHC ile sunulmasına, Uyarıma katılmasına Ve buna bağlı olarak da T-hücrelerinin çok fazla uyarılmasına neden olur.

118 SÜPER ANTİJENLER Hemen hemen hepsi bakteriyel ekzotoksinlerdir.
Bakteriyel süper antijenler içinde en iyi karakterize edilenler Stafilokok enterotoksinleri ve Streptokok pirojenik ekzotoksinleri olup Stafilokokal ve Streptokokal toksik şok sendromlarını tetiklerler.

119 SÜPER ANTİJENLER Kawasaki (gençlerde akut multi sistem vaskulit),
atopik dermatit ve psoriazis gibi enflamatuar deri hastalıklarının birer süper antijen olabileceği düşünülmektedir.

120 SÜPER ANTİJENLER Süper antijenler başlıca iki gruba ayrılırlar.
1) Endojenik süper antijenler (oto antijenler) 2) Ekzojenik süper antijenler (yabancı antijenler)

121 1- Endojenik süper antijenler
Sadece CD4+ T hücrelerini uyarırlar Tam olarak tanımlanamamışlardır. 2- Ekzojenik süper antijenler Üzerlerinde çok çalışmalar yapılmıştır Hem CD4 + hem CD8 + T hücrelerini uyarabilirler.

122 SÜPER ANTİJENLER Ekzojenik süperantijenler orijinlerine göre 4’e ayrılırlar. 1- Stafilokokal süperantijenler: a- Stafilokokal enterotoksinler (SE: SE-A, SE-B, SE-C1, SE-C2, SE-C3, SE-D, SE-E). Bu enterotoksinler arasında en etkili olanı T-hücre mitojeni SE-A’ dır. b-Eksfoliatif toksin (ExF-T): ExF-A, ExF-B insanlarda eksfoliasyon ve deride kabarcığa neden olurlar. c- Stafilokokal toksik şok sendrom toksin-1 (TSST-1 ): Çok kuvvetli T-hücre mitojeni olup, hipotansiyon, şok, ateş, organ disfonksiyonları ile ortaya çıkar ve ölümlere neden olur.

123

124 SÜPER ANTİJENLER 2- Streptokokal süperantijenler (SPE): S. pyogenes’in ekzotoksinleri SPE-A, SPE-B, SPE-C, SPE-D, M-proteini duyarlı kişilerde glomerulonefrit, kızıl, romatizmal ateş, artritise neden olurlar. 3- Mycoplasma arthritis (MAM): M. arthritis ’in MAM proteini insanlarda hastalık oluşturmamasına karşın, rodentlerde eklem yangılarına sebep olurlar. 4- P. aeruginosa ekzotoksin-A (PEA-A): P. aeruginosa insanlarda geniş spektrumlu klinik infeksiyonlara yol açar. Septisemi ve hipotansiyona neden olur.