Enzimler Nasıl Çalışır Enzim Kinetiği

... konulu sunumlar: "Enzimler Nasıl Çalışır Enzim Kinetiği"— Sunum transkripti:

1 Enzimler Nasıl Çalışır Enzim Kinetiği
Dr. Gülçin Eskandari

2 Enzimler nasıl çalışırlar?
Oldukça etkili katalizörler Reaksiyon hızını  Enzimlerin oldukça büyük yapılarına karşın, kataliz işleminin gerçekleştiği yer aktif bölge Enzimlerin aktif bölgesi substrat özgünlüğü de gösterir

3 Enzimler nasıl çalışırlar?
Substrat özgünlüğü, substrat bağlama bölgesindeki amino asidlerin yapısı, yükleri, polarite ya da hidrofobisiteleriyle belirlenir Enzimin substrat bağlaması hidrojen bağı, hidrofobik ya da iyonik etkileşim gibi zayıf bağlarla olur Bazı enzimler tek bir substrata özgünlük gösterirken, bazıları daha geniş bir spektrumu katalizlerler

4

5 Enzimler nasıl çalışırlar?
C + D A + B Enzimler aktivasyon enerjisini düşürürler.

6

7 Enzimler nasıl çalışırlar?
Bir reaksiyonun hızı geçiş aşamasına (transition state) birim zamanda geçen substrat konsantrasyonu ile orantılı Aktivasyon enerjisinin yüksek olması hızı düşürür Hızı arttırmak, ya ısıyı arttırarak reaksiyona girecek substratların enerjisini arttırmakla (collision theory) ya da aktivasyon enerjisini düşürmekle mümkün Canlı organizmalarda bu işlem aktivasyon enerjisinin düşürülmesi, yani reaksiyonları enzimlerin katalizlemesiyle gerçekleşir

8

9 Enzimler nasıl çalışırlar?
Enzimle katalizlenen reaksiyonların hızı artarken G ya da Keq değerlerinde herhangi bir değişiklik olmaz Reaksiyonun hızı reaksiyona giren moleküllerin konsantrasyonu ile doğru orantılı

10 k1 nA + mB AnBm k-1 Hız1 = k1 An Bm Hız-1 = k-1 AnBm

11 K1 An Bm = k-1 AnBm k1 AnBm Keq = = k-1 An Bm
Denge durumunda ise Hız1 = Hız-1 olacaktır. K1 An Bm = k-1 AnBm k AnBm Keq = = k An Bm Keq  1 ise reaksiyon spontan olarak gelişecektir. Keq  1 ise reaksiyonun oluşabilmesi için dışardan enerji alması gerekecektir.

12 Reaksiyon hızı Bir internasyonel ünite enzim miktarının, belirlenen şartlar altında bir mol ürünü bir dakikada oluşturması

13 Reaksiyon hızını etkileyen faktörler
Isı pH Enzim konsantrasyonu Substrat konsantrasyonu İnhibitör varlığı

14 Isı

15 pH

16 Substrat ve enzim konsantrasyonu

17 Enzim kinetiği E + S ES E + P k1 kcat k-1
1. Varsayım: E + P oluştuktan sonra geri dönüş reaksiyonunu ihmal ediyoruz 2. Varsayım: ES hem oluşuyor, hem de yıkılıyor, ancak bu iki işlem dengede ve ES konsantrasyonu değişmiyor Bu durum ‘steady state’ kararlı denge durumu

18

19 k1 kcat E + S ES E + P k-1 ES oluşumu = k1 E S ES yıkımı = kcat ES + k-1 ES Oluşum = Yıkım k1 E S = kcat ES + k-1 ES k1 E S = ES (kcat+ k-1) k1 ES = E S (kcat+ k-1) 1/Km

20 Km . ES = E S E = ET – ES Km . ES = (ET - ES) . S Km . ES = ET S - ES . S Km . ES + ES . S = ET S ES (Km + S) = ET S ET S ES = Km + S

21 E + S ES E + P kcat k1 k-1 V = kcat . ES ise Vmax = kcat . ET
ET S ES = Km + S V ET S = kcat Km + S ET S V = kcat Km + S Vmax . S V = Km + S

22 Michealis – Menten Denklemi
Vmax . S V = Km + S

23 Michealis – Menten Denklemi
Km, Vmax’ın yarısı hıza karşılık gelen substrat konsantrasyonu ve enzimin substratına olan ilgisini belirler Km değeri düştükçe enzimin substratına olan affinitesi artar Km büyüdükçe enzimin substratına olan affinitesi azalır

24 Michealis – Menten Grafiği

25 Eğer S  Km ise hız substrat konsantrasyonu ile doğru orantılı
Vmax . S V = Km + S Vmax . S V = Km V  S Birinci derece kinetiği

26 Eğer S  Km ise hız Vmax’ta
Vmax . S V = Km + S V = Vmax Sıfır derece kinetiği

27 Km değerinin, genelleme yapılamasa da, intrasellüler S kons
Km değerinin, genelleme yapılamasa da, intrasellüler S kons.unu yansıttığı söylenir Ancak gerçek olan bu değerin ya çok düşük ya da çok yüksek olduğu Böylece enzimin hızı ya S kons.u ile doğru orantılı ya da maksimum hızda çalışıyor Km değeri enzimin değişmeyen bir parametresi In vitro deneylerde gerekli olan S miktarı Km değerine göre ayarlanabilir Unutulmaması gereken bir nokta da çok yüksek S kons.larında ES = ET olduğu

28 Substrat konsantrasyonuna karşı çizilen hız eğrisinden Vmax ve Km hesaplaması her zaman mümkün olmamakta Bu durumda Michealis-Menten grafiğini lineer hale getirmek gerekir Bu işlem de 1/S’e karşılık 1/V transformasyonu ile yapılabilir

29 Vmax . S V = Km + S Km + S = V Vmax . S Km S = V Vmax . S Vmax . S

30 Km = V Vmax S Vmax y = a  x b

31 Lineweaver Burk Grafiği

32 Birden fazla substratı olan enzimlerin katalizlediği reaksiyonlarda substrat bağlanması farklılık gösterebilir Düzenli (ordered) mekanizma Rastgele (random) mekanizma ile bağlanma gerçekleşebilir

33 Düzenli mekanizmayla bağlanma
Örnek: Laktat Dehidrogenaz

34 Rasgele mekanizmayla bağlanma
Örnek: Hekzokinaz

35 Düzenli ya da rastgele mekanizmaların her ikisinde de ping-pong mekanizmasıyla bağlanma olabilir.

36 Birden fazla substratı olan enzimler için Lineweaver Burk grafiği denklemi

37 ENZİM İNHİBİSYONLARI Enzim inhibitörleri bilinen en iyi farmasötik ajanlar Örneğin aspirin prostaglandin sentezinde ilk basamağı inhibe ederek etkisini gösterir İki tip inhibisyon vardır; 1. Reversible (geri dönüşümlü) inhibisyonlar 2. İrreversible (geri dönüşümsüz) inhibisyon

38 Kompetetif (yarışmalı) İnhibisyon
Kompetetif inhibitör madde aktif bölgeye bağlanmak için substratla yarışır Kompetetif inhibitörler yapıca substrata benzeyen moleküllerdir ve enzimle birleşerek EI kompleksini oluştururlar

39 Süksinat dehidrogenaz

40 Kompetetif (yarışmalı) İnhibisyon

41 Kompetetif (yarışmalı) İnhibisyon
İnhibitör enzime geri dönüşümlü bağlandığı için S kons.u arttırılarak inhibisyon engellenebilir İnhibitör varlığında kinetik açıdan değişecek olan Km değeri, çünkü enzim aktif bölgesine inhibitör de bağladığından, substrata olan ilgisi azalır Sonuçta Km değeri 

42 Kompetetif (yarışmalı) İnhibisyon
Enzim Vmax’a nasıl ulaştırılır? S kons.u arttırılarak Dolayısıyla Km’in artması ve Vmax’ın değişmemesi kompetetif inhibisyon için karakteristik Yine inhibitör kons.unu artırmakla Km daha da artar

43 Kompetetif (yarışmalı) İnhibisyon

44 Kompetetif (yarışmalı) İnhibisyon
Kompetetif inhibisyonun terapatik amaçla tıpta kullanıldığı durumlar söz konusu Örneğin metanol zehirlenmesinde; metanol alkol dehidrogenaz enzimiyle fromaldehide çevrilir Formaldehid özellikle gözde olmak üzere, birçok dokuda hasara yol açar Alkol dehidrogenazın esas substratı olan etanol verildiğinde, enzime bağlanmak için etanolle metanol arasında yarışma başlar Etanol konsantrasyonu daha da artırıldığında metanolün toksik formaldehide çevrimi engellenmiş olur Metanol de idrarla atılır

45 Nonkompetetif İnhibisyon
İnhibitör madde substratın bağlandığı bölge dışında bir yere bağlanır İnhibitörün bağlanması substratın bağlanmasını etkilemez Dolayısıyla aynı anda enzime hem substrat, hem de inhibitör bağlanabilir İnhibitör bağlandığında enzim inaktive olmakta, enzime substratın da bağlı olması bunu etkilememekte

46 Nonkompetetif İnhibisyon

47 Nonkompetetif inhibisyon’da kinetik açıdan değişen nedir?
Vmax İnhibitör effektif olarak aktif enzim konsantrasyonunu düşürür ve bu da Vmax’ın düşmesine neden olur Diğer taraftan inhibitörün substrat bağlanma bölgesiyle etkileşimi olmadığından Km üzerine olan etki ya çok düşüktür ya da yoktur

48 Nonkompetetif İnhibisyon

49 Unkompetetif İnhibisyon
İnhibitör yine substartın bağlandığı bölgeden farklı bir yere bağlanır Ancak unkompetetif inhibisyonda inhibitör madde ancak ES kompleksi oluştuktan sonra enzime bağlanabilir Unkompetetif inhibisyonda kinetik açıdan değişen nedir? Hem Vmax, hem de Km azalır

50 Unkompetetif İnhibisyon

51 Unkompetetif İnhibisyon
(ALP / Fenilalanin)

52 İrreversible inhibisyonlar
Enzim aktivitesi için gerekli olan, enzimin fonksiyonel bir grubu ile birleşerek ya da bu fonksiyonel grubun yapısını bozarak etki gösterirler İrreversible inhibitör ile enzim arasında kovalent bir bağ oluşumu olabilir

53

54 İrreversible inhibisyonlar
İodoasetamid aktif bölgesinde –SH grubu içeren enzimlere bağlanarak alkil enzim türevi oluşturur Diizopropil-florofosfat enzimin serin residuesunun –OH grbundan enzime kovalent olarak bağlanarak, enzimin diizopropil-fosfat türevini oluşturur Kimotripsin bir serin proteaz Aktif bölgesinde 195. pozisyonda serin amino asidi bulunur

55

56 Enzim katalitiz mekanizmaları
Asit-baz katalizi Elektrostatik kataliz Kovalent kataliz Metal iyon katalizi Yakınlık etkisi Kimyasal bağlar elektronlar tarafından oluşturulur. Bağların yeniden düzenlenmesi ya da kırılması elektronların hareketini gerektirir.

57 Genel asid-baz katalizi
Kimyasal bağlar elektronlar tarafından oluşturulur Bağların yeniden düzenlenmesi ya da kırılması elektronların hareketini gerektirir Reaktif kimyasal grupların elektrofil ya da nükleofil gibi fonksiyon gördüğü söylenebilir

58 Genel asid-baz katalizi
Elektrofiller, elektron açığı olan maddeler olup, elektron fazlası olan maddelerle reaksiyona girerler Nükleofiller, elektron fazlası olan maddeler olup, elektron açığı olan maddelerle reaksiyona girerler

59 Genel asid-baz katalizi
Potansiyel olarak reaktif olan bir grubun intrinsik elektrofilik ya da nükleofilik karakterini arttırarak, daha reaktif hale getirilmesi sonucu kataliz gerçekleşebilir Bu olayı gerçekleştirmenin en kolay yolu bir proton eklenmesi ya da uzaklaştırılması

60 Genel asid-baz katalizi

61 Genel asid-baz katalizi
Su intrinsik olarak zayıf bir nükleofil, bir katalist yokluğunda esterle olan reaksiyonu çok yavaş gerçekleşir Ancak ester hidrolizi yüksek ya da düşük pH’da çok daha hızlı gerçekleşir Enzimlerin aktif bölgelerinde bulunan asidik ya da bazik amino asidlerin varlığı ile asid ya da baz katalizi gerçekleşir

62

63 Genel asid-baz katalizi
Ester ya da amid hidrolizinde bir diğer mekanizma su yerine enzimin aktif bölgesinde daha nükleofilik bir grubun yer alması Serin amino asidinin –OH grubu enzimler tarafından bu amaçla kullanılmakta

64

65 Asetoasetat dekarboksilaz enzimi

66

67 Elektrostatik kataliz
Enzimlerin aktif bölgesinde yüklü grupların bulunması elektrostatik etkileşimlerin oluşmasını sağlar Substratın bağlanması genellikle enzimin aktif bölgesinden suyu uzaklaştırır Daha polar bir yapıya kavuşan aktif bölge, sulu ortamdakinden daha güçlü elektrostatik etkileşimler geliştirir Bunun sonucu olarak, proteindeki amino asit yan zincirlerinin pK’ları yüklü grupların yakınlığı nedeniyle normal değerlerinden birkaç birim değişebilir. Deneysel kanıtlar ve teorik çözümlemeler hala yetersiz olmasına karşın, enzimlerin aktif bölgesi civarındaki yük dağılımlarının reaksiyonun geçiş halini stabilize etmede rol aldığı görülmektedir.

68 Kovalent kataliz Enzim üzerindeki nükleofilik bir grup ile substrat üzerindeki elektrofilik bir grup arasında kovalent bağ oluşumu ile kataliz gelişir

69 Metal iyon katalizi Enzimlerin yaklaşık üçte biri katalitik aktiviteleri için metal iyonlarına ihtiyaç duyar Metal iyonları Substratları bağlayarak, Elektrostatik olarak negatif yükleri stabilize ederek ve koruyarak, Oksidasyon-redüksiyon reaksiyonlarına, metal iyonunun geri dönüşümlü oksidasyon değişiklikleri yoluyla aracılık ederek katalitik sürece katılır

70 Yakınlık etkisi Bir enzim uygun bir oryantasyonda iki reaktanı bir araya getirerek, reaksiyonu başlatabilir Özellikle bir molekülde gruplar arasında gelişen intramoleküler reaksiyonlar, iki ayrı substratın bir araya gelmesi ile oluşan reaksiyonlardan daha hızlı olarak gerçekleşir

71 Yakınlık etkisi

72 Yakınlık etkisi Moleküller arası reaksiyonları katalizleyen enzimler aktif bölgelerine substratlarını bağlayarak, bu substratlar arasında yakınlık oluşturup, reaksiyona uygun oryantasyonu sağlamış olurlar Substratlar bu şekilde bağlandıktan sonra, sanki tek bir molekül üzerindeki intramoleküler bir olay gibi reaksiyon gerçekleşir

73

74 Aşağıdakilerden hangisi reaksiyon hızını etkilemez?
Ortam ısısı Ortam pH’sı Substrat özgünlüğü Enzim konsantrasyonu Substrat konsnatrasyonu