LABORATUVAR UYGULAMALARI

... konulu sunumlar: "LABORATUVAR UYGULAMALARI"— Sunum transkripti:

1 LABORATUVAR UYGULAMALARI
GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI DNA, RNA, Protein Doç. Dr. Hilâl Özdağ

2 Moleküler Lab’ında İpuçları
Ne yaparsanız yapın niye yaptığınızı, yapılan işin gerisinde yatan teoriyi öğrenin. Hazır kit tüpten tüpe aktarırım işte düşünürseniz çuvallarsınız! Eğer bir protokol çalışıyorsa yeni bir protokol bulmak, mevcut protokolü değiştirmek için uğraşıp en değerli olan vaktinizi harcamayın. Bir kit sipariş etmeden önce aklınızı kullanın. Mevcut kitlerin bir kısmının laboratuvarda rahatlıkla hazırlayabileceğiniz/bulabileceğiniz tampon çözelti, enzim, kontrol DNA vs’den oluştuğunu unutmayın.

3 Moleküler Lab’ında İpuçları
Meslektaşlarınızla, hocalarınızla sonuçlarınızı tartışmaktan çekinmeyin. Kontrolsüz deney kurmayın. Büyük paralar verip satın aldığınız kitlerin hatalı/bozuk olma ihtimalini göz ardı etmeyin. Herşeyi etiketleyin. Eski/işi bitmiş tüpleri biriktirmeden atın.

4 DNA Oldukça dayanıklı bir molekül olmasına rağmen çok itinalı çalışmak gerekir. Genomik DNA Plazmid DNA’sı (Mini, Midi, Maxi prep) Kitle izolasyon mümkündür Fenol kloroform izolasyonu en çok tercih edilen yöntemlerin başında gelir. DNA’nın her şartta kaliteli olması gerekir. Ancak bazı reaksiyonlar (DNA dizilemesi, restriksiyon haritalama, transfeksiyon) için DNA’nın kalitesi özellikle önemlidir.

5 DNA Fenol-Kloroform ekstraksiyonu:
Fenol:Kloroform: İzoamil alkol 25:24:1 oranında karışım olarak hazırlanır veya satın alınır. Fenol kristal halinde satın alındıysa su banyosunda eritilip tris tampon çözeltisi ile (pH 7.0) ile doyurulur. Fenol tercihen sıvı ve dengelenmiş olarak satın alınmalıdır. Fenol proteini bağlar. Kloroform fenolü bağlar. İzoamil alkol fenol fazı ile sulu fazın daha net bir biçimde ayrılmasını sağlar. Ekstraksiyon sulu fazın rengin açılıncaya dek devam edilmelidir. Sulu faz ile fenol fazının birleştiği hatta temas etmemeye özen gösterilmesi protein kontaminasyonunu engelleyecektir. Fenol ekstraksiyonu çeker ocak altında yapılır. Fenol atıkları kimyasal atık muamelesi görmelidir.

6 DNA Alkol presipitasyonu:
%95 veya %100 (absolut) EtOH soğuk olarak kullanılmalıdır. Bu amaçla muhakkak -20oC’de vidalı kapaklı şişede alkol (%95, veya %100’lük ile %70’lik EtOH) bulundurulmalıdır. %95 veya %100’lük EtOH presipitasyonu sonrası tüpteki alkol yavaşça dökülebilir. DNA pelleti bu aşamada kıpırdamayacaktır. %70’lik EtOH ile çöktürmeden sonra ise hacim önemli bir kısmı yavaşça döküldükten sonra kalan EtOH vakumlu santrifüjde, laminar akışlı kabinde uçurulabilir. Presipitasyon amaçlı santrifügasyonda bütün tüpler santrifüje aynı şekilde yerleştirilmelidir. Pellet görünsün görünmesin rotorun dış yüzeyine bakacak konuma çökecektir.

7 DNA Spektrofotometre: Kuartz küvetler çizilmemeli kırılmamalıdır.
Tek kullanımlık küvetle çalışan spektrofotometreler mevcuttur. Az miktarda örnek hazırlamak için bazı cihazların küçük hacimli küvetleri bulunmaktadır. 1 veya 2 ul örnek okuyabilen küvetsiz sistemler mevcuttur. DNA konsantrasyonunun okunmasında plaka okuyucular picogreen kitleri veya UV plakalar kullanıldığında başarılı sonuçlar vermektedir. 260 nm DNA max abs 280 nm Protein max abs 230 nm Fenol max abs

8 DNA Restriksiyon Endonükleaz: Buz üzerinde çalış
Aseptik koşullarda çalış Sürekli olarak kullandığın restriksiyon enzimi varsa kendi stoklarına ait enzim bulundurmanda fayda vardır (en azından buffer senin stokunda bulunmalı).

9 PCR

10 P C R Reaksiyonda kullanılanlar: Kalıp DNA
PCR degrade olmuş DNA ile de çalışma imkanı veren bir teknik olmakla beraber özellikle hedef amplikonun boyu arttıkça kullanılacak DNA’nın bütünlüğü önem kazanır. Kullanılacak genomik DNA’nın A260/A280 oranının temizliğinin bir göstergesi olarak arasında olması gerekir. A260 Nükleik asitlerin maksimum absorbans, A280 Proteinlerin maksimum absorbans, A230 ise fenolün maksimum absorbans verdiği dalga boyudur. +4 (kısa-orta süreli) veya -20oC’de (uzun süreli) saklanmalı. Genomik DNA esas itibariyle oda ısısında da stabil olmakla beraber daha güvenilir olan ısı ayarlı soğuk ortamlarda saklanmalıdır.

11 P C R Reaksiyonda kullanılanlar:
II. Düz primer ve ters primer: Tasarım kriterlerine uygun olarak seçilmiş primerler genellikle bç arasında olan oligonükleotidlerdir. Primerler üreticilerinden 3 farklı yöntemden biri ile saflaştırılmış olarak alınır. Tuzdan arındırma (desalting)- En ucuz yöntemdir, ancak özellikle primerler dizi analizi benzeri uygulamalarda kullanılacaksa bu yöntem tercih edilmemelidir. Kolon bazlı saflaştırma (OPC/HPSF benzeri)- Çok temiz sonuç veren tuzdan arındırma yöntemine göre pahalı ancak HPLC’ye göre ekonomik olan bir seçimdir. HPLC- En başarılı saflaştırma yöntemi olmakla beraber maliyeti en yüksek olan seçimdir. Genellikle liyofilize halde gelen primerler steril ortamda 100 pmol/ul olacak şekilde sulandırıldıktan sonra bu stoktan 10 pmol/ul’lik bir dilüsyon hazırlanıp reaksiyonlarda kullanılabilir.

12 P C R Reaksiyonda kullanılanlar:
III. dNTP: Eşit konsantrasyondaki dATP, dGTP, dCTP ve dTTP’nin karışımıdır. Karışım halinde veya ayrı ayrı olarak satın alınabilir. Genellikle 100 mM konsantrasyonda satılan dNTP karışımlarının stok halinde 10 mM konsantrasyonda olması tercih edilir. Herhangi bir kontaminasyon riskine karşı kullanıma açılan dNTP miktarı ul üzerinde olmamalıdır. Bu amaçla dNTP hazır olarak geldiğinde veya laboratuvarda hazırlandığında küçük hacimlere bölünerek saklanmalıdır. IV. MgCl2: Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için gerekli kofaktör olarak görev alan Mg iyonunu sağlar. Genellikle 25 veya 50 mM stok konsantrasyonda gelir. Reaksiyondaki son konsantrasyonu mM arasında değişir. V. 10X buffer: Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için gerekli stabil pH şartlarını sağlar. Reaksiyondaki son konsantrasyonu 1X olacak şekilde kullanılır.

13 P C R Reaksiyonda kullanılanlar:
VI. Taq DNA Polimeraz: Thermus aquaticus adlı termofil bir bakteriden elde edilen ve PCR reaksiyonlarında kullanılan bu DNA polimerazların hata oranı 1x10-4’dir. Enzimler protein oldukları için denatüre olma riski taşırlar, ayrıca ortam şartları aktiviteleri üzerine etki eder. Bu nedenle düşük ısıda saklanmaları gerekir. Ancak düşük ısıda donacakları için denatüre olurlar. Bunu engellemek için enzim stokları gliserol içinde gelir ve -20oC’de saklanır. -80oC’de gliserol de donacağı için Taq pol’ın -80oC’de saklanması tercih edilmez. Amplifiye edilecek bölge klonlanacaksa hatasız olması istenir. Bu nedenle hata oranı daha az olan enzimler tercih edilir. Pfu polimeraz Pyrococcus furiosus’tan izole edilmiştir hata oranı 1.5x10-6 Vent polimeraz Thermococcus litoralis’ten izole edilmiştir hata oranı Taq ile Pfu arasında seyreder.

14 P C R Örnek Reaksiyon (50 ul toplam hacim için)
Stok Konsantrasyon/Miktar Son Konsantrasyon Kalıp DNA ng genomik DNA ng/µl Düz Primer 10 mM;10pmol/µl pmol/µl Ters Primer mM;10pmol/µl pmol/µl dNTP 10 mM µM MgCl mM mM 10X buffer 10X 1X Taq DNA Polymeraz 5 U/ µl µl Toplam 50 µl (steril deionize su ile hacim tamamlanır)

15 P C R Neredeyse hiçbir zaman tek bir reaksiyon kurulmadığı için muhakkak bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Tampon, primerler, MgCl2, dNTP, Taq pol ve sudan oluşan Pipetleme hatalarını engellemek üzere karışım olması gerekenin %10 fazlası olacak şekilde hazırlanır. Negatif kontrol Kalıp DNA olmayan bir tüp hazırlanır. Örnekler arası kontaminasyonu kontrol etmek üzere Pozitif kontrol PCR’da kullanılan reaktiflerin dolayısıyla sistemin işlediğinden emin olmak için çalıştığı bilinen bir DNA ve primer seti ile pozitif kontrol reaksiyon setine dahil edilmelidir.

16 Genel Problemler Bant yok veya zayıf. Kontaminasyon var.
Primer dimer oluşumu var. Özgün olmayan bant(lar) var.

17 Kontaminasyon Pre ve post PCR alanları muhakkak birbirinden ayrılmalı.
Mümkünse PCR laminar akışlı kabin içinde kurulmalı. Bütün reaksiyon setlerinde muhakkak negatif kontrol bulunmalı Reaktifler küçük hacimlere bölünüp saklanmalı. Problem yaşandığı takdirde atılmaları mümkün olduğunca ekonomik olmalı. Filtreli uç kullanılmalı ki pipetler kontamine olmasın.

18 Bant yoksa veya zayıf ise…
Reaksiyona koymanı gereken bütün reaktifleri ilave ettiniz mi? Lab defterinizi kontrol edin. Reaksiyonu tekrarlayın. Reaktiflerin konsantrasyonları doğru mu? Kalıp Primer Taq MgCl2 Hatalı primerler Dizileri kontrol edin. Yeni sentez veya yeni tasarım deneyin.

19 Bant yoksa veya zayıf ise…
Kötü kalıp Agaroz jelde kalıp DNA’yı kontrol edin. DNA fazla degrade olabilir. Kalıp DNA PCR inhibitörü içeriyor olabilir (fazla tuz, fenol gibi). Optimal olmayan PCR şartları Bağlanma ısısını düşürün. MgCl2 konsantrasyonunu arttırın.

20 Özgün olmayan amplifikasyon var ise…
Özgün olmayan amplifikasyonu saptamak için Amplikonları agaroz jelde yürütün. Ürünün hedeflenen boyda olup olmadığını kontrol edin. Bunu saptamak için bir moleküler ağırlık standardı kullanın (100 bç, 1 kb merdiven, l/HindIII gibi) Özgün olmayan amplifikasyonu ortadan kaldırmak için Amplifikasyon şartlarını sıkılaştırın Bağlanma ısısını arttırın MgCl2 konsantrasyonunu düşürün Termal döngü koşullarını değiştirin Uzama sürelerini ayarlayın Döngü sayısını azaltın Farklı primerler deneyin

21 PCR optimize ederken… PCR son derece hassas bir işlemdir.
Herbir primer çiftinin ayrı ayrı optimizasyonu gerekir. Farklı PCR cihazlarının (marka ve/veya model) kullanımı PCR’ın sonucunu etkiler. Optimize edilmesi gerekenler: Konsantrasyonlar MgCl2 konsantrasyonu Primer ve kalıp DNA konsantrasyonu Fazla kalıp PCR’ı engelleyebilir. Kalıp gerekiyorsa seyreltilip kullanılmalıdır. Termal döngü şartları Bağlanma ısısı Primer çiftinin Tm derecesine göre ayarlanır. Uzama süreleri Amplikonun uzunluğu dikkate alınır.

22 PCR optimize ederken… Gradient PCR cihazları optimizasyon sürecini kolaylaştırır ve kısaltır Bu tip cihazlarda 96’lık veya 48’lik bloğun herbir 8’lik kolonuna farklı bağlanma ısıları uygulamak mümkündür.

23 PCR optimize ederken… Touch-down (İnen) PCR
Özgün olmayan amplikasyondan yalnızca bağlanma ısısının arttırılması ve MgCl2 konsantrasyonunun düşürülmesi ile kurtulunamıyorsa: Touch-down PCR denenir. Yüksek bağlanma ısısı ile başlanır. (mesela 70oC) Az sayıda da olsa hedef dizinin amplifiye olması beklenir. Bağlanma ısısı döngü sayısı ilerledikçe düşürülür. Amplifiye olmaya başlayan hedef dizinin kalıp popülasyondaki oranı arttığı için düşen ısıda artık yalnızca hedef dizi çoğalacaktır.

24 PCR Destek Kuvvetler… DMSO %2-10 Fazlası Taq aktivitesini düşürür. Kalıp DNA’nın oluşturduğu ikincil yapıları çözer. Özellikle GC oranı yüksek hedef bölgelerin çoğaltılması için kullanılabilir. Betain M DMSO ile aynı amaçla kullanılabilir. Formamid %1-5 Mümkün olduğunca az kullanılmalı. İkincil yapıların önlenmesinde kullanılabilir. Non iyonik deterjanlar (Tween 20-NonIdet P40- TritonX) %0.1-1 arası kullanılabilir. %0.1 Taq’ı stabilize eder ancak özgün olmayan amplifikasyonu teşvik edebilir. %0.5 kullanımı daha garantilidir.

25 PCR optimize ederken… 7 deaza-2 deoksi guanozin. Stabil ikincil yapı oluşturan GC oranı çok yüksek hedef bölgelerde amplifikasyonu dGTP ile 1:3 oranında ilave edilmek suretiyle verimli bir şekilde sağlar. BSA (bovine serum albumin) Eski DNA materyellerinden yapılan amplifikasyonlarında kullanılabilir. PCR inhibitörlerinin etkisini azaltır.

26 Hücre ve Mikroorganizmalara DNA Aktarımı
Prokaryotik hücreler: Bu tip aktarımlar yani transformasyon klonlanmış DNA’nın amplifikasyonunu sağlar. Transforme edilen gen ekspresyon vektörünün içinde ise ilgili genin ürününü elde etmekte kullanılır. İki türlü yolu vardır: Yüksek konsantrasyondaki Ca2+ içinde inkübasyon. Membran permeabilitesini arttırır bu yöntem. Elektroporasyon: Özel cihazlar gerekir. Daha verimli transfer sağlar ancak her tür/suş için farklı şartlar gerekir.

27 Kompetent hücre Hem Ca2+ hem de elektroporasyon yönteminde öncelikli olarak hücrenin kompetent hale getirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla belli bir yoğunlukta üretilip toplanması ve tuzla yıkanması gerekmektedir.

28 Ökaryotik hücreler Ökaryotik hücrelere gen transferinde kullanılan birkaç çeşit yöntem bulunmaktadır. Transfeksiyon transformasyon ile enfeksiyonun bir nevi karışımıdır. Kalıcı (stable) transfeksiyonda DNA’yı alan hücreler raportör geni ifade etmeleri ile seçilirler (raportör gen higromisin veya neomisin gibi bir antibiyotik direnç geni olabileceği gibi yeşil fluoresan protein geni de olabilir.). Bu tip hücrelerin klonlarından hücre hatları oluşturulabilir. Geçici (transient) transfeksiyon aktarılan DNA’nın etkisini hemen görebilmek için seçilen bir yoldur. Sınırlı uygulaması vardır zira ilgilenilen geni taşıyan hücre sayısı değişkendir (kesin sayı transfeksiyonun verimine bağlıdır). Ayrıca aktarılan DNA’yı taşıyan hücrelerde bu DNA’nın kopya sayısı da değişkendir.

29 Ökaryotik hücreler Transfeksiyon yolları:
Kalsiyum fosfat ko-presipitasyonu DEAE-Dekstan aracılı transfeksiyon Lipid aracılı transfeksiyon Elektroporasyon Mikroenjeksiyon Virus aracılı transfer. Bu amaçla adenovirus, retrovirus veya SV40 kullanılabilir.

30 Ökaryotik hücreler DNA transferinin verimini hücre tipine sıkı sıkıya bağlı olduğu için bir sürü emek ve zaman harcamadan önce kendi hücreleriniz için uygun olan protokolü iyice araştırın. Literatür, Google ve bu işi bilenlere sorun/danışın. Labınızda veya yardım alabileceğiniz bir labda kullanabileceğiniz bir elektroporatör olup olmadığından emin olun. Birçok elektroporatörle bakteri, maya, memeli hücreye DNA aktarımı yapabilirsiniz. Memeli hücre aktarımı için bazı model elektroporatörlere ilave aksesuar takılması gerekebilir. Transformasyon ve transfeksiyonda kullanılan vektör hayati önem taşır. İndüklenebilen vektörlerin yanısıra hem ökaryotlarda hem bakterilerde çalışan vektörler mevcuttur. Sorun öğrenin.

31 RNA Son derece “çıtkırıldım” bir moleküldür.
Azami itina ile çalışılmasını gerektirir. RNA çalışmaları için kullanacağınız cam/plastik eşyayı diğer malzemelerden ayrı bir dolap/rafa yerleştirin. Bunları DEPC’li sudan geçirdikten sonra steril edin. RNA çalışmaları için kullanacağınız suyu %0.1 konsantrasyonda DEPC’li olarak hazırlayın. Bunun için 1 lt suya 1 ml DEPC ilave edip geceboyu çeker ocak altında manyetik karıştırıcıda karıştırdıktan sonra ertesi gün otoklavlayın. Tris’li tampon çözeltileri DEPC’li su ile hazırlamayın. DEPC Tris tamponları içinde etanol ve CO2’e ayrışır. Tris tamponun tamponlama özelliğini ortadan kaldırır.

32 RNA RNA çalışmalarında kullandığınız kimyasalları ayrı bir raf/dolaba koyup üzerlerine yalnızca RNA çalışmaları için kullanılacağı ibaresini yazın. Bu kimyasalların içine steril spatül ile girin. RNA çalışmalarında kullandığınız tampon çözeltileri de ayrı bir köşede tutun ve üzerlerine yalnızca RNA çalışmaları için kullanılacağı ibaresini yazın. RNazOFF, RNAZap, RNazAWAY benzeri ticari kimyasallar ortamdan Rnaz’ları uzaklaştıran kuvvetli deterjanlardır. RNA elektroforezi için bir horizontal elektroforezi ayırmanızda fayda vardır. Bu elektroforez kabin, tepsi ve taraklarını bu deterjanlarla yıkayıp, DEPC’li sudan geçirdikten sonra kullanın.

33 RNA İzolasyonu Klasik metodda guanidium izotiyosiyanat kullanılır. Bu kimyasal hücrelerin parçalanması ile gerçekleşecek olan RNA degradasyonunu engeller. Bu metoda dayanan izolasyon için ticari olarak Trizol, Tritidy, Tri reagent vb kimyasal ajanlar değişik firmalarca satılmaktadır. Ayrıca kolon bazlı saflaştırma kitleri de birçok firma tarafından pazarlanmaktadır. Özellikle kas gibi fibrotik dokulardan RNA izole etmek bir hayli zordur. Bu tip dokular için özel olarak üretilmiş kitler piyasada mevcuttur. mRNA izolasyonu oligo dT rezinler kullanılarak gerçekleştirilir.

34 PROTEİN Degradasyon protein çalışmalarının en önemli sorunlarından biridir. Protein çalışmalarında olmazsa olmaz kurallar: Muhakkak buz üzerinde çalışılır. Buzdolabı ve derin dondurulardan bir malzeme alınmaya veya yerleştirmeye gidilirken, tezgahta deney yaparken yanında, elinde hep bir buz kovası olmalıdır. Soğukta santrifügasyon yapılır. Çalıştığın proteini tanı!: Isı ile denatüre oluyor mu? Disülfit bağı var mı? Sürekli olarak dondur-çöz yapılmaya dayanıyor mu? Eğer bu özellikleri bilinmiyorsa dondur-çöz’e dayanmadığı, ısı ile denatüre olduğu kabul edilerek çalışılmalı.

35 Protein İzolasyonu Bakteriyel veya baculovirus ekspresyon sistemlerinde yüksek miktarda protein üretimi oldukça rahat uygulanabilirken aynı durum bu proteinlerin izolasyonu için geçerli değildir. Her proteinin kendine özgü bir profili/kişiliği vardır. Bu noktada tecrübe önemlidir. Varsa “bir bilene” danışmak önemli vakit kazandırır.

36 Kromatografi Jel filtrasyonu, ion-exchange ve afinite kromatografisi
Jel filtrasyonu: Bileşenleri molekül ebatlarına göre ayırır. Durağan faz porlu yapıdadır, yalnızca küçük molekülleri tutar. Sephadex, Sephacryl, Sepharose örnek materyellerdir. Ion-exchange: Bileşenleri yüklerine göre ayırır. Solid bir yüzeydeki yüklü gruplara proteinlerin (veya diğer materyellerin) bağlanmasını takiben daha yüksek iyonik güce sahip sulu bir tampon ile ilgilenilen proteinin elüsyonunu temel alır. Kolon materyeli anyonik, katyonik veya karışık olabilir. DEAE selüloz, amberlit, Dowex, CM-Sepharose örnek materyellerdir. Afinite kromatografisi: Bileşenleri doğal bağlanma bölgelerine ayrıştırır. Saflaştırılacak molekül özgün ve tersinir olarak solid bir yüzeye sabitlenmiş ligand adsorplanır. Oligo dT selüloz, biotin, heparin örnek materyellerdir.

37 Dializ Bir örnekteki tuz ve benzeri kalıntıları uzaklaştırmak için dialize başvurulur. Örnek porlu bir ince hortum (tüp) içine alınır. Porların çapı ancak bu porların çapından küçük olan moleküllerin dışarı çıkmasına izin verir. Dializ torbasındaki materyel bol miktardaki su veya tampon çözelti içine yerleştirilir. Böylelikle örnek içindeki kalıntıların dışarı çıkması ve örneğin temizlenmesi beklenir.

38 Hücre Parçalanması Fiziksel lizis
Homojenizatör: Bir nevi blender. Cam tanecikler eklenmediği durumda bakteri için uygun değildir. Ultrasonik prosesör (Sonikatör): Ses basıncı mikrokabarcıklar yalnızca hücre değil aynı zamanda DNA’yı da parçalar. Bakteri için cam tanecikler eklenmelidir. Freeze press: Dondurulmuş hücreler dar bir kanaldan geçirilmeye zorlanır. Bead mill homogenizer: Bakteri, spor veya mayalar bir cam veya zirkonyum içeren tüp içinde sıkıca vortekslenir.

39 Hücre Parçalanması Deterjan Birçok ökaryotik hücre için uygundur.
Anyonik deterjan SDS, cholic acid, caprylic acid, deoxycholic acid. Katyonik deterjan cetypyridiinum, bezalkonium chloride Zwitterionic deterjan CHAPS, phosphatidylcholine Non-iyonik deterjan digitonin, Tween-20, Triton X-100 Proteaz inhibitörleri Lizis sırasında proteinlerin degrade olmasını engellemek için mutlaka proteaz inhibitörü eklemek gerekir. Aprotinin, EDTA, Leupeptin, Pepstatin, PMSF, TLCK, TPCK

40 Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi
Hangi yöntem? Bradford, BCA. Labınızda hangi metod tercih ediliyor? Bir yöntemin sonucunu bir diğeri ile doğrudan kıyaslayamazsınız. Hangi metodu tercih etmeniz gerektiği ile ilgili olarak mesela saflaştırılmış proteinizin triptofan içerip içermediğini bilmeniz gerekir. Eğer içeriyorsa 280 nm okumasına güvenilmez. Eğer saflaştırılmış proteininizde mutlaka deterjan bulunması gerekiyorsa deterjana duyarlı olmayan bir metod seçmeniz gerekir. Bütün metodlar için konsantrasyonu bilinmeyen örneği bir standart eğri ile yürütmek gerekir. Saflaştırılmış herhangi bir protein referans standart olarak seçilebilir. BSA ve IgG en sık kullanılan referanslardır. Antikor ölçmüyorsanız BSA kullanın.

41 Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi
BCA Alkalin BCA (bicinchonic acid) çözeltisine eklenen bakır sülfat elma yeşili renkli bir kompleks oluşturur. Bu çözelti bir protein çözeltisine ilave edildiğinde Cu++ iyonları proteinin peptid bağı ile etkileşime geçerek Cu+ iyonlarına dönüşürken kompleksi maksimum absorbansı 562 nm olan mor renkli bir komplekse dönüştürür. Hızlı, duyarlı ve doğru bir testtir. Deterjan, organik solvent gibi ajanlardan etkilenir. Zamana bağlıdır, renk 24 saat içinde oluşur.

42 Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi
Bradford pH 1’in altında kırmızı kahverengi olan ancak proteine bağlanması ile bağlanan boyanın pKa’sında kaymaya neden olan Coomassie mavisi G-250’yi kullanır. Hızlı, duyarlı, doğru ve zamana bağlı olmayan bir testtir. %0.2’nin üzerinde bir deterjan konsantrasyonu testi etkiler.

43 Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi
280 nm Absorbans Aromatik amino asitler özellikle triptofan 280 nm civarında aşırı absorbans gösterir. Aromatik rezidu içeren bütün proteinlerin 280 nm’de tek bir extinction katsayısı vardır. Hız. Örnek parçalanmaz. Diğer metodlar kadar doğru sonuç vermez. Biruret Lowry (Folin-Ciocalteu)

44 Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi
Biuret Peptid bağlarını ölçer. 540 nm’de optik dansiteyi ölçer. Hızlıdır. Tuz bu testi Bradford’a göre daha az etkilediğinden protein separasyonunu takip etmek için başarılıdır. Lowry (Folin-Ciocalteu) BCA’ya benzer. 720 nm’de optik dansiteyi ölçer. Çok az materyele ihtiyaç duyar. Proteinin içinde tirozinin bulunmasına bağlıdır.

45 Örnek içinde deterjan bulunması
Deterjanlar protein izolasyon sürecinin bir parçasıdır. Protein seviyesini veya fonksiyonunu etkileyebilme riski taşır. Deterjan içeren bir protein örneğindeki protein miktarını belirleyebilmek için: Standart eğriye de aynı oranda deterjan eklemek. Eklenen deterjan lineer okumaları önemli oranda bozacaktır. Örneği seyreltip okumayı bu şekilde yapmak da bir yoldur ancak protein seviyesi düşük ise bu işe yaramaz. Deterjan ile uyumlu protein testleri kullanılabilr. Bazı firmaların bu tip testleri bulunmaktadır.

46 Örnek içinde deterjan bulunması
Eğer protein izole ediyorsanız deterjanı uzaklaştırmanız gerekir. Deterjanı uzaklaştırmak için seçeceğiniz yöntem deterjana, proteine ve tampon çözeltiye bağlıdır. Yöntemi belirlemeden önce iyi araştırıp bilenlere danışın. Yanlış bir ısı veya tuz konsantrasyonu protein örneğinizin bir anda kristal veya çamura dönüşmesine neden olabilir

47 Örnek içinde deterjan bulunması
İyonik deterjanlar Jel filtrasyonu G25 kolon 8M üre ekleyip iyon değişim kolonuna yükle. Protein 8 M üre içinde akar. Üreyi uzaklaştırmak için dializ et. Noniyonik deterjanlar G200 kolonunda jel filtrasyonu uygula Proteini afinite veya iyon değişim kolonuna yükle. Yoğun bir şekilde yıka ve elüe et. Amfoterik (Zwitterionic) deterjanlar Mümkünse seyrelt ve dializ et

48 Antikorlar Poliklonal: bir hayvan bir antijenin verilmesi ile oluşturulur. Heterojen bir karışımdır. Monoklonal: In vitro olarak hücre füzyonu yolu ile üretilir. Antikorların eldesi Ticari olarak satın alınabilir. Meslektaşınızdan alabilirsiniz. Kendiniz üretebilirsiniz. (Poliklonal antikor üretimi oldukça kolaydır ancak labınız veya bölümünüzde rutin olarak monoklonal antikor üretilmiyorsa bu işe bulaşmayın). Poliklonal antikorlar monoklonal antikorlar gibi sınırsız kaynak oluşturmazlar. Meslektaşınızdan poliklonal antikor istemeyi adet haline getirmeyin. Çok miktarda kullanacaksanız kendiniz için üretin. Antikorları kullanım alanları Hücre boyama: proteinlerin hücre içindeki dağılımı İmmünoassay: Bir antijenin fonksiyonu veya varlığı İmmünoblot: Western blot. Bir proteinin varlığı ve/veya miktarının membran üzerinde tespiti.

49 Antikorlar Saklama En iyi -20oC’de saklanır. Uygun sayıdaki kullanım miktarına göre hacimlere bölünüp saklanmalıdır. Dondur-çöz’den hoşlanmaz antikorlar. Çalışma konsantrasyonu 4oC’de 6 ay kadar saklanabilir. Son konsantrasyonu %0.02 olacak şekilde sodyum azit ilavesi bakteriyel kontaminasyonu engelleyecektir.

50 Antikorlar İpuçları Antikorun hangi hayvandan türevlendiğini bilmeniz gerekir. Zira bu bazı deneyler için gerekli olan ikincil antikoru doğru tayin edebilmenizi sağlayacaktır. Poliklonal antikorlar genellikle tavşan veya eşek; monoklonal antikorlar ise fare, sıçan veya hamster kaynaklıdır. Antikorunuzu kullanmadan önce hızlı bir spin edin bu birçok testte oluşabilecek yüksek geriplanı böylece ortadan kaldırmak mümkün olur.