Araştırma Yöntem ve Stratejileri

... konulu sunumlar: "Araştırma Yöntem ve Stratejileri"— Sunum transkripti:

1 Araştırma Yöntem ve Stratejileri

2 Deneysel Ablasyon Belirli bir beyin alanının imha edilmesi ve buna bağlı olarak hayvanın davranışının değerlendirilmesini içerir. Ablasyon belirli bir beyin alanının çıkarılması yolluyla yapılabilceği gibi lezyon yaratarak da gerçekleştirilebilir. Örneğin: Beynin belirli bir bölgesinin imha edilmesinin ardından görmeyi gerektiren bir görevi hayvan başaramaz hale gelirse, o zaman hayvanın kör olduğunu ve hasar veirlen alanın görme işlevinde bir rol oynadığı çıkarsanır.

3 Deneysel Ablasyon Burada araştırmacının amacı belirli bir davranışı gerçekleştirebilmeyi işlevleri anlamak ve her bir işlevden sorumlusinirsel devreleri belirlemektir.

4 Deneysel Ablasyon Parietal lob hasarı insanlarda haritayı takip edebilme ya da harita çizebilme becerilerini, daha önceden gördüğü nesnelerin uzamdaki yerlerini hatırlama becerilerini bozar. Bunlar aynı zamanda artimetik hesaplamaları yapmada da sorunlar yaşarlar.

5 Deneysel Ablasyon Lezyon çalışmalarının yorumlanması beyindeki bütün alanların birbiri ile bağlantılı olması nedeniyle çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Örnek: Sıçanlarda annelik davranışı-Septum ilişkisi. Septum hipocampus’un bazı işlevlerini başlatır veya durdurur.

6 Beyinde Lezyon Yaratmak
1. Beynin bir kısmının vakumlanması 2. Radyo frekansı ile lezyonun yaratılması 3. Excitotoxic lezyon. Kainic asit gibi bir aşırı uyarılma yol açan aminoasitin kullanılması ile sağlanır. Bunlar sadece hücre gövdelerini öldürür aksonlara zara vermez. Radyo frekansı ile lezyon. Excitotoxic lezyon.

7 Beyinde Lezyon Yaratmak
Radyo frekansı ile lezyon. Beyinde Lezyon Yaratmak 4. 6-hydroxydopamine (6-HD) tekniği. Bu kimyasal sinir hücrelerini zehirler ve öldürür ve norepinefrin ve dopamine benzediği için dopominerjik ve noradrenerjik nöronların akson ve terminal ayaklarında yer alan taşıyıcı moleküller tarafından alınır. Sham Lezyonları Excitotoxic lezyon.

8 Kalıcı ve Geçici Beyin Lezyonları
Lokal Anestetikler ile geçici lezyonlar Cryode kullanılarak beyin dokusunun soğutulması suretiyle gerçekleştirilen geçici lezyonlar Stereotaxic Ameliyat Stereotaxic cihaz Stereotaxic atlas Cryode.

9 Başlangıçta fontanelle (bıngıldak) bregmayı oluşturur.
Stereotaxic atlas Sütürler Başlangıçta fontanelle (bıngıldak) bregmayı oluşturur. Sıçan beyninde kafatası birleşim yerleri ile elektrodun yerleştirileceği hedef bölge arasındaki ilişki. Sıçan beynine ilişkin stereotaxic atlastan bir örnek sayfa (fornix).

10 Stereotaxic Cihaz Sıçanlarda beyin ameliyatı yapmada kullanılan bir stereotaxic alet.

11 1. Sabitleme ve kesit alma 2. Boyama 3. Elektron mikroskopisi
Histolojik Yöntemler Beyin lezyonları zaman zaman planlanan lezyon alanından sapabilir. Dolayısıyla hayvanı davranışsal olarak test ettikten sonra beyindeki hasarın yerini incelememiz gerekir. Bunu gerçekleştilrmek için sabitleme, kesit alma, boyama ve beyin inceleme yapmamız gerekir. 1. Sabitleme ve kesit alma 2. Boyama 3. Elektron mikroskopisi Sıçanlarda beyin ameliyatı yapmada kullanılan bir stereotaxic alet.

12 Histolojik Yöntemler Sabitleme ve Kesit Alma İlk önce doku temizlenir (dokudaki kan sulandırılmış tuzlu su içeren tanklarda yıkanır) Formalin tarzı bir sabitleyici kullanılır böylece: a. Doku autolytic enzimlerden arındırılır b. Bakteri ya da küflenmeye karşı dokunu parçalanmaktan korunmuş olur.

13 Sabitleme ve Kesit Alma
Histolojik Yöntemler Sabitleme ve Kesit Alma Beyin sabitlendikten sonra kesitlere ayrılır ve anatomik ayrıntıları görünür kılmak üzere çeşitli hücresel yapılar boyanır. Microtome kesit almada kullanılan araca verilen isimdir (kesitler genellikle µm kalınlığındadır) Dokunun kesilmesinden sonra elde edilen kesit cam mikraskop slaytlarına yerleştirilir. Ardından doku boyanır oldukça ince bir cam ile üstü kapatılır. Microtom.

14 -Cresyl violet (menekşe mavisi)
Histolojik Yöntemler Boyama Mikroskobik nöroanatomi çalışmaları özel bir takım histolojik boyaları gerektirir. -Methylene blue (Sitoplazmada yer alan Nissle substance adı verilen madde boyayı emer) (böylece hücre gövdeleri görünür kılınmış olur) -Cresyl violet (menekşe mavisi) -Hücre gövdesi boyalarının keşfi beyindeki çekirdek kitlelerini belirlenmesini mümkün kılmıştır. Bir hücre gövdesi boyası olan cresyl violet ile boyanmış kedi beyninden alınmış bir frontal kesit. Oklar çekirdeklere veya hücre gövdesi gruplarına işaret etmektedir.

15 Histolojik Yöntemler Elektron Mikroskopisi
Bir aksodentritik sinaps kesitine ilişkin bir elektron fotomikrografisi. Sinir hücresi ve glialara ilişkin bir elektron tarama mikrografisi.

16 Sinirsel Bağlantıların İzinin Sürülmesi
Örnek: Dişi sıçanlarda VMH lezyonlu ve sham ameliyatlı gruplar. Götüren (efferent) aksonların izinin sürülmesi Anterograde etiketleme yöntemi Anterograde axoplasmic transport. -VMH’ye az miktarda PHA-L enjekte edilir. -Birkaç gün sonra özel bir immunocytochemical yöntem kullanılarak PHA-L molekülleri görünür hale getirilir ve mikroskop altında incelenir. Belirli beyin alanlarının belirli bir işlevle ilişkili olduğu saptandıktan sonra şu soruların sorulması gerekir. Bölgeye girdi sağlayan yapılar nelerdir ve hangi yapılar bu bölgeden çıktılar almaktadır.

17 Sinirsel Bağlantıların İzinin Sürülmesi
Götüren (efferent) aksonların izinin sürülmesi Immunocytochemical Yöntem Antibody molekülleri çeşitli tiplerdeki boya moleküllerine bağlanma eğilimindedir bu boyaların bazıları diğer bazı kimyasallar ile reaksiyona girer ve dokuyu kahverengiye boyar. Diğerleri florasandır. Antibodyler kendilerini kendi antigenlerine bağlar. Götüren aksonların izini sürmede kullanılan PHA-L tekniğinin kullanımı.

18 Sinirsel Bağlantıların İzinin Sürülmesi
Götüren (efferent) aksonların izinin sürülmesi -VMH’ye PHA-L enjekte edilir. -İki gün sonra hayvan öldürülür. -Beyin kesitleri PHA-L’ın bir antibody’si ile işleme sokulur, PHA-L’ın yer aldığı kısımlar kahverengiye döner. Anterograde etiketleme yöntemi.

19 Sinirsel Bağlantıların İzinin Sürülmesi
Götüren (efferent) aksonların izinin sürülmesi Retrograde Etiketleme Yöntemi. Retrograde axoplasmic transport. VMH önceki devreler? Nöral devrede bilginin geldiği yere doğru bileşenler neler olabilir?: Dokunma, görme, erkeğin kokusu? Retrograde etiketleme yöntemi. Fluorogold VMH’ enjekte edilir, burada terminal ayaklar tarafından alınır ve akson boyunca hücrenin gövdesine taşınır. Resimde medial amygdala’da yer alan hücre gövdeleri görülmekte.

20 Sinirsel Bağlantıların İzinin Sürülmesi Parçaları Birleştiriyoruz
VMH’gelen ve buradan çıkan yolaklar anterograde ve retrograde işaretleme yöntemleri ile ortaya konmuştur.

21 Yaşayan İnsan Beyninin Çalışılması
Bilgisayarlı Tomografi Computerized Tomography (CT) Hastanın kafası geniş simit şeklindeki bir halkanın içerisine yerleştirlir. Halka bir X ışını tüpü içerir ve tam tersinde X ışın saptayıcısı yer alır. A computerized tomography (CT) scanner.

22 Yaşayan İnsan Beyninin Çalışılması
Computerized Tomography 5 numaralı slaytta Occipital-parietal alanda bir lezyon görünmektedir (beyin kanaması nedeniyle bireken kan daha fazla radyasyonu emdiği için kanmalı bölge beyaz görünmektedir). CT slaytları.

23 Yaşayan İnsan Beyninin Çalışılması
Magnetic Resonance Imaging (MRI) MRI tarama CT taramaya benzemekle beraber X ışınlarını kullanmak yerine hastanın kafasını güçlü bir manyetik alan uygular. MRI tarayıcısı hidrojen moleküllerinden yayılan radyasyonu saptayacak şekilde çalışır. CT taramasından farklı olarak MRI taramaları sadece yatay değil aynı zamanda frontal ve sagital düzlemlerde de tarama yapar. Bir migsagital MRI taraması

24 Summing Up Amaç Yöntem Notlar
Belirli bir beyin alanını imha etmek ya da inaktif hale getirmek Radyo frekansıya lezyon yaratmak Aşırı uyarıma yolaçan toksik madde ile lezyon yaratmak Lokal anestetik kullanmak Elektrodun ucuna yakın tüm beyin dokusu imha edilir Sadece kanüla civarındaki hücre gövdeleri imha edlir; bölgeden geçen aksonlara zarar verilmez. Belirli bir beyin bölgesi geçici olarak inaktif hale getirilir Beynin belirli bir bölgesine elektrot ya da kanüla yerleştirmek Stereotaxic ameliyat Koordinatların saptanması için stereotaxic atlastan yararlanılır Lezyonun yerini bulmak Beyin temizlenir (perfusion); sabitlenir; kesitler alını; kesitler boyanır Belirli bir bölgeden çıkan aksonları ve bu aksonların teminal ayaklarını saptamak Fluorogold gibi geriye doğru (retrograde) iz-sürme yöntemi kullanılır Yaşayan insan beyninde lezyonun yerini bulmak Bilgisayarlı tomografi (CT scanner) Manyetik resonans görüntüleme (MRI scanner) Beyni kesitler halinde gösterir Beyni kesitler halinde gösterir (CT scan’dan daha yüksek detay elde edilir)

25 Sinirsel Aktivitenin Kaydedilmesi ve Uyarılması
Belirli bir alana ilişkin elektriksel aktivite çeşitli davranışlarda bölgenin oynadığı rolü belirlemek için kullanılabilir. Örnekler: uyarıcı sunumu sırasında karar vermede, motor aktivitelerde vb. Kronik Kayıt Akut Kayıt Mikroelektrotlarla Kayıt Makroelektortlarla Kayıt

26 Sinirsel Aktivitenin Kaydedilmesi ve Uyarılması
Mikroelektrotlarla Kayıt Tek Ünite Kaydı Biri ısı kaynağı ve mikroelektrot çektiricisi kullanarak cam elektrotların hazırlanması. Elektrotların potasyum klorit gibi iletken bir sıvı ile doldurulması. Bunun yerine ince tungsten kablolar da kullanılabilir. Kablo ucu asit çözeltisinin içinde keskinleştirilir. Kılcal cam tüplerin ısıtılması ve uçlardan çekilmesi ile mikroelektrotların üretilmesi.

27 Sinirsel Aktivitenin Kaydedilmesi ve Uyarılması
Miikroelektrotlarla Kayıt Mikroelektrotlar tarafından saptanan elektriksel sinyallerin yükseltilmesi gereklidir. Bu sinyaller bir osiloskop ekranında gösterilebilir ve daha sonra analiz etmek üzere bir bilgisayarın hafızasında saklanır. Örnek: serotonerjik ve noradrenerjik nöronları etkileyen ilaçlar aynı zamanda REM uykusunu da etkiler. Biz serotonerjik ve noradrenerjik sinirlerin aktivitesinin farklı uyku evrelerinde değişiklik gösterip göstermediğini merak ediyoruz. Eğer uykunun değişik evrelerinde noradrenerjik ve serotonerjik sinirlerin aktivitesini kaydedersek bu sinirlerin REM uykusunda ateşlenme oranının neredeyse sıfır düzeyin düştüğünü buluruz. Bu da bize bu sinirlerin REM uykusu üzerinde ketleyici bir etkisinin olduğunu gösterir. Yani bu sinir hücreleri durmadan REM uykusu gerçekleşemeyecektir. Kalıcı elektrotların beyne yerleştirilmesi bağlatıyı sağlayan bir priz kafatası üzerine yapıştırılmıştır.

28 Sinirsel Aktivitenin Kaydedilmesi ve Uyarılması
Makroelektrotlarla Kayıt Sinir hücrelerinden biraysel aktivite ölçümlerini değil bir bütün olarak bir beyin bölgesinin aktivitesinin kaydedilmesine ilişkindir. Bu araçlarla elde edilen kayıtlar elektrotun yerleştirildiği alandaki binlerce ya da milyonlarca hücrenin postsnaptik potansiyellerini temsil eder. Genellikle polygraph olarak adlandırılan mürekkepli osilograftan bir kayıt.

29 Sinirsel Aktivitenin Kaydedilmesi ve Uyarılması
Makroelektrotlarla Kayıt Electroencephalograms (EEGs) Çeşitli davranışlar sırasında sıçan hipocampusunden elde edilmiş EEG aktivitesi.

30 Sinirsel Aktivitenin Kaydedilmesi ve Uyarılması
Beynin Metabolik ve Sinaptik Aktivitesinin Kaydedilmesi 2-DG Autoradiography Sinirsel Aktivite – Metabolik Aktivite Deneyci hayvana radyoaktif 2-deoxyglucose (2-DG) enjekte eder. 2-DG glikoza benzer fakat metabolize olmaz. Bu sayede 2-DG hücre içerisinde kalır. Ardından araştırmacı hayvanın beynini autoradiography için hazırlar. Sıçan beyninde bir 2-DG autoradiogramı (frontal kesit)

31 Sinirsel Aktivitenin Kaydedilmesi ve Uyarılması
Beynin Metabolik ve Sinaptik Aktivitesinin Kaydedilmesi Positron Emission Tomography (PET) 1. Hastaya radyoaktif 2-DG enjeksiyonu yapılır. 2. Bilgisayar beynin hangi bölgesinin radyoaktif maddeyi kullandığını belirler. Bir insan beynininden bir PET scan görüntüsü.

32 Sinirsel Aktivitenin Uyarılması
Elektiriksel Beyin Uyarımının Davranışsal Etkileri Epilepsi hastalarında beynin elektiriksel uyarımı Panfield & Jasper (1954) tarafından geliştirlmiştir

33 Özet Amaç Yöntem Notlar
Tek sinir hücresindeki elektriksel aktiviteyi ölçmek Cam ya da metal mikroelektrotların kullanılması Metal mikroelektrotlar kronik olarak yerleştirilerek hareket halindeki hayvandan sinirsel aktivite kaydı yapılır. Beyin alanlarından elektriksel aktiviteyi ölçmek Metal elektrotlar Insanda genellikle kafa derisine özel bir jel kullanılarak bağlanır. Beyin alanlarındaki metabolik aktiviteyi ölçmek 2-DG otordyografisi Beynin çeşitli bölgelerindek glükoz kullanımını ölçer. Sinir hücrelerinden salınan nörotransmitter ya da nöromodülatörleri ölçmek 2-DG PET tarama İnsan beyninde bölgesel metabolik activite ölçülür Canlı insan beyninde nörokimyasalları ölçmek Mikrodiyaliz PET tarama Oldukça çeşitli maddeler analiz edilebilir. Beyindeki radyoaktif maddelerin yeri belirlenir. Sinirsel aktiviteyi uyarmak Elektriksel uyarım Uyarıcı (excitatory ) amino asit ile kimyasal uyarım Elektrodun ucuna yakın sinir hücreleri ve bölgeden geçen aksonlar uyarılır. Sadece elektrodun ucuna yakın sinir hücreleriuyarılır, bölgeden geçen aksonlar uyarılmaz.