BİYOTEKNOLOJİ VE GENETİK MÜHENDİSLİĞİ

... konulu sunumlar: "BİYOTEKNOLOJİ VE GENETİK MÜHENDİSLİĞİ"— Sunum transkripti:

1 BİYOTEKNOLOJİ VE GENETİK MÜHENDİSLİĞİ
Ömer YANIK Biyoloji Öğretmeni 2010 / BURSA

2 İnsan genomunun haritalanması ve dizi analizi , rekombinant DNA yapımı metotlarının
geliştirilmesi ile başlayan DNA teknolojisindeki ilerlemelerle mümkün olmuştur. Rekombinant DNA yapım yöntemleri , aynı zamanda , pratik amaçlar için genlerin doğrudan değiştirlmesi ile uğraşan genetik mühendisliği için de temeldir. Bilim adamları , DNA teknolojisi kullanarak rekombinant DNA yapabilir ve daha sonra bu DNA’yı replike eden ve DNA daki genleri , istenen bir proteini üretmek üzere başka hücrelere aktarabilir. Geniş bir terimle biyoteknoloji , canlıların ya da onların öğelerinin yararlı ürünler yapmada kullanılmalarıdır.

3 DNA KLONLANMASI Bilim adamları özgül genleri doğrudan çalışabilmek için , iyi tanımlanmış gen boyutundaki DNA parçalarının çok sayıda benzer kopyasının elde edildiği yöntemlerin geliştirilmesine gereksinim duymuştur.Buna gen klonlanması adı verilir. Bir insan geni , bir kromozomal DNA molekülünün sadece 1/ ’ini oluşturacak derece de küçüktür. DNA parçalarının klonlanması için günümüzde bakteri plazmitleri kullanılmaktadır. Plazmitler bakterilerde bulunan ana kromozomdan başka ek genleri içeren küçük DNA parçalarıdır.

4 Bilim adamı, bakteriden plaz
mid DNA yı ve istenen geni içeren DNA yı diğer hücreden izole eder. Geni bulunduran DNA parçası plazmide takılır ve rekombi nant DNA yapılır. Rekombinant plazmid tekrar bakteri hücresine aktarılır. Bu hücre kültürde çoğaltıla rak klonlanmış olur. Gen klonlanmasında kritik aşama istenen geni taşıyan bakteri klonlarının tespitidir. Klonlanmış bakteriler değişik amaçlarla kullanılabilirler.Örneğin büyümeden sorumlu hormonun büyük oranlarda üretimi , bu hormondan sorumlu geni taşıyan bakteriler tarafından yapılmaktadır. ANİMASYON

5 Restriksiyon enzimleri , rekombinant DNA yapımında kullanılır
Restriksiyon enzimi altı baz çiftlik özel bir diziyi tanır ve bu dizi içerisindeki şeker-fosfat iskeletin de kesimler yapar. Komplementer “ yapışkan uçlar” her iki zinciri hidrojen bağları ile bir arada tutacak ve bu zincirler orjinal şekillerinde veya yeni , rekom binant düzenlemelerde geçici olarak tekrar bir araya gelecektir. DNA ligaz ise , kovalent bağ oluşumunu katalize ederek zincirleri uçlardan birbirine bağlar.Eğer birleşen parçalar farklı kaynaklardan geliyorsa sonuçta rekombinant DNA meydana gelir. ANİMASYON

6 Genler , rekombinant DNA vektörleri içerisinde klonlanabilir
Bakteriyel plazmitler klonlama vektörü olarak kullanılır.Bakteriler DNA’nın kolaylıkla izole edilebilmesi ve benzeri hücrelere tekrar aktarılabilmesi ile ilgili kolaylığı nedeniyle yaygın şekilde gen klonlanması amacıyla kullanılırlar. Bakteri kültürleri aynı zamanda hızlı bir şekilde çoğalarak taşıdıkları genleri replike ederler. 1)Vektör ve gen kaynağı DNA’nın izolasyonu Gen kaynağı olarak insan doku hücrelerinden elde edilir.Plazmit ise E.coli bakterisin den elde edilir ve daha sonra doğrulamada kullanılacak iki gen bulundurur: amp , konukçusu olan E.coli hücresine ampisilin antibiyotiğine karşı direnç kazandırır ve lac Z , laktoz şekerinin hidrolizini katalizleyen B-galaktozidaz enzimini kodlar.Plazmit kullanılan restriksiyon enzimi içi tek bir tanıma dizisi bulundurur ve bu dizi lacZ geni içerisinde yer alır. 2)DNA’nın vektöre takılması Enzim, plazmid DNA’yı tek bir restriksiyon bölgesinden lacZ genini bozarak keser. İnsan DNA’sını beinlerce DNA parçası oluşturacak şekilde keser , bu parçalardan biri istediğimiz geni taşır.

7 Daha sonra DNA parçaları karıştırılır.Bazı
1) Daha sonra DNA parçaları karıştırılır.Bazı plazmitler istenen genle birleşir.DNA’ları kovalent olarak bağlamak için DNA ligaz eklenir. 3)Klonlama vektörünün hücrelere aktarılması Bu aşamada bakteri hücreleri rekombinant plazmitleri transformasyonla içeri alır.Bak teriler LacZ- olup , lacZ genindeki bir mutas yon nedeniyle laktozu parçalama yeteneğine sahip değildir. 4)Hücrelerin klonlanması Transforme edilen bakterileri , ampisilin ve X gal olarak adlandırılan bir şeker içeren katı besiyeri yüzeyine ekeriz.Çoğalan her bir bakteri , besiyerinde koloni olarak görülen bir hücre klonu oluşturur.Bu esnada plazmit ler tarafından taşınan insan genide klonlanmış olur. 2) 3) 4) Klon (Bakteri kolonisi) Ampisilin varlığında gelişebilen ve beyaz koloni oluşturan rekombinant plazmit içeren klon hücrelerin belirlenmesi 5)

8 Besiyerinde ampisilin bulunuşu sadece plazmit bulunduran hücrelerin gelişme
sine izin verir.Besiyerinde bulunan X-gal da yabancı DNA taşıyan plazmitleri bulunduran bakteri plazmitlerinin tanınmasında kolaylık sağlar.B-galaktozidaz ile hidroliz edilen X-gal nedeniyle mavi bir renk oluşacaktır.Oysa gen’le birleşen plazmitlerde B-galaktozidaz geni bozulacağıdan X-gal parçalanamaz ve bu hücreler beyaz renkte görünür. 5)İstenen geni taşıyan hücre klonlarının ayrımı Hedeflenen insan geninden başka birçok gende klonlanmış olabilir.En zor yöntem istenen geni taşıyan koloninin diğerlerinden ayrılmasıdır.Genin kendisini veya gen ürünü olan proteini arayabiliriz. Gen DNA’sının doğrudan aranmasına dönük tüm metodlar nükleik asit hibridizasyonu adı verilen gen ve diğer bir nükleik asit molekülündeki komplementer dizi arasındaki baz eşleşmesine dayanır. Komplementer molekül ,DNA ya da RNA olabilen kısa , tek zincirli bir nükleik asit olup nükleik asit probu olarak adlandırılır.Eğer istenen genin en azıdan bir kısmı biliniyorsa bir prob sentezlenebilir.

9 İstenen genin komplementer tek zincirine
hidrojen bağıyla özel olarak bağlanan probu radyoaktif bir izotopla işaretleyerek izleriz. 1) 1)Agar filtre üzerine aktarılır 2)DNA tek zincirli hale getirilmek için dena türe edilir. 3)Prob molekülün bulunduğu bir solusyon filtre kağıdı ile birlikte inkübe edilir.Prob DNA , filtre üzerindeki komplementeri olan her DNA ile melezleşme yapar. 4)Bu filtre , fotoğraf filmi üzerine yerleştirilir ve radyoaktif bölgelerin ışınlanması için beklenir. 5)Banyo edilen film , yani otoradyograf iste nen geni taşıyan kolonilerin belirlenmesi için master kültür petri kutusu ile karşılaştırılır. 2) 3) 4) 5) Master petri kutusu

10 Ökaryotik DNA’nın bakterilerde klonlanması ve ifadesi ile ilgili bir problem , pek çok
ökaryotik gende kodlama yapmayan uzun bölgelerin(intron) bulunuşudur.İntronlar ökaryotik bir genin oldukça uzun ve kullanışsız olmasına neden olur ve RNA-splays makinesine sahip olmayan bakteriler tarafından bu genin doğru okunmasına engel olurlar. Bu olayı engellemek için cDNA yapımı yolu kullanılmaktadır. Başlangıç materyali olarak mRNA kullanılır , mRNA da intronlar doğal olarak çıkartılmış tır ve asıl gen parçasını ifade olunmaktadır.Bu mRNA yı hücreden izole edebilir ve DNA yapmak için kullanabiliriz.

11 mRNA dan reverse transkriptaz enzimi
kullanılarak tek zincir DNA yapılır. İkinci zincir sentezlendikten sonra elde edilen DNA lar intronları taşımayan sadece gerekli şifreleri içeren DNA molekülleridir. DNA lar vektör DNA ya bağlanarak bakteri sitoplazması içinde genlerini ifade edebilirler. Bu DNA’lar cDNA olarak adlandırılır.

12 Moleküler biyologlar , istenen ökartotik genin klonlanması amacıyla konukçu olarak
bakterilerin yerine ökaryotik hücreleri kullanarak ökaryotik-prokaryotik uyumsuzlukdan uzak durmaya çalışırlar.Tek hücreli maya kültürleri plazmitlere sahiptirler.Bilim adamları maya ve bakteri DNA’larının bir araya getirildiği rekombinant plazmitler geliştirmişlerdir. Ökaryotik bir kromozomun temel bileşenlerini , yabancı DNA ile birleştirerek elde edilen ve maya yapay kromozomları(YACs) olarak adlandırılan vektörler yapılmıştır. Bu kromozomlar normal olarak mitozdaki gibi davranır ve maya hücresi bölündükçe yabancı DNA klonlanmış olur. Genomik Kütüphaneler Her biri başlangıçtaki genomun belirli bir segmentinin kopyalarını taşıyan binlerce rekombinant plazmidin tümü genomik kütüphane olarak adlandırılır.Plazmitlerin dışında , bazı bakteriyofajlarda genomik kütüphanelerin yapımında klonlama vektörü olarak kullanılırlar. Plazmitte olduğu gibi , yabancı DNA segmentleri , bir restriksiyon enzimi ve ligaz kullanılarak faj genomu içerisine yerleştirilebilir.Rekombinant faj DNA’sı daha sonra in vitro koşullarda kapsit içerisinde paketlenir ve normal enfeksiyon olayıyla bir bakteri hücresi içine sokulur.

13 Hücre içerisine girdiğinde faj DNA’sı
replike olur her biri yabancı DNA taşıyan yeni faj partikülleri oluşturur. Faj kullanılarak yapılan genomik kütüphane , faj klonu koleksiyonu olarak saklanır. Klonlama vektörü ne olursa olsun restriksiyon enzimleri genomik DNA da kesilen gen sınırlarına uygun luk göstermez , bu yüzden bazı genler genomik kütüphanede iki veya daha fazla klona ayrılmış olabilir.

14 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) DNA’yı tamamen hücre dışı koşullarda klonlar
Belirli bir genin ya da diğer DNA dizisinin büyük miktarlarda hazırlanması için en iyi metot , hücrelerdeki DNA’nın klonlanmasıdır.PCR yani polimeraz zincir reaksiyonu herhangi bir DNA parçasınının hücreyi kullanmadan kısa bir süre içerisinde çoğal tılabileceği bir tekniktir. Bu teknikte DNA özel bir DNA polimerazın , nükleotitlerin ve DNA sentezinde primer olarak kullanılan sentetik tek zincirli kısa DNA parçalarının bulunduğu bir test tüpü içerisinde inkübe edilir. PCR plazmid veya faj vektörünün kullanıldığı gen klonlamaya göre çok daha hızlıdır ve tamemen hücre dışı ortamda gerçekleştirilir. PCR aleti , üç aşamalı döngüyü hedef dizi çok sayıda duplike oluncaya kadar ard arda tekrar eder.

15 Başlangıç maddesi hedef nükleotit dizi
sini içeren bir çift zincir DNA solusyo nudur.Bu solusyona , sıcaklığa dirençli bir DNA polimeraz , dört tip nükleotit ve primerler eklenir. PCR’de DNA sentezini başlatmada kulla nılan primerler, hedef DNA sonlarına komplementer olan kısa , tek zincirli sentetik DNA molekülleridir.Bu şekilde primerler çoğaltılacak olan belirli bir DNA segmentini belirler. PCR uygulanmasının her bir döngüsü yaklaşık 5 dakika sürer.Döngü sonunda hedef DNA dizisi çift zincire dönüşür. Solusyon tekrar ısıtılır, zincir ayrılmasıy la bir sonraki döngü başlar , primer bağlanır ve DNA sentezi yapılır. ANİMASYON

16 DNA ANALİZİ VE GENOMİKS
İstenen insan genini taşıyan bir DNA segmenti klonlandıktan sonra , kişiler arası farklılıkları saptamak , kalıtsal bozukluk olup olmadığını anlamak , genin ne zaman ifade olunacağını saptamak için nükleotit dizisinin belirlenmesi gerekir. Genomiks , mevcut tüm genom bilgisine sahip olmak olarak tanımlanabilir.DNA molekülünün elektrik yükü ve diğer fiziksel özelliklerine göre ayrılması jel elektroforezi olarak bilinir.Bu yöntem , karışık haldeki DNA moleküllerini , her biri aynı büyüklük teki DNA molekülleri biçimde ayırma prensibine dayanır. Restriksiyon fragment analizi , restriksiyon bölgelerini etkileyen DNA farklılıklarını saptar.Elektroforez ile ayrılan DNA molekülü , başlangıç molekülüne ve kullanılan restriksiyon enzimine özgü bir band modeli oluşturacaktır. Ökaryotik kromozomlarındaki gibi büyük DNA molekülleri , belirgin ayrı bantlar olarak görülen çok sayıda fragment meydana getirir. ANİMASYON

17 Jel elektroforez , makromolekülleri , elektrik alanı altında , jeldeki hareket hızlarına göre
ayırır.DNA için hareket hızı –akım altında molekülün ne kadar uzağa gittiği- molekülün büyüklüğü ile ters orantılıdır. Negatif yüklü olan DNA molekülleri pozitif elektroda yani anoda doğru hareket eder. Elektrik kapatıldığında , her bir örnek içerisinde bulunan DNA molekülleri , büyüklük lerine göre hat boyunca bantlar halinde ayrılırlar.En uzağa giden en kısa moleküller jelin alt kısmındanki bantlarda bulunurlar.

18 DNA jelden zarar vermeden geri kazanaıldığı için bu yöntem aynı zamanda her bir
fragmentin saf örneklerini hazırlamak için kullanılır.Örneğin bir genin iki farklı allelleri karşılaştırılabilir.Önce her bir DNA örneği aynı restriksiyon enzimiyle kesilerek işe başlanır. Bunlar az da olsa DNA dizisindeçok az da olsa farklılıklar gösterir.Bundan dolayı jel elektroforezde farklı band modeli oluştururlar. Bir sonraki şekil A)Allel 2 deki tek baz çiftlik bir farklılık , belirli bir restriksiyon enzimine karşı tanıma dizisinin bir adet azalmasına neden olur.Bu enzim allel 1’e ait DNA’yı üç parçaya(w,x ve y) ayırırken , Allel 2’ye ait DNA’yı sadece iki parçaya(z ve y) ayırır. B)Elektroforez , her bir allelden ortaya çıkan restriksiyon fragmentlerini ayırır.İki allel arasındaki kesin farklılık , jeldeki bant modelleriyle gösterilmiştir.Alle 1 ,w, x ve y ol mak üzere üç banta , allel 2 ise z ve y fargmentlerine karşılık olan iki banda sahiptir.

19 a) b) c) c)DNA ya bağlanan bir boyanın ilave edilmesinden sonra , bantlar ültraviyole ışık altında pembe renk verir.Pembe bantlar , farklı büyüklüklerdeki DNA’nın restriksiyon fragmentlerine karşılıkdır. ANİMASYON

20 Southern blotting ile restriksiyon fragmenti analizi
Elektroforez sonucu bireysel olarak birbirinden ayırt edilemeyecek kadar çok sayıda band oluşmasına rağmen , bizim hedeflediğimiz genden gelen bantları ayırt edici şekilde işaretleyen özgül bir probla yapılan nükleik asit hibridizasyonunu kullanabiliriz. İşlemin tümünü özetleyen şekilde üç farklı bireyden alınan DNA örneklerinin karşılaştı rılmasında nasıl kullanılabildiğini göstermektedir. a)Test edilecek DNA örnekleri uygun olan kaynaklardan elde edilir , DNA’dan restriksi yon fragmentleri oluşturulur. b)Herbir örneğe ait restriksiyon fragment karışımı elektroforezle ayrılır.Her bir örnek karakteristik bir bant modeli meydana getirir. c)Alkali bir solüsyon , jelin üst tarafına doğru kapiler etkiyle çekilir ve DNA denatüre halde jelin üstünde bulunan nitroselüloz kağıt tabaka üzerine aktarılır.Tek zincirli DNA lar tamamen jeldeki konumlarında kağıt üzerine tutunurlar. d)Kağıt blot , radyoaktif olarak işaretlenmiş prob içeren bir solusyona maruz bırakılır. Prob , istenen DNA dizisine komplementer dizinin restriksiyon fragmentlerine baz eşleşmeleriyle bağlanır.

21 birbirinin aynısıdır , fakat 3 farklıdır.
c) Transfer Film e) Bir tabaka fotoğraf filmi kağıt üzerine yerleştirilir.Bağlanan probdaki radyoaktivite özgül DNA bandlarının karşısında görüntü oluşturmak üzere filmi ışınlar-probla baz eşleşmesini yapan DNA’yı içeren bantlar.Örneğin 1 ve 2’nin band modelleri birbirinin aynısıdır , fakat 3 farklıdır. ANİMASYON

22 Tüme genom , DNA seviyesinde haritalanabilir
Tüme genom haritasının çıkarılması için bir fiziksel harita , her bir kromozomun DNA’sı belirli sayıda ve teşhis edilebilen restriksiyon fragmentlerine kesilip ve daha sonra bu parçaların , kromozom DNA’sında orjinal sırasının saptanmasıyla yapılır. Burada esas, üst üste gelen fragmentlerin yapılması ve daha sonra da üst üste gelen dizileri bulmak için probları ya da uçların otomatikleşmiş nükleotit dizilerinin kullanılma sıdır.Kromozom yürümesi adı verilen bu yöntemde , problar kullanılır ve oldukça faydalıdır. Fiziksel haritalama da kullanılan DNA fragmentleri klonlamayla hazırlanır.İlk klonlama vektörü genellikle , bir maya yapay kromozomudur(YAC) ; bu kromozom , bir milyon baz çifti uzunluğundaki araya sokulan fragmentleri taşıyabilir.Ayrıca bakteriyel yapay kromozomlarda vektör olarak kullanılabilir. Kromozom yürümesi , bilinen bir gen ya da DNA segmenti ile başlanır.Çakışan restrik siyon fragmentlerinin bir haritasını yapmak üzere ,kromozomal DNA üzerinde iki ayrı örneğinin farklı restriksiyon enzimleri ile keser ve daha sonra iki ayrı kütüphane oluşturmak üzere iki fragment setini ayrı ayrı klonlar. ANİMASYON

23 a)Bilinen genin 3’ ucuna bağlanan bir prob hazırlanır.
Haritası yapılacak olan DNA a)Bilinen genin 3’ ucuna bağlanan bir prob hazırlanır. b)Başlangıç DNA’sı iki farklı restriksiyon enzi mi ile kesilir ve iki farklı kütüphane şeklinde fragmentler klonlanır. c)Bilinen genle çalışan DNA fragmentlerini belirlemek için 2 numaralı kütüphane , Prob 1 ile taranır. d)Etiketlenmiş klondan DNA izole edilir ve bu segmentin 3’ ucuna bağlanan prob 2 hazır lanır. e)Daha ilerideki çalışan fragmenti belirlemek için 1 numaralı kütüphane prob 2 ile taranır. f)DNA üzerinde ilerlemek için yeni prob ve alternatif kütüphaneler kullanarak 4 . ve 5. basamaklar tekrarlanır.Sonuçta , sırası bilinen ve bilinen mesafelerde birbirinden ayrılmış olan bir seri bilinen işaretleyicilerle, DNA haritası elde edilir.

24 DNA dizi analizi Moleküler biyolog J.Craig Venter 1992 de tüm genomun dizi analizi için bir metod geliştirmiştir.Bu yöntemde , temel olarak , genetik haritalama ve fiziksel haritalama aşamalarını atlayarak işe rastgele alınan DNA fragmentlerinin dizi analiziyle doğrudan başlamaktır.Bilgisayarlar yardımıyla sonuçta ortaya çıkan oldukça fazla sayıdaki üst üste gelen kısa diziler bir adet devamlı dizi şeklinde bir araya getirilecektir. Bu yöntemdeki ilk aşama 1) DNA fragmentinin zincirlerinden birini içeren bir örnek dörde ayrılır ve her biri, komplementer zincir sentezi için gerekli tüm bileşenlerle birlikte inkübe edilir.Bunlar işaretli bir primer,DNA polimeraz ve dört tip deoksiribonükleozit trifosfat.Bunlara ilaveten her bir reaksiyon karışımında , dört farklı nükleotidin modifiye formu olan dideoksi(dd) tiplerinden birisi bulunur. 2)Yeni zincirlein sentezi primerde başlar ve bir dideoksiribonükleotit gelinceye kadar devam eder , bu noktada itibaren sentez engellenir.Arada bir rastgele normal nükleotit yerine dideoksinükleotit takılır.Sonuçta , farklı uzunluklarda bir seri işaretli zincir meydana gelir.Burada sadece ddATP’nin bulunduğu , reaksiyon karışımı gösterilmiştir. 3)Her bir reaksiyon karışımındaki yeni DNA zincirleri , bir nükleotitlik farklılıkları bile ayırabilen poliakrilamid jel elektroforez ile ayrılır.Daha sonra radtoaktif olan bandları belirleyebilmek için otoradyografi uygulanır.

25 4)Yeni sentezlenen zincirin dizisi
otoradyografi üzerindeki bantlar dan doğrudan okunur ve bundan orjinal kalıp zincirin dizisi çıkarı lır.Bu örnekte , en uzun fragment ddG ile sonlandığından , G yeni DNA zincirindeki en son baz olmalıdır.İkinci sıradaki en uzun fragment ise ddA ile sonlanır, bunun anlamı sondan ikinci baz A dır. 1) 2) 3) 4) ANİMASYON

26 Genom dizisi , önemli biyolojik soruların cevaplanmasına ipucu sağlar
İnsan genomunda , süpriz olarak daha az sayıda genin bulunmasıdır.İnsanda ile arasında gen bulunur.İnsan genomunun büyük bir kısmı kodlama yapmayan genlerden oluşmuştur ve bu DNA’nında büyük bir kısmı tekrarlamış DNA dır. Kodlama yapan genler ,diğer canlılara oranla farklı kombinasyonlar yapmaya müsaittir. İnsan genomunda daha basit canlılardakine göre ekzonlar ve protein domainler gibi modüler elamanların daha fazla karışım ve eşleşme yaptığı görülmektedir , ve bu olay genelde omurgalıların bir özelliğidir. İnsan genomu ve bu genomun kodladığı protein kompleksliliğine rağmen , genom dizilerinin karşılaştırılmasıyla , çok uzaktan akrabalık ilişkisi olan canlılar arasındaki evrimsel bağlantılar çok güçlü bir şekilde onaylanır. Araştırmacılar , gelişimin farklı evrelerinde farklı dokularda ya da sağlık açısından farklı evrelerdeki dokularda hangi genlerim aktivite gösterdiğini tespit edebilirler. Bu yönteme DNA mikroarray işlemi denir. Farklı genlere ait olan çok sayıda tek zincirli DNA parçalarını içeren çok az miktardaki örnek, bir cam lam üzerinde çok sıkı aralıklı dizi şeklinde tespit edilmiştir.(DNA çip) İdeal olanı bu fragmentlerin bir canlının tüm genlerini temsil etmesidir.

27 Bu fragmentler , flöresan boyalarla işaret
lenmiş cDNA molekülleri ile hibridizasyo na uğratılarak test edilir. Flöresan lekeler dokulardan oluşturulan cDNA moleküllerinin DNA çiplerdeki DNA ile birleştiğini gösterir.Bu da bize genin alınan örenkte aktif olduğu sonucuna götürür. Bu yöntem sayesinde kanserli genlerin doku hücrelerinde aktif olup olmadı tespit edilebilir. Flöresan olarak İşaretlenmiş nükleotitler İşaretlenmiş cDNA molekülleri (Tek zincir) Hibridizasyon:cDNA karışımı bir DNA mikroarrayına uygulanır Bir mikroskop lamı üzerine tespit edilen, her bir leke,her bir lekede farklı gen olacak şekilde , canlının bir genini İfade eden kısa, tek zincirli DNA molekülünün kopyalarını içerir. Fazlalık DNA yıkanır; flöresan için mikroarray taranır ANİMASYON Herbir flöresan leke, doku örneğinde ifade edilen geni içerir.

28 Genomikste gelecek Genom haritalaması ve dizi analizindeki başarı , bilim adamlarını , genom tarafından kodlanan tüm protein takımlarının sistematik olarak çalışması anlamına gelen proteomikse yönlendirmiştir. Genetiğe ve diğer biyolojik bilgilere , bilgisayar biliminin ve matematiğinin uygulan ması olan biyoinformatikte ki ilerlemeler, aşırı derecede fazla olan bilgi yığınları ile uğraşırken önemli rol oynayacakdır. İnsan türünün tarihi oldukça kısa olmasıyla nedeniyle , insan DNA’sındaki varyasyon miktarı diğer türlere kıyaslandıkça oldukça küçüktür.Farklılıklarımızın büyük bir bölümünün , genomdaki tek bir baz çifti varyasyonu olan tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) şeklinde olduğu görülür.İnsan genomunda SNP’ler ortalama olarak baz çiftinde bir kez ortaya çıkar.

29 DNA TEKNOLOJİSİNİN PRATİK UYGULAMALARI
Belirli patojenlerin izlenerek bulunmasında özellikle PCR’ı ve işaretli nükleik asit problarını kullanan DNA teknolojisi sayesinde bulaşıcı hastalıkların tanısında yeni bir sayfa açılmıştır. Hemofili , sistik fibrosis ve Duchenne kas bozukluğu dahil çeşitli insan hastalıklarından sorumlu genler klonlanmıştır. Genin henüz klonlanmadığı durumlarda bile , eğer yakın olarak bağlanan bir RFLP markörü bulunmuşsa , anormal allel önemli bir doğrulukla belirlenebilir. Temel prensip , markörün gene olan yakınlığı olup gamet oluşumu sırasında markör ve gen arasında ortaya çıkacak CO’in oldukça oldukça olasılık dışı olmasıdır, bu yüzden markör ve gen , kalıtıldığında hemen hemen devamlı olarak bir arada kalacaktır.

30 Eğer bir aile bireyi iki adet restriksiyon bölgesine sahip sahip RFLP marker tipine
kalıtsal olarak sahipse , bu bireyin aynı zamanda hastalık nedeni allele de sahip olma olasılığı yüksek olacaktır.

31 Gen tedavisi Zararsız hale getirilmiş bir retrovirüs vektörü bir genin normal allelini buna sahip olmayan bir hastanın hücreleri içerisine sokulmasında kullanılır. Eğer viral nükleik asit yabancı bir gen bulunduruyorsa ve bu gen ifade ediliyorsa bu hücre ve hücrenin nesilleri , gen ürününe sahip olacak ve iyileşecektir. Kemik iliği hücreleri gibi yaşam boyu çoğalan hücreler , gen tedavisi için ideal hücrelerdir.

32 DNA teknolojisinin adli uygulamaları
Şiddet içeren suçların işlendiği bölgede bulunan dokunun RFLP ve STR analizinden elde edilen DNA parmak izleri yargıda delil oluşturur.Bu parmak izleri aynı zamanda analık-babalık davalarında da kullanışlıdır. Günümüzde , RFLP yerine DNA parmak izi için satellit DNA uzunluğundaki varyasyonlar marker olarak kullanılmaktadır.Mikrosatellitler , birkaç baz çiftlik tekrarlar halinde olup kabaca baz çifti uzunluğundadır ve kişiden kişiye oldukça değişkenlik gösterir.

33 Zanlının giyecekleri üzerindeki kan lekelerinden elde edilen DNA, kurbanın DNA parmak
izine uymakta , ancak zanlının DNA parmak izinden farklılık göstermektedir.Bu , zanlının giyecekleri üzerindeki , kanın kurbandan geldiğinin , zanlıya ait olmadığının kanıtıdır. ANİMASYON

34 Bitkilerde genetik mühendisliği uygulamaları için vektör olarak T plazmidi kullanışlıdır.
T plazmidi Agrobacterium tumefaciens bakterisinden elde edilir ve satmdart rekombi nant DNA teknolojisiyle , yabancı bir DNA fragmenti plazmidin T bölgesine takılır. Rekombinant plazmid kültür bitki hücrelerine aktarıldığında , T DNA bitkinin kromozo mal DNA’sına katılır. Bitki hücresi bölündükçe , yeni oluşan hücreler T DNA ve taşıdığı yabancı genlerin bir kopyasını alacaktır.Eğer buradan tüm bir bitki elde edilirse tüm hücreler yeni ve ifade edilebilir genleri taşıyacaktır.

35 E-Mail : omeryan@hotmail.com