Arasınav ders ve temaları. Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı 2015-2016, Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, 16.03.2016 Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji.

... konulu sunumlar: "Arasınav ders ve temaları. Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı 2015-2016, Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, 16.03.2016 Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji."— Sunum transkripti:

1 Arasınav ders ve temaları

2 Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı 2015-2016, Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, 16.03.2016 Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı akisn@trakya.edu.tr http://personel.trakya.edu.tr/akisn Mikrobiyoloji Tanı Laboratuvarında Vestern Blotlama ve Moleküler Testler

3 1 Vestern Blotlama (Western Blotting)

4 Vestern Blotlama Testinde Amaç ve Prosedür Bir katı faz seroloji yöntemidir. Tıbbi mikrobiyolojide genellikle hasta serumunda ELISA ile saptanan özgül antikor varlığını epitop düzeyinde doğrulamak için kullanılır (anti-HIV antikorun varlığını doğrulamak gibi..) Parmak genişliğinde kağıt gibi ince polimer tabakalar katı faz olarak kullanılır. Hücreden elde edilen ve her biri farklı epitop içeren antijenler tabakaya aralıklarla bağlanır ve üzerinde ELISA işlemi uygulanır. Her biri farklı epitop içeren antijenleri tabakaya aralıklarla dizmenin yolu antijen karışımını jel üzerinde elektroforezle boy sırasına dizmektir. Böylece büyükten küçüğe dizilen antijenler kolaylıkla jelden tabakaya aktarılabilir.

5 Antijenlerin Sıraya Dizilmesi ve Tabakaya Aktarılması Antijen karışımı çukura doldurulur Jel çukur Anotdan jele elektrik akımı uygulanır Antijenler akım boyunca büyükten küçüğe sırayla jele dizilir Sıralı antijenler jelden tabakaya nakledilir (üstüste koyarak) 1 2 3 4

6 2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

7 PZR Testinde Amaç Varlığı DNA’da (genom veya parçası) sorgulanmak istenen bir dizinin (gen, provirüs, mutasyon) aranması testlerinden biri PZR’dir. Aramanın esasını varsa DNA’daki ilgili dizinin gözle görülebilecek sayıya suni olarak çoğaltılabileceği beklentisi oluşturur. Test en fazla 1000 nükleotidlik kısmı saptayabildiğinden sorgulanmak istenen dizinin genellikle kısa bir parçası tüpte çoğaltılarak aranır. Önce çoğaltma yapılır, sonra tüpteki karışım içinde aranan boyutta parça var mı incelenir. Varsa, dizinin tamamının DNA’da var olduğu düşünülür.

8 PZR Testinde Prosedür 25-40 döngüden oluşan çoğaltma işleminin her döngüsü; –sorgulanan çift iplikli (çi) parçanın varsa her 3’ ucuna eşlenik tasarlanan primerlerin yapışmasıyla reaksiyon başlatılır. –Tüpteki polimeraz eşlenmiş primerleri gördüğünde eşleneği sentezleyerek ilk döngüyü tamamlar. Sayı, 2 uzun DNA’dan 4 uzun DNA’ya çıkar. –Reaksiyonun ikinci ve sonraki döngülerinin aynı biçimde tekrarlaması sağlanır. İlk parçasal çiDNA 3’ncü döngüde 4 adet olarak elde edilir. –25’inci döngüde parçasal çiDNA sayısı 33 milyon 550 bine çıkar. Böylece görülebilir hale gelir.

9 PZR için dizinin parçasını belirleme, primer bağlanması ve polimerazın eşlenek sentezlemesi DNA Çoğaltmak için seçilen parça Sorgulanmak istenen dizi Primer bağlanması Eşlenek sentezlenmesi 1’inci döngünün başlangıcı

10 Birinci döngü İkinci döngü... Üçüncü döngü Parçasal çiDNA’lar PZR’da döngüler devam

11 3 Ters transkriptaz PZR (RT PCR)

12 TT PZR Testinde Amaç ve Prosedür Varlığı hücrede sorgulanmak istenen RNA dizisinin (mRNA, rRNA, miRNA, lncRNA) hücre lizatında aranması testlerinden biri TT PZR’dir. Aramanın esasında ilk basamağı, varsa ilgili RNA’nın 3’ eşlenik primer ve ters transkriptaz enzimi yardımıyla tek iplikli (ti) kopyasal DNA’ya (cDNA) çevrilmesi oluşturur. Sonra, cDNA’nın PZR testi ile çiDNA’ya çevrilmesi, çoğaltılması ve görüntülenmesi yapılır.

13 TT PZR için mRNA’ya primer bağlanması, cDNA sentezlemesi ve PZR’ye geçilmesi Ters transkriptaz cDNA’nın serbestleşmesi ……PZR PZR devam … çiDNA

14 4 Gerçek zamanlı PZR (real time PCR)

15 GZ PZR Uygulamasında Amaç ve Prosedür GZ PZR, PZR veya TT PZR testi ile aranan DNA veya RNA dizisinin hücredeki miktarını belirlemek için uygulanır. Belirleme işlemi, sadece çiDNA ile karşılaştığında aktiflenerek renk yayan bir maddenin PZR reaksiyon tüpüne eklenmesi ile yapılır. Hücrede aranan diziden tüpte ne kadar çok varsa her PZR döngüsünde o kadar daha çok çiDNA gelişir ve renklenme aynı oranda artar. Döngüler boyunca renklenmedeki artışlar takip edilerek PZR’ye başlamadan önce tüpte kaç adet DNA veya RNA vardı hesaplanabilir.

16 GZ PZR uygulamasında yaygın kullanılan renk yayıcılardan biri SYBR yeşilidir ve çiDNA’ya bağlanarak renk yayar PZR döngüsü başlıyor DNA Isıtılan çiDNA’dan tiDNA’lar gelişiyor PZR döngüsü bitiyor Renklenme zayıf Renklenme iki katına artmış