4 - Metilumbelliferil Fosfat

... konulu sunumlar: "4 - Metilumbelliferil Fosfat"— Sunum transkripti:

1 4 - Metilumbelliferil Fosfat
TERMOFİLİK Geobacillus TF16 SUŞUNDAN SAFLAŞTIRILAN FİTAZIN KİTOSAN DESTEK MATERYALİNE İMMOBİLİZASYONU, İMMOBİLİZE ENZİMİN KARAKTERİZASYONU VE DOĞAL BİR BESİN KAYNAĞINDAKİ FİTAT PARÇALAMA ETKİNLİĞİNİN İNCELENMESİ Yakup ŞİRİN, Nagihan SAĞLAM ERTUNGA   Karadeniz Teknik Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya Bölümü, Trabzon ÖZET Bu çalışmada, özellikle gıda ve yem sektöründe kullanım potansiyeli olabilecek ve termofilik Geobacillus sp. TF16 suşundan saflaştırılan fitaz enzimi kitosana % 40 verimle kovalent olarak bağlanarak immobilize edilmiş ve immobilize enzim karakterize edilmiştir. İmmobilize enzimin serbest enzime kıyasla optimum pH ve sıcaklık değerleri sırası ile 4,0’ten 5,0’e ve 85 °C’den 95 °C’ye değişmiştir. Buna ilave olarak serbest enzime nazaran immobilize enzim geniş bir pH aralığında (pH 4,0-7,0) ve daha yüksek sıcaklık değerlerinde de ( °C) % 80’nin üzerinde aktivite göstermiştir. İmmobilize enzimin ısıl kararlılığı incelendiğinde 4 ve 95 ºC’de 24 saat sonunda aktivitesini %80 oranında, 35 ºC’de 24 saat sonunda ise %60 oranında korunduğu görülmüştür. İmmobilize enzimin kinetik verileri incelendiğinde Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2,38 mM ve 3401 U/mg olarak bulunmuştur. Serbest enzimin Vmax değerleri ile karşılaştırıldığında yaklaşık 10 katlık bir artış olduğu görülmüştür. Son olarak soya sütü fitatını hidroliz performansı çalışılarak hayvan yemi üretim proseslerine uygunluğu incelenmiştir. GİRİŞ Ticari fitazlar gıdaların işlenmesinde ve gıda/yem katkı maddesi olarak gıda sanayinde kullanılmaktadır. Fitat bitkilerde fosforun temel depo maddesidir ve özellikle tahıl, baklagil ve yağlı tohumlarda fazlaca bulunmaktadır. Fitat insanlar ve monogastrik hayvanlar tarafından sindirilemez. Bu yüzden yüksek fitat içeriğine sahip gıdalar anti-besinsel özellik kazanmaktadır. Bu gıdaların besinsel değeri fitaz enzimi ile muamele edilerek artırılabilmektedir.[1] Ortofosforik monoester fosfohidrolazlar (fosfatazlar) geniş bir fosfat monoester grubunun hidrolizini katalizler. Bu grubun bir alt grubu fitik asidi parçalayabilen fitazlardır. Fitaz, fitatın hidrolizini katalizleyerek, fitata bağlı organik fosforun açığa çıkmasını sağlar. Fitat parçalayıcı enzimler optimum pH’larına göre iki gruba ayrılabilirler. Optimum pH’sı 5,0 civarında olan asidik fitat parçalayıcı enzimler ve optimum pH’sı 8,0 civarında olan alkali fitat parçalayıcı enzimler. Fitaz enzimlerinin çoğu asidik enzim sınıfına girmektedir.[2] Ayrıca fitazlar fitat molekülünün hidrolizinin başladığı bölgeye göre de iki katagoride incelenebilirler. 3-fitaz (EC ) tercihen myo-inositol fosfat halkasının C3 pozisyonundaki Pi’yi serbestleştirirken, 6-fitaz (EC ) ise C6 pozisyonundaki Pi’yi serbestleştirir. Günümüzde farklı mikrobiyal fitazlar mevcut olmakla birlikte ticari olarak kullanılan üç fitaz enzimi; Aspergillus niger (3-fitaz) ve Peniophora lycii ve E. coli (6-fitazlar)’dir.[3][4] Fitaz önemli bir ticari enzim olmasına rağmen ülkemizde bu enzimle ilgili yeterince çalışma olmadığı görülmektedir. ÇALIŞMALAR ve BULGULAR Fitaz Enziminin Kitosana (Kovalent) Bağlanması Geobacillus sp.TF16 suşundan saflaştırılan fitaz enzimi, Kitosan matrikse kovalent etkileşimlerle immobilize edildi. Saf enzimin kitosan immobilizasyonu Bae (1999) yöntemine göre gerçekleştirildi.[5] 1g kitosan % 2,5 (v/v) glutaraldehit içeren 0,1 M HCl çözeltisinin 75 mL’si ile 2 saat 30 °C’de çalkalandı. Çözünen kitosan 10 mL 0,1 M NaOH ilavesi ile çöktürüldü. Çökelti filtrasyon ile toplandı ve saf su ile yıkanarak glutaraldehitin fazlası uzaklaştırıldı. Islak kitosan 1 mg saf fitaz enzim çözeltisi ile karıştırıldı. Elde edilen karışım magnetik karıştırıcıda 4 °C’de 1 saat yavaşça karıştırıldı. İlgili süre sonunda katı destek filtre kağıdından süzüldü. Bağlanmayan enzimlerin yüzeyden uzaklaştırılması için katı destek ard arda saf su ile yıkandı. Yıkama işlemine süzüntüde protein tespit edilmeyene kadar devam edildi. Yapılan protein tayini sonucunda, süzüntülerde toplam protein miktarı 0,603 mg olarak belirlendi. % Bağlanma verimi ise % 40 olarak hesaplandı. Substrat Özgünlüğünün Belirlenmesi Kitosana immobilize edilen fitaz enziminin substrat özgünlüğünü belirlemek amacı ile sodyum fitat, 4- metilumbelliferil fosfat, glukoz 6-fosfat, ADP ve ATP substratları kullanılarak aktivite tayinleri gerçekleştirildi. En yüksek aktivite sodyum fitat ve 3-metillumbelliferil fosfatta gözlendi. Tablo 1- İmmobilize Enzimin Substrat Özgünlüğü Optimum pH ve pH Kararlılığının İncelenmesi Kitosana immobilize edilen fitaz enziminin en iyi aktivite gösterdiği pH’yı belirlemek amacıyla tampon sistemi olarak 2,0-7,0 pH aralığında 50 mM Mcilvaine, pH 8,0 ve 9,0’da 50 mM Glisin-NaOH tamponları kullanıldı. Sonuçlar hesaplanarak pH-%bağıl aktivite grafiği çizildi. Kitosana immobilize edilen fitaz enzimin pH kararlılığını incelemek amacıyla immobilize enzim uygun oranlarda farklı tampon çözeltileri (pH 5,0 ve 7,0 sodyum asetat, 2,0 glisin-HCl tamponu) ile karıştırılarak farklı sıcaklıklarda (4, 35 ve 95 oC) inkübe edilmiştir. Bu karışımlardan hiç bekletilmeden alınan örneklerle yapılan aktivite testleri ile belirli aralıklarla alınan örneklere yapılan aktivite testleri kıyaslanarak % kalan aktiviteler hesaplandı. Şekil 1’de görüldüğü gibi immobilize enzimin en yüksek aktiviteyi pH 5,0’da göstermiştir. Şekil 2-3-4’te görüldüğü üzere kitosana immobilize fitaz enziminin oC’de farklı pH değerlerinde 12 saat sonunda aktivitesini büyük oranda (%60-70) korumuştur. Şekil 1- Kitosana immobilize edilen fitazının pH-%bağıl aktivite grafiği Şekil 2- Kitosana İmmobilize Fitazın 4 oC’de pH kararlılık grafiği Şekil 3- Kitosana İmmobilize Fitazın 35 oC’de pH kararlılık grafiği Şekil 4- Kitosana İmmobilize Fitazın 95 oC’de pH kararlılık grafiği Optimum Sıcaklık ve Isıl Kararlılık Kitosana immobilize edilen enzimin aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisini belirlemek amacıyla °C aralığında farklı sıcaklıklarda aktivite tayinleri gerçekleştirildi ve aktiviteler hesaplandı. Sıcaklık-% bağıl aktivite grafiği çizilerek fitaz enziminin en iyi aktivite gösterdiği sıcaklık belirlendi. Isıl kararlılığı belirlemek amacıyla kitosana immobilize edilen fitaz enzimi 4 °C, 35 °C ve 95 °C’lerde inkübe edilerek 2., 4., 24., ve 48. saat sonunda aktivite tayinleri belirlenen optimum şartlarda üç paralel olarak gerçekleştirildi. Kitosana immobilize edilen fitaz enziminin optimum sıcaklığı (Şekil 5) 95 °C olarak belirlenmiştir. Şekil 6’da görüldüğü gibi kitosana immobilize fitaz enzim 4, 35 ve 95 oC’de 24 saat sonunda aktivitesini yaklaşık olarak % 60’nin üzerinde koruduğu tespit edilmiştir. Şekil 5- Kitosana immobilize edilen fitazın sıcaklık-%bağıl aktivite grafiği Şekil 6- Kitosana İmmobilize edilen fitazın ısıl kararlılık grafiği Enzim Aktivitesi Üzerine Substrat Konsantrasyonun Etkisi Kitosana immobilize edilen fitaz enzimi aktivitesinin substrat konsantrasyonu ile değişimini incelemek amacıyla 0,08-6,67 mM aralığında değişen substrat konsantrasyonlarında reaksiyon karışımları hazırlandı. Aktivite tayinleri daha önce belirlenen optimum şartlarda ve üç paralel olacak şekilde gerçekleştirildi. Elde edilen aktivite değerleri grafiğe geçirilerek fitaz enzimine ait substrat doygunluk eğrisi elde edildi. Elde edilen veriler kullanılarak Lineweaver-Burk grafiği çizildi. Grafiklerden kinetik parametreler olan Vmaks ve Km değerleri hesaplandı. Kitosana immobilize edilen fitaz enzimi Michaelis-Menten kinetiğine uyum göstermektedir. Enzimin kinetik parametreleri olan Vmaks ve Km değerleri, çizilen Lineweaver-Burk grafiğinden sırasıyla 3401,361 U/mg protein ve 2,38 mM olarak belirlendi. Şekil 7-Kitosana İmmobilize edilen fitazın sodyum fitat substratı varlında çizilen Lineweaver-Burk grafiği Çeşitli İnhibitör ve Metal İyonlarının Etkisi İmmobilize enzimin aktivitesi üzerine metal iyonu etkisini incelenmek amacıyla Na+, K+, Li+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Hg2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+, Ni2+, Al3+ ve Fe3+ iyonları reaksiyon karışımında 1 mM, 5 mM ve 10 mM olacak şekilde aktivite tayinleri gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar metal iyonu içermeyen denemeden elde edilen sonuçla karşılaştırılarak metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine etkisi incelenmiştir. Aynı zamanda Etanol, Metanol, Aseton, 2-Propanol, SDS, Triton X100, Triton X114, Tween 20, PMSF ve EDTA gibi bazı kimyasalların da enzim aktivitesi üzerine etkisi incelenmiştir. İmmobilize enzim Cu2+ varlığında aktivite olurken diğer bütün metallerde inhibe olduğu görüldü. Ayrıca SDS de aktivitesi artan immobilize enzimimin TX-100 ve tween-20 de tamamiyle inhibe olduğu gözlendi. Şekil 8- Metallerin varlığında % kalan aktiviteler Şekil 9- Organik çözücüler ve deterjanlar varlığında % kalan aktiviteler İmmobilize Enzimlerin Tekrar Kullanılabilirliği ve Proteaz Varlığının Fitaz Aktivitesine Etkisi Proteazların varlığında enzim kararlılığını belirlemek için, kitosana immobilize fitaz enziminin aktivitesi optimum şartlar altında belirlendi. Daha sonra 0,1 mg/mL konsantrasyondaki immobilize enzim 0,1 mg/mL konsantrasyonda proteaz karışımı (Sigma-Aldrich. Protease Type Vlll: Bakterial from Bacillus licheniformis) ile 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) tamponunda inkübe edildi. İnkübasyon ortamından 30, 60 ve 90 dakikalarda örnekler alındı. Proteazlar varlığında 90 dakika sonrasında fitaz enzimi aktivitesinin %76’sını koruduğu belirlenmiştir. Kitosana immobilize edilen fitaz enziminin tekrar kullanılabilirliği ardı ardına 10 ölçüm alınarak belirlendi. İlk ölçüm değeri % 100 kabul edilerek sonuçlar değerlendirildi. İmmobilize enzimin optimum şartlarda 8 ölçüm sonunda aktivitelerinde ciddi bir değişiklik olmadığı belirlenmiştir. Şekil 10- Proteazların varlığında % kalan fitaz aktivitesi Şekil 11- Kitosana immobilize edilen fitaz enziminin tekrar kullanılabilirliği İmmobilize Fitazının Soya Sütü Fitatını Parçalama Etkinliğinin İncelenmesi Kitosana immobilize edilen fitaz enziminin soya sütü fitatını parçalama etkinliğini belirlemek için fitat standart grafiği oluşturuldu. Grafikten soya sütü fitatı konsantrasyonu 28,16 mM olarak hesaplandı. Soya sütü ile enzim optimum şartlar altında inkübe edildi. 30 dakikalık aralıklarla örnekler alınarak standart aktivite yöntemi yardımıyla fosfat yayini yapıldı mM aralığında K2HPO4 standartları ile serbest fosfat grafiği çizilerek 4 saatlik inkübasyon sonunda enzimin ürettiği serbest fosfat miktarı 41,91 mM olarak hesaplandı. 6 molekül serbest fosfatın 1 molekül fitata denk geldiği düşünülerek bulunan serbest fosfat konsantrasyonu 6’ya bölündü ve hidrolizlenen fitat miktarı 6,98 mM olduğu bulundu. 4 saat sonunda hidrolizlenen fitat miktarı toplam soya sütü fitatına oranlanarak Geobacillus sp TF16 fitazının hidrolizleme kapasitesi %24 olarak hesaplandı. SONUÇ Bu çalışmada kullanılan immobilize fitaz enzimi ile serbest enzim aktivite verimleri karşılaştırıldığında immobilize enzimin daha yüksek değerlere sahip olduğu görülmektedir. İmmobilize enzim ilk 12 saatlik sürede serbest enzime göre daha kararlı olduğu görülmektedir. İmmobilize enzimin Km değeri 2,38 mM olarak bulunurken, serbest enzimin Km değeri 1,31 mM olarak hesaplanmıştır. İmmobilize enziminin Km değerinin serbest enziminkinden daha büyük olması genellikle beklenen sonuçtur. Bunun yanında, enzimin Vmax değeri de immobilizasyon sonrası yaklaşık 5,5 kat artmıştır. Öte yandan optimum pH değeri 4,0’dan 5,0’a değişmiştir. Sıcaklık ise 85 °C’den 95 °C’ye yükselmiştir. TEŞEKKÜR Bu çalışma 214Z190 nolu proje kapsamında gerçekleştirilmekte olup TÜBİTAK tarafından desteklenmektedir. KAYNAKLAR [1] R.Zuo, J. Chang, , Q. Yin, , L. Chen, Q. Chen, X. Yang & H. Feng, Mic. research, 165(4), (2010), [2] M. Sümengen, S. Dinçer, A. Kaya, Turk J. Biol., 36, (2012), [3] M. Sümengen, S. Dinçer, A. Kaya, Food Biotechnology, 27, (2013), [4] P.H. Selle, ve V.Ravindran, Animal Feed Science and Technology, 135, (2007), 1–41. [5] Bae, H.D., Yanke, L.J., Cheng, K.J., Selinger, L.BJournal of Microbiological Methods 39. (1999). :17–22. Substrat % Bağıl aktivite Sodyum Fitat 100 4 - Metilumbelliferil Fosfat 74 Glukoz 6-Fosfat 48 ADP 37 ATP 44