PCR -Polimeraz Zincir Reaksiyonu-

... konulu sunumlar: "PCR -Polimeraz Zincir Reaksiyonu-"— Sunum transkripti:

1 PCR -Polimeraz Zincir Reaksiyonu-
HAZIRLAYAN ve SUNAN Ali ÖZCAN Veteriner Hekim Gıda Kontrol ve Merkez Araştırma Enstitüsü MAYIS-2008

2 GİRİŞ Biyoteknoloji Nedir?
Biyoteknoloji, insan, hayvan ve bitki hücrelerinin fonksiyonlarını anlamak ve değiştirmek amacıyla uygulanan çeşitli teknikleri ve işlemleri tanımlamak için kullanılan bir terimdir. Canlıların iyileştirilmesi yada endüstriyel kullanıma yönelik ürünler geliştirilmesini, modern teknolojinin doğa bilimlerine uygulanmasını kapsar.

3 GİRİŞ Bu teknik (PCR) Cetus firmasının insan genetiği departmanında çalışan araştırmacı Kary MULLIS tarafından 1985’te bulunmuş ve patenti alınmıştır. PCR; ilk defa aynı yıl R. SAIKI , K. MULLİS ve arkadaşları tarafından ortak hücre anemisinin tanısının konulmasında uygulamaya sokulmuştur. 1993 yılında bu çalışma K. MULLIS’e NOBEL ödülünü kazandırmıştır. PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’daki özgül bölgelerin çoğaltılmasını (amplifikasyonunu) sağlayan basit ama çok başarılı bir invitro DNA sentezi yöntemidir.

4 GİRİŞ PCR; DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını kısa zamanda yapan bir tekniktir. Moleküler düzeyde detay bilgisi arttıkça normal hücre gelişimi, dokuların ve sistemlerin normal yapılanışı (morfogenezis) ile, bunların patolojik lezyonlara değişimi (patogenezis) merak uyandırmakta ve süreçte yer alan tüm kritik genlerin ekspresyon paternlerini incelemektedir.

5 GİRİŞ Escherichia coli’ den DNA Polimeraz enziminin kullanılmasının dezavantajı, PCR reaksiyonunda kullanılan yüksek ısılarda denatüre olması ve bu sebeple her PCR siklusu sonucunda taze enzimin yeniden ilave edilmesi zorunluluğuydu. Bu problem termofilik bir bakteri olan, ısıya karşı çok dayanıklı Thermus aquaticus’ tan DNA polimeraz enziminin elde edilmesiyle ortadan kalkmıştır. Bu enzimin geliştirilmesi aynı zamanda otomatik PCR cihazının geliştirilmesine de imkan tanımıştır. Böylece PCR reaksiyonunda gerekli olan ısı ve zaman ayarlamaları otomatik olarak bu cihazlar vasıtasıyla yapılmış ve teknik daha güvenilir bir hale getirmiştir.

6 GENETİĞE GİRİŞ DNA, ebeveynlerden çocuğa fiziksel özellikleri taşıyan genetik materyaldir. RNA ise, DNA’dan bilgiyi alıp protein sentezinde kullanılmasını sağlar. DNA çift, RNA tek sarmallıdır.

7 NÜKLETİD YAPISI DNA ve RNA’nın , fosfat grupları, nitrojenli bazlar ve monosakkaritler içeren temel yapı taşlarına nükleotit adı verilir. Nükleik asitler azot içeren bir baz, bir pentoz ve fosforik asit kapsayan temel yapı üniteleridir.

8 DNA’NIN YAPISI DNA, dört organik bazdan,1 fosfat grubundan ve 1 şeker grubundan oluşur. DNA çift zincirden oluşmuştur. Yapısındaki dört organik bazın (adenin, timin, guanin, sitozin) diziliş şekilleri ve sayıları ile genetik bilgiler belirlenir.

9 RNA’NIN YAPISI RNA, dört organik bazdan oluşmuştur. Fakat bu materyal tek zincirden oluşmuştur. Yapısında bir baza sadece bir fosfat-şeker grubu denk gelmektedir. DNA’da ise bazlar çift halinde bulunur ve bir çift baza bir fosfat-şeker grubu denk gelmektedir.

10 DNA’NIN GÖREVLERİ Ebeveynlerden çocuğa aktarılacak genetik bilgiyi taşır. RNA’nın görevinin yarısını oluşturur: RNA protein sentezi için bilgiye ihtiyaç duyar. Eğer bu bilgi yoksa RNA sentez yapamaz. O yüzden DNA, RNA açısından çok önemli bir materyaldir.

11 RNA’NIN GÖREVLERİ DNA’dan bilgiyi alır. Bunu işleyerek protein sentezi işleminde kullanır. Çekirdekten bilgiyi alıp, sitoplazmaya taşır.

12 DNA’NIN KENDİNİ EŞLEMESİ
DNA, hücrede bulunan serbest bazlardan alır ve kendini kopyalar.

13 DNA’NIN KENDİNİ EŞLEMESİ
DNA’nın sentezi sırasında nükleotitler pentoz şekerinin 3’-OH grubuna bağlandığından, polinükleotidin büyümesi bu uçtan başlayarak 5’-3’ yönüne doğru devam eder. Buna göre iplikçiklerden birinin yönü 5’-3’ ise diğerinin yönü bunun tersine 3’-5’ olmaktadır Ve iplikçikler birbirlerine anti-paralel bir durum gösterirler

14 DNA KENDİNİ EŞLERKEN; Bazı kimyasallar vücuda girmişse,
Vücut, radyasyona maruz kalmışsa, Vücutta uyuşturucu madde, sigara, alkol bağımlılığı varsa, DNA kendini eşlerken hata yapar.

15 BUNLARI BİLİYOR’MUSUNUZ?
Bir saniyede, bir hücrede, bir milyon reaksiyon oluşmaktadır. Bir DNA’nın şeklinin belirlenmesi için kendini on defa üst üste tekrarlaması gerekiyor. genden, protein oluşur.

16 PCR NEDİR? DNA zincirinin önceden belirlenen bir bölgesini çoğaltmak için kullanılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), moleküler genetik alanında devrim niteliği taşıyan bir yöntemdir.

17 REAL-TIME PCR PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngülerini sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, real-time PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemi oluşturmuştur. DNA ve RNA örnekleri kalitatif ve kantitatif olarak kısa sürede analiz edilebilmektedir. Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Klinik uygulamaları giderek artan real-time PCR sistemleri, infeksiyon hastalıklarının tanısında ve nokta mutasyonlarının belirlenmesinde sağladığı üstünlükler nedeniyle tercih edilmektedir.

18 GELİŞMİŞ PCR TEKNİKLERİ NELERDİR?
LightCycler (LC) sisteminin diğer PCR cihazlara göre en büyük avantajı amplifikasyon ürün oluşumunun anında «real-time» izlenebilinmesidir. Bunu, fluoresansa dayanan iki metodla gerçekleştirir: 1. DNA bağlayıcı boya SYBR Green I 2. Hibridizasyon probları

19 GELİŞMİŞ PCR TEKNİKLERİ
1. DNA bağlayıcı boya SYBR Green l Özellikleri: SYBR Green I boyası çift sarmal DNA’nın küçük girintisine bağlanır. Prensibi: Bağlanmamış olan boya az miktarda fluoresans yayarak, daha sonraki bilgisayar analizlerinden çıkartılan, minimum arka fon fluoresans sinyalini oluşturur. Değerlendirilmesi: Erime eğrisinin incelenmesiyle spesifik fluoresans sinyalleri, spesifik olmayanları sinyallerden ayırt edilebilir.

20 GELİŞMİŞ PCR TEKNİKLERİ
2. Hibridizasyon probları Özellikleri: Hibridizasyon prob formatı DNA’nın saptanması ve kantifikasyonu için kullanılır. Prensibi: Oligo1 3‘-ucunda fluorescein’le işaretliyken, oligo2 5‘-ucunda LC Red 640 ile işaretlenmiştir. Değerlendirilmesi: Hibridizasyon problarıyla DNA- kantifikasyonu duyarlı olmakla kalmaz, aynı zamanda yüksek özgüllüğe de sahip olur.

21 LightCycler Aplikasyonları
Üç başlık altında incelenebilir 1. DNA Kantifikasyonu 2. Erime Eğrisi Analizi 3. Dual Color Detection

22 LightCycler Aplikasyonları
1. DNA Kantifikasyonu Özellikleri: LightCycler cihazı, kullanılan metotlara (SYBR Green I veya Hibirdizasyon probları) bağlı kalmaksızın, her amplifikasyon döngüsünün sonundaki ilerlemeleri kaydeder. Prensibi: Başlangıçta, reaksiyon karışımında az miktarda kalıp molekülü bulunuyorsa, buna bağlı olarak daha fazla amplifikasyon döngüsü sonrası bir sinyal elde edilecektir.

23 LightCycler Aplikasyonları
2. Erime Eğrisi Analizi Ürün hakkında bilgi edinme: Primerlerin kendini eşleyen DNA’lara sahip oldukları durumlarda, tekrarlanan PCR döngüleri sonucunda az miktarda kalıp moleküller oluşabilir Özellikleri: LightCycler cihazı, amplifikasyon aşamasından sonra oluşan PCR ürünlerinin ayrıntılı erime eğrisi analizini yürütebilmektedir. Mutasyon analizi: LC sisteminde hibridizasyon probları yardımıyla genotipleme ve mutasyon analizleri çalışmaları yürütülebilir.

24 LightCycler Aplikasyonları
3. Dual Color Detection Özellikleri: LightCycler sisteminin bir başka ilgi çekici özelliği bir örnekte aynı anda iki farklı hedef diziyi saptayabilmesidir. Prensibi: Farklı filtrelerden geçtikleri için, bunlarla ikili boyamalar yapmakta mümkündür.

25 LightCycler’in Sunduğu Avantajlar
Real-time PCR’daki esnekliği Hızlı PCR performansı Gün içerisinde daha fazla sonuç alma imkanı Doğruluğu ve tekrarlanabilirliği Sonuçların bir zaman diliminde elde edilebilmesi Bilinen PCR metodların sınırlarını aşma olanağı Her tür laboratuvarda çalıştırılmak üzere tasarlanmış dizyanı Birçok hedefi aynı anda analiz etme avantajı

26 PCR’IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ
Günümüzde PCR tekniğinin otomasyonu, her bir siklus esnasındaki ısıtma ve soğutma işlemlerini yazılan program doğrultusunda yapan Thermocycler adı verilen PCR otonomları yardımıyla sağlanmıştır. PCR, DNA’nın bir bölümünün invitro yöntemle hızlı ve çok sayıda çoğaltan bir tekniktir. PCR klinik materyallerde bulunan veya izole edilen etkenlere ait DNA’ların veya bazı spesifik sekansların invitro olarak çok kısa sürede (birkaç saat) enzimatik amplifikasyonlarını amaçlar.

27 PCR’IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ
RNA karakterindeki genomik materyallerde önce, reverse transkriptaz (rt) ile komplementer DNA’ya (cDNA) çevrilerek amplifikasyonu yapılır. Amplifiye edilecek bölgenin uzunluğu ve primerlerin dizisi tarafından belirlenir. Tepkimenin sahip olduğu yüksek doğruluk ile 20 döngü, kalıbın kez amplifikasyonuna neden olur. Etkinsizliğin kaynakları örnek DNA’sının hedef olmayan bölgelerine primerlerin yapışması, yükseltilmiş ısıda polimerazların etkinsizleşmesi, hazırlanmış kalıbın tam olmayan uzaması oluşturur.

28 PCR’IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ
PCR’ın çalışma prensibi oldukça basittir. Özet olarak, izole edilen veya patolojik materyallerde bulunan hedef genetik materyallerin (DNA veya RNA), spesifik kısa zincirli oligonükleotit primerler yardımıyla enzimatik olarak sayısal çoğaltılması (amplifikasyon) olarak tanımlanabilir. PCR’ın prensibi tekrarlanan üç basamağa dayanır. 1. Denatürasyon (parçalanma) 2. Hibrididasyon (pirimerlerin yerleşmesi) 3. Polimerizasyon (sentez)

29 PCR’IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ
Reaksiyonun özgünlüğü çok iyi tanımlanmış oligonükleotitlerin seçilmesi ile sağlanır. Primerler çiftler halinde biri çift zincir DNA’yı oluşturan zincirlerden birine, diğeri de o zincirin komplementerine eşleşecek şekilde farklı dizilimlerde tasarlanır. Amplifikasyon için DNA dizisinin bilinmesi gerekli değildir. Birleşme bölgesinin bilinmesi yeterlidir. PCR için saf DNA kullanmaya gerek yoktur. Kaba hücre özütü, total DNA preparatı, bir damla kan yada sperm başarılı bir PCR için başlangıç materyali olabilir.

30 PCR’IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ
DNA replikasyonunda DNA polimeraz enzimi templateDNA (hedef DNA) adı verilen kopya edilmesi amaçlanan sarmalın içerdiği bilgileri kullanarak DNA molekülünün bir kopyası üretilir. Neticede hedef bölgenin uçlarına bağlanarak (annealing yada hibridizasyon işlemi) amplifiye olacak DNA bölgesinin sınırlarını belirlerler. PCR reaksiyonlarında 3 basamak, denatürasyon, hibridasyon ve uzamadan oluşan bu 3 basamak bir siklusu teşkil eder.

31 pcr animasyon\PCR sıklusu.swf

32 1-DENATURASYON PCR işleminin ilk aşamasında amplifiye edilecek matris DNA başlangıçta oC’ye kadar ısıtılır. DNA yapısının zarar görmesi durumunda, PCR boyunca yanlış yapılan nükleotitler çoğalır. Denatürasyon için genellikle 90-95oC 30 sn ısı uygulanır. PCR basamakları için kullanılan bu dereceler ve süreler çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir. Hedef DNA’nın Guanin ve Citosin bakımından zengin olduğu durumlarda denaturasyon için 95oC’den daha yüksek bir ısı uygulanabilir.

33 2-HİBRİDİZASYON DNA’nın ısıyla denatüre edilmesi yani çift sarmallı DNA sarmalının birbirinden ayrılması ve sıcaklığın 50oC’ye düşürülmesi ile primerler DNA matrisi üzerinde yoğunlaşırlar. Primerlerden biri kendine ait 5’-terminusu ile hedef DNA’lardan birinin 3’-ucu ile ve diğer primerler de, ikinci tek iplikçik DNA’nın, anti paralel olarak diğer ucunda bulunan 3’-ucuna bağlanarak, DNA polimeraz’ın çalışması yönüne uygun olarak (5’-3’) bağlanırlar. Hibridasyon ısısı genellikle primerlerin erime ısısının 5oC altında olup 55-65oC’lerde en iyi sonuç verir.

34 2-HİBRİDİZASYON Yüksek ısının kullanılması yanlış nükleotitlerin primerlerin 3’ ucuna bağlanmasını önler. Hibridasyon ısısının düşük tutulduğu durumlarda spesifik olmayan küçük DNA fragmentlerinin oluşması söz konusu olur.

35 3-POLİMERİZASYON (SENTEZ)
Sentez basamağında ise primerlerin DNA polimeraz enzimi vasıtasıyla hedef DNA sarmalını tamamlamaları işlemi gerçekleşir. Yeni şekillenmiş olan sarmal orijinal hedef DNA’dan denatürasyon yolu ile ayrılır ve primer hibridizasyonunu, DNA sentezi ve denatürasyon siklusu tekrar edilir. Bütün DNA molekülleri reaksiyonun sonunda çift sarmallı olarak bulunur. TaqDNA polimeraz enzimi, 5’-3’ yönünden olmak üzere, ortamdaki nükleotidleri kullanırlar, primerlerin 3’ terminusuna nükleotidleri yerleştirir ve böylece hedef DNA sekansının bir kopyası elde edilir.

36 PCR NO 5

37 ÖZET OLARAK Enzim reaksiyonu için uygun sıcaklığa ulaşması ile DNA polimerazı, primeri uzatır. Her yeni sarmal sentezi yeni bir çoğalma anlamına gelmektedir. Sentezlenmiş DNA sarmalları matris olarak fonksiyon görmekte ve bu şekilde her bir siklus ile çoğaltılan kalıp DNA sarmal konsantrasyonu da artmaktadır. Önce orijinal matris boyunca yeni bir DNA sarmalı oluşturulur. DNA polimerazı kendiliğinden durana kadar veya yeni bir üreme siklusunun başlamasına kadar DNA sentezler.

38 ÖZET OLARAK İkinci siklusta negatif kopyanın uzunluğu henüz tam olarak belirgin değildir. Üçüncü siklustan itibaren aranan uzunlukta yeni ürünler oluşur. Dördücü siklustan itibaren bu kalıp sequens exponensial çoğalır. Bu kalıp sequensin kopyalama sayısı reaksiyon bitiminde (2n-2n) x formülü ile hesaplanır. n üreme siklusu sayısı, 2n bir ve ikinci siklustaki ürün (uzunluğu belli değil), x orijinal DNA matrisinin kopya sayısıdır.

39 Kalıp Sequensin Kopyalama Sayısı

40 ÖZET OLARAK Yüksek DNA-ürün konsantrasyonunda, ürünlerin kendisi de primer olarak etkiyerek spesifik olmayan ürünlerin sentezlenmesine de neden olabilir. Genelde siklus sayısı 100ng-1µg DNA’nın 50ng genomik DNA’dan sentezlenmesi için yeterlidir. Normalde PCR siklus arasında yapılır. Artan siklus sayısı ile birlikte siklusta arzu edilmeyen ürünler (artefekt) sayısı, kalıp DNA miktarı bu süre içerisinde sabit kalırken, artefekt sayısı çoğalır.

41

42 PCR AMPLİFİKASTON İŞLEMİNİN ETKİNLİĞİ
Burada dört faktör önemli rol oynar: Birincisi, PCR’daki amplifiye siklus sayısıdır. Geç PCR siklularının erken sikluslara oranla daha az etkili olduğu bildirilmiştir. İkinci önemli faktör, amplifiye edilecek hedef DNA miktarıdır. Yüksek konsantrasyonda hedef DNA ihtiva eden numunelerle çalışıldığında düşük konsantrasyondakilere nazaran daha küçük düzeyde bir amplifikasyonla neticelenir.

43 PCR AMPLİFİKASTON İŞLEMİNİN ETKİNLİĞİ
Üçüncü faktör hedef DNA sekanslarının uzunluğudur. PCR’ın etkinliği ile sekanslar arasında ters orantılı bir ilişki mevcuttur. Dördüncü önemli faktör ise primer bağlanması ve hibridizasyon için kullanılan ısı ile alakalıdır. Yüksek ısıda PCR’de önemli bir problem olarak kendini gösteren yanlış hibridasyon oluşma ihtimali küçüktür.

44 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
PCR’da kullanılan önemli komplementler TaqDNA polimeraz, primerler, deoksinükleotidler, hedef DNA ve magnezyum iyonlarıdır. TaqDNA Polimeraz Enzimi DNA polimeraz enzimi için önerilen miktar U/100µl olup bu miktarı aştığı takdirde spesifik olmayan ürünler şekillenebilir. TaqDNA polimeraz enzimi en iyi 70oC’de aktivite gösterir ve PCR’de denatürasyon için gerekli olan ısılara dayanıklıdır (90-95oC)

45 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
TaqDNA polimeraz enziminin, sıcaklığa duyarlı enzimlere karşı iki önemli üstünlüğü vardır; 1. Her denatürasyon siklusunu takiben enzim ilavesine gerek kalmaması. 2. Primerlerin bağlanmasının yüksek sıcaklıklarda daha spesifik ve DNA sentezinin de daha hızlı olmasıdır.

46 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
Primerler Konsantrasyonu için ise µMolar tavsiye edilmiştir. Yüksek konsantrasyonlarda kullanılan primerler, özellikle primer dimer adı verilen spesifik olmayan bantların oluşmasına yol açar. Primer dimerler küçük DNA ürünleri olup primerlerin birbirine bağlanması yada DNA polimeraz enziminin spesifik olmayan nükleotidleri kullanılmayan primerlerin uçlarına bağlanması neticesinde oluşan bantlardır.

47 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
Sentetik olarak kolayca hazırlanabilen tek iplikçikli DNA segmentleri olan primerler kullanılma amaçlarına göre, oligonükleotid den oluşmuşlardır. Bunlar, hedef DNA üzerinde kendine komplementer olan baz sıralarını bularak bağlanır ve burada (3’ terminus) DNA sentezinin ilerlemesine teşkil eder.

48 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
Pirimerlerin dizaynı Primerlerin dizaynında dikkat edilmesi gereken hususlar aşağıdaki gibi sıralanılabilir. 1. Prokaryotikler için primer uzunluğu nükleotidden ve ökaryotikler için ise nükleotidden ibaret olmalıdır. 2. Uzun primerler spesifiteyi arttırır. 3. Sarmalların 3’ uçlarına bağlanmasından kaçınılmalıdır. Bu primerlerin birbirlerine bağlanmalarına ve böylece primer dimerlerin oluşmasına sebep olabilir.

49 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
Pirimerlerin dizaynı 4. Adenin/timin ve guanin/citozin oranları yaklaşık olarak %50 veya hedef DNA’dakine benzer olmalıdır. 5. Primerler sürekli olarak 5’ ucundan 3’ ye doğru sentezlenmeli ve yazılmalıdır. 6. Primerlerin PCR reaksiyonundaki konsantrasyonları µMolar arasında olmalıdır.

50 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
Deoksinükleotid trifosfat Yeni DNA sarmalının sentezi için; dATP, dTTP, dGTP, dCTP; hepsi dNTPs olarak adlandırılan dört farklı deoksinükleotid trifosfata gereksinim vardır. Nükleotidlerin PCR karışımındaki konsantrasyonları µMolar olmalı ve 4 nükleotid de aynı oranda kullanılmalıdır.

51 PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI
Magnezyum iyonları Mg ++ iyon konsantrasyonunun primer bağlanması, kalıp DNA ve PCR ürünlerindeki çift sarmal yapının ayrılma ısısı, primer-dimer yapısı ve enzim aktivitesi üzerine etkisi bulunmaktadır. Gereğinden fazla miktarda Mg++ ortamda bulunması nonspesifik ürünlerin oluşumuna yol açarken; gerektiğinden az miktarlar ise istenen ürünün yeterince sentezlenmemesine neden olur.

52 PCR SONUÇLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ
PCR ile amplifiye edilmiş ürünlerin saptanmasında en yaygın kullanılan metot, bu ürünlerin uygun moleküler ağırlıkta bir marker ile birlikte Ethidium bromide ile boyalı agarose gel üzerine yükleyerek elektroforez işlemine tabi tutmak ve neticede ayrılan bandları UV transimulatör ile gözle görülür bir hale getirmektir. Bunun yanısıra bu teknikten daha duyarlı fakat hazırlanması ve kontrolü daha zor olan Poliakrilamide gel elektroforez (PAGE) metodu da kullanılabilir.

53 PCR SONUÇLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ
PAGE işlemine tabi tutulduktan sonra oluşan bantlar bazı tekniklerle (gümüş nitrat ile boyama yöntemi) boyanarak gözle görülebilir hale getirilirler. PAGE, özellikle küçük DNA fragmentlerinin separasyonunda agarose gel’e oranla daha etkilidir. Ayrıca PAGE’den elde edilen DNA oldukça saf olup değişik amaçlarla kullanılabilir. Buna karşılık agarose gel elektroforez sonucu elde edilen DNA çoğunlukla inhibitörler tarafından kontamine edilir. Agarose gel elektroforez horizontal olarak, PAGE ise vertikal olarak gerçekleştirilir.

54 PCR SONUÇLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ

55 PCR SONUÇLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ
Yukarıdaki metodlara ilaveten; PCR ürünlerinin analizinde, southern blot veya döt blot prosedürleri gibi radyoaktif olmayan spesifik probların kullanılmasına dayalı ve çok daha duyarlı olan metotlar da kullanılabilir. Bu metotların radyoaktif metotlara nazaran pek çok avantajı olmasına rağmen çok zaman almaları ve uygulamanın zorluğu nedeniyle kullanımları sınırlıdır.

56 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
PCR’ın en önemli avantajlarından biri olan çok yüksek duyarlılığı aynı zamanda bir dezavantaj olabilir. PCR’da en büyük risk, amplifiye edilmiş DNA’nın yeni bir reaksiyonundaki kontaminasyonudur. Yeni eldivenin PCR çalışma alanında kullanılması aynı şekilde kirlenmeleri de önler. Birçok kontaminasyonun kaynağının çalışanların eldivenlerine bulaşmış DNA’lar olduğu unutulmamalıdır.

57 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
Reaktiflerin bulunduğu tüplerin kapakları açılıp kapatılırken özen gösterilmeli; kolay açılan kapaklı tüpler tercih edilmelidir. Deneylerde PCR için özel olarak hazırlanmış otomatik pipetler kullanılmalıdır. PCR ürünlerinin incelenmesinde kullanılan aletler (elektroforez tankları vs.) bir molar HCl ile yıkanmalıdır. Kalıp DNA’nın hazırlanması mümkünse ayrı bir yerde ve PCR çalışma yerinden uzak yapılmalıdır.

58 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
Kalıp DNA içermeyen negatif kontrol her PCR’da birlikte yürütülmeli ve bu şekilde muhtemel bir kontaminasyonun olup olmadığı saptanmalıdır. DNA-plazmidi pozitif kontrol olarak diğer bir laboratuarda hazırlanmalı ve pipetlenmelidir. Her PCR işlemi ile her zaman arzu edilen sonuç sağlanamaz.

59 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
Sıklıkla, çift veya daha çok DNA bandı oluşması veya daha az yada hiç reaksiyon olmaması gibi problemler ortaya çıkabilmektedir. Çift veya daha fazla bandlar, asimetrik PCR, çok fazla kalıp DNA ilavesi, primer-dimerlerin oluşması, primerlerin tamplete DNA’nın birden fazla yerine bağlanması veya yabancı bir genin bulunması nedeniyle şekillenmektedir.

60 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
Çok az veya hiç reaksiyon ürünü olamaması, çok düşük kalitede veya çok düşük miktarda tampleteDNA oluşmasına, uygun olmayan denatürasyon-bağlanma-çoğalma süresi zamanı veya sıcaklığına yada primer ile birleşecek DNA alanında sekunder yapı oluşumuna bağlıdır. Bu bakımdan her durumda PCR protokolü yeniden gözden geçirilmeli ve gerektiğinde optimize edilmelidir. Yukarıda belirtilen açıklamalar dışında aşağıda belirtilen metodlarla PCR probleminin çözülmesi denenebilir.

61 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
Nested-PCR: Eğer kötü kalitede DNA veya sınırlı sayıdaki kopya ile kalıp DNA amplifiye edilmek istenirse, PCR duyarlılığı ile ilgili problemler ortaya çıkabilir. Nested-PCR (nPCR) ile DNA amplifikasyonunun duyarlılığı ve spesifikliği yükseltilebilir. Hot-Start-PCR: Hot-start PCR iki veya daha fazla bant oluşumunun önlenmesi için uygulanan bir metoddur. Bu metot oldukça basit olup, gerekli olan madde spesifik parafindir. Dimetilsulfoxid (DMSO): Çift band oluşumunun veya ürün oluşmasının engellenmesindeki 3. bir yol ise, PCR karışımına %1-4 dimetilsulfoksid ilavesidir.

62 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
Retroviral Transkriptaz (RT-PCR): PCR başlangıç inkübasyonunda retroviral bir transkriptaz ile birleştirilirse, DNA, tek sarmallı RNA’dan köken alarak da amplifiye edilebilir. Bu şekilde kombine reaksiyon RT-PCR olarak adlandırılır. Asimetrik PCR: Tek iplikli DNA’nın amplifikasyonu da mümkündür. Tek iplikli DNA’yı, bir PCR ürününden küçük miktarda (%1-2) alarak ve tek primeri sikluslar arasında kullanmak şartıyla, PCR sikluslarının tekrar edilmesi ile elde etmek mümkündür. Tek iplikli DNA kullanılması primerlerin hibridizasyonunu kontrol altına almak açısından avantajlıdır.

63 PCR’DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ
Boster PCR: Bu metotda düşük miktarlarda mevcut olan hedef sekansların etkili bir şekilde amplifiye edilmesini sağlamak için geliştirilmiştir. Multiplex PCR: PCR’ın bu modifikasyonunda birden fazla DNA segmentinin, birden fazla primer çifti kullanarak aynı amplifikasyon reaksiyonunda çoğaltılması söz konusudur. İnverse PCR: Burada çift iplikli hedef DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilir ve amplifikasyon işleminden önce DNA ligase ile çember halinde yeniden bağlanır.

64 PCR’IN AVANTAJ VE DEZAVANTAJLARI
PCR’ın en önemli avantajı hiç şüphesiz çok kısa süre içerisinde çabuk netice vermesi ve diğer rutin tekniklere oranla daha sensitif ve spesifik olmasıdır. Bu teknik özellikle kültürü güç olan veya uzun süre alan yada imkansız olan patojenlerin araştırmasında çok daha büyük öneme haizdir. PCR tekniğinin en önemli dezavantajı kontaminasyon problemidir. Bu durum yanlış pozitif sonuçlar elde edilmesine (düşük sensitivite) sebep olur.

65 PCR’IN KULLANIM ALANLARI
1. Hastalık etkeninin teşhisi a. Bakteriyel patojenlerin saptanması: PCR özellikle çoğaltılması zor ve uzun zaman alan patojenlerin çabuk teşhisi için kullanılır. b. Viral patojenlerin saptanması: Viral hastalıklar, viral RNA’nın varlığı aktif enfeksiyonun bir göstergesidir ve bu enfeksiyon enfekte hücrelerden elde edilmiş RNA’nın revers transkripsiyon sayesinde elde edilen cDNA kalıplarının PCR’da kullanılmasıyla teşhis edilir.

66 PCR’IN KULLANIM ALANLARI
c. Paraziter hastalıkların etkenlerinin saptanması: PCR, konakçı vücudunda çok az parazit veya bir tek parazit bulunması halinde bile parazit protein yapılarından bir tanesinin genetik parçasının sağaltılarak tanınabilir hale gelmesi ile laboratuarlarda kullanılmaya başlanmıştır. d. Patoloji ve klinik araştırmaları: Dondurulmuş cerrahi kesitler veya biopsi örnekleri materyal olarak kullanılabilir. PCR’ın etkin bir şekilde kullanılabilmesi; patoloji ve diğer klinik sahalarda yapılan araştırmaların kombine bir şekilde çalışması ile olur.

67 PCR’IN KULLANIM ALANLARI
2. Genetik hastalıkların teşhisi Kalıtsal ve sonradan kazanılan hastalıkların tespiti için Hücrelerin izolasyonu ve identifikasyonu için Gen terapisinde kullanılabilir Ekzotik ve tehlikeli hastalıkların teşhisi Yetiştiricilik programlarının gelişmesinde Yüksek duyarlılığı, hastalıkların erken teşhisine Organizma ve popülasyon biyolojisi çalışmalarında Nesli tükenmekte olan hayvanların korunmasında

68 Teşekkürler