DNA PURİFİKASYON YÖNTEMLERİ

... konulu sunumlar: "DNA PURİFİKASYON YÖNTEMLERİ"— Sunum transkripti:

1 DNA PURİFİKASYON YÖNTEMLERİ
Hazırlayan:Dr.Ayla Avcıkurt

2 DNA tipleri Genomik (Kromozomal) Organeller (satellit)
Plazmit(ekstrakromozomal) Faj/viral cDNA

3 Metot tipleri Farklı çözünürlük Adsorpsiyon metotları
Yoğunluk gradient santrifüjü

4 DNA ve RNA izolasyonunda temel prensip aynıdır
4 Basamaktan oluşur. Hücrelerin ayrılması Lizis :hücrelerin parçalanması Protein ve diğer kontaminantlardan uzaklaştırılması DNA /RNA saflaştırılması

5 Genellikle tüm metotlarda hücrelerin birbirinden ayrılması ve lizis basamağı benzerdir.
SDS, alkali, ısıtma olabilir Proteinlerden uzaklaştırılması da enzimatik olabilir proteinaz K kullanılır. Ayrıca DNA izolasyonunda RNAaz, RNA izolasyonunda DNAaz kullanılabilir.

6 DNA saflaştırılması Tuzla çöktürme olabilir Organik ekstraksiyon
Ethanol yada izopropanol Organik ekstraksiyon DNA / RNA katı yüzeye bağlanabilir. Silika olabilir Anyon değişim kromotagrafisi olabilir

7 Saflaştırma tekniklerinin tercihi
Nükleik asitlerin daha sonra kullanılacağı prosedürün tipine bağlıdır. Saflık düzeyine bağlıdır. Nükleik asitlerin moleküler ağırlığına Zaman ve ekonomik durumlara bağlı olarak değişebilir.

8 Hücre ekstraklarının hazırlanması
İki metod kullanılabilir. Isı ile hazırlanabilir 90 C de 20 dakika Proteinaz K ile inkübasyon yapılabilir. Bu şekilde elde edilen DNA bazı uygulamalarda kullanılabilir ama, lizatlar genellikle enzimleri inhibe edebilecek maddeler içerebilirler. Tuz gibi. DNA genellikle optimum PH da olmayabilir. Proteinaz K’nin yetersiz inaktivasyonu negatif sonuçlara neden olabilir. Bu şekilde elde edilen DNA saklanamaz aksi halde DNA degrede olabilir.

9 Tuzla çöktürme Ham ekstrakdaki protein ve diğer kirleticiler yüksek konsantrasyonda amonyum asetata ve potasyum asetat kullanılarak çöktürülebilir. Ethanol presipitasyonuyla da nükleik asitler ayrılır. Bu yöntemde proteinler ve diğer kirleticilerin uzaklaştırılması çok etkili değildir. Bu nedenle RNAz uygulanması, diyaliz yada tekrarlanan ethonol presipitasyonuna ihtiyaç duyulabilir.

10 Ethanol presipitasyonu
Santrüfüjleme sonunda DNA sedimenti Ethanol

11 Organik ekstraksiyon Organik ekstraksiyon geleneksel metotlardandır.
Fenol proteinleri denatüre edici bir ajandır. Ham ekstrakt elde edildikten sonra fenol/Kloroform/İzoamil alkol ile karıştırılır.Doğru tuz konsantrasyonu ve pH sağlandığında DNA üst fazda, denatüre edilen protein orta fazda fenol/kloroform/izolamil alkol alt fazda birikir. Dezavantajı: Bu prosedürle elde edilen DNA fenol kloroform artıkları içerirse daha sonra basamaklarda enzimatik reaksiyonlarda kullanılamaz .

12 Fenol Kloroform Ekstraksiyonu
Fenolle karıştırılır Üst faz: DNA veya RNA Orta faz: Proteinler Alt faz:Fenol Santrüfüjleme sonunda

13 Sezyum Klorid yoğunluk gradienti
Nükleik asitler sezyum klorid yoğunluk gradient santrifüjleme ile saflaştırılır. Hücreler bir deterjanla lizis edilir ve lizat alkol ile presipite edilir. Çözünmüş DNA sezyum Klorid ve ethidium bromid ile karıştırılır. Bir kaç saat santrüfüj edilir. DNA bantları santrifüj tüpüne toplanır. Ethidium bromidden uzaklaştırmak için izoproponal ile kullanılır. Ethanolle ile DNA presipite edilir. Bu metot çok yüksek saflıkta DNA elde eden bir prosedürdür. Fakat uzun süren ve otomasyon ile işleyebilecek bir yöntem değildir. Ethidiyum Bromid gibi toksik maddeler içerir.

14 Anyon Değişim kromotografisi
Katı fazlı anyon değişim kromotografisi negatif yüklü nükleik asitler substratın üzerindeki pozitif yüklü moleküller arasındaki etkileşime dayanmaktadır. DNA substrata düşük tuz konsantrasyonlarında bağlanır. Diğer istenmeyen safsızlıklar tamponlarla uzaklaştırılır. Yüksek kaliteli DNA yüksek tuz tamponuyla elüye edilir. DNA ethanolle presipite edilir. Toksik madde kullanımını gerektirmez. Farklı ölçeklerde nükleik asit saflaştırılmasını olanak kılar.

15 Silika bazlı metotlar Bu metot yüksek katotropik tuz konsantrasyonunda nükleik asitlerin silika jel membranı üzerine seçici adsorbiyonu esasına dayanır. Optimize edilen tampon çözeltiler diğer hücre proteinlerinin ve metabolitlerin uzaklaşırken sadece nükleik asidin silika jele bağlanmasını sağlar. Basit, ucuz olup, organik ekstrasiyon gerektirmez.

16 Kültür ortamları Tanımlanmış Kültür ortamları
İçeriğindeki tüm besin maddelerin miktarları ve Görevleri belli olan ortamlardır. Örnek: M9 Bakteri kültürünün tam kontrollü şekilde Büyütülmesinin zorunlu olduğu durumlarda kullanılmaktadır. Tanımlanmamış Kültür ortamları İçeriğindeki besin maddeleri miktar ve içerikleri belli değildir. Örnek Luria Broth (LB)

17 Bakteri hücreleri santrifüjleme ile toplanır
Bakteri kültürü Santrüfüjleme 10 dakika 8000rpm Santrüfüj rotoru Bakteri sedimenti

18 Bir bakteri hücresinden DNA izolasyonu
1-Bakteri Külltürü Santrüfüj Hücre sedimenti Hücre ekstraktı 2-Lizis 3-DNA hücre ekstrağından saflaştırılır 4-DNA konsantre edilir Saf DNA

19 Hücre Lizisi Mekanik parçalama Kimyasal parçalama dondurarak havanda
parçalayıcı ultra ses dalgaları(sonikatör) Kimyasal parçalama acetone at -15 ° Distile su ile osmoliz Deterjanlarla parçalama

20 mtDNA izolasyonu

21

22 Çalışılacak materyalden 5 gr doku örneği alınır.
Örnek cam bir kap içerisine alınır. Kabın içerisine 25 ml mitokondri izolasyon çözeltisi ve buz ilave edilip örnek homojenize edilir. Karışım havanla dövülerek parçalanır. Daha sonra karışım filitre edilerek parçalanmamış büyük döküntülerden arındırılır.

23 Süzüntü deney tüpüne aktarılır. Deney tüpü buz ile muamele edilir.
Daha sonra süzüntü rpm’de 5dk santrifüj edilir. Tüpün üst kısmı alınır ve yeni bir tüpe aktarılır. Genom DNAsı ve parçalanmamış hücreler içeren alt kısım atılır. Süpernetan rpm’de 10dk santrüfüj edilir. Mitokondri içeren alt kısım alınır ve yeni bir tüpe aktarılır. üst kısım atılır.

24 Bu aşamalardan sonra mtDNA izolasyonuna geçilmiş olur

25 mtDNA izolasyonu 3 adımda yapılır ;
1) Mitokondrial membranlar ve diğer membranların lizise uğratılması, 2) Proteinlerin fenol-kloroform gibi çözeltilerle uzaklaştırılması, 3) Etonol ile DNA’nın çöktürülmesi,

26 İzolasyon işlemi ; Mitokondrial çözelti içerisine lizis tamponu eklenir. Deney tüpü buz içerisinde 5 dk inkübe edilir. Böylelikle mitokondirial membranlar ve diğer membranlar çöktürülür. Daha sonra tüpe KOA/asetik asit içeren çözeltiler eklenerek yağların ve proteinlerin çöktürülmesi sağlanır. Karışım rpm’de 5 dk santrifüj edilir. Üst kısım alınır, protein ve yağları içeren alt kısım atılır.

27 Alınan süpernatan içerisine 500ml fenol eklenip karıştırılır.
Çözelti rpm’de 5dk santrifüj edilir. mtDNA içeren üst katman mikro pipet ile dikkatlice çekilir ve yeni bir tüpe aktarılır ve üzerine saf etanol eklenir. Çözelti tekrar rpm’de 10 dk santrifüj edilir. Etanol içeren üst kısım atılır ve mtDNA elde edilmiş olur.

28 % 70’lik etanol eklendikten sonra santrifüj yapılır ve üst kısım atılırsa mtDNA tuzlardan ve EDTA’dan arındırılmış olur. Böylelikle daha saf DNA elde edilmiş olur.

29 Viral DNA izolasyonu

30 TEMEL PRENSİP Virüs kiti 8/96 viral DNA/RNA’ nın arındırılması için dizayn edilmiştir. Silica membran üzerine kurulmuş tercihe göre; 8 kuyulu ve 96 kuyulu kitler mevcuttur. RNA virüsleri buffer RAV1 tarafından çok hızlı ve etkili bir şekilde lizis olur. DNA virüslerinin lizis olması daha zordur. Bunun için kit solusyonlarına Proteinaz K eklenir. Tuz gibi potansiyel PCR inhibitörleri ve metabolitler yıkama adımında ethanolic yıkama tamponu RAW ve RAV3 tarafından temizlenir.

31 Nucleospin kit 8 için kit içeriği

32 Nucleospin kit 96 için kit içeriği

33 Kit seçim rehberi

34 Kit özellikleri

35 Kullanılabilecek numuneler
µl plazma Serum Serbest biyolojik sıvılar Doku süspansiyonları Dışkı örnekleri Sulandırılmış kan örnekleri

36 Gerekli donanımlar Santrifüj Vakum

37 Kit kullanımının (santrifüj altında) protokolü
Standart protokol HCV yada HIV den viral RNA arındırılma işleminde kullanılmasını tavsiye eder. CMV gibi DNA virüsleri de izole edilebilir fakat Proteinaz K eklenmesi önerilir. İzolasyon prosedürüne başlamadan önce 70 °C ‘de buffer ların ve solüsyonların inkübe edilmesi gerekir.

38 Kit 8 için (santrifüj altında)

39 Kit 8 için (vakum altında)

40

41

42

43